不同保存液及放置时间对脐带源间充质干细胞存活率的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：干细胞制备完成后的放置时间与其存活率的关系是临床应用安全、有效的基础。
目的：观察不同保存液及不同保存时间对脐带源间充质干细胞存活率的影响，为干细胞有效期的确定提供重要依据。
方法：选用脐带源间充质干细胞制备干细胞制剂，分别采用生理盐水、培养基、培养基+生理盐水、生理盐水含表皮生长因子、培养基含低分子肝素钙悬浮保存。使用冷藏箱模拟细胞运输条件，分别在第0，6，12，18，24，30，36，42，48小时取样，进行细胞总数和细胞活率的检测。
结果与结论：各组在24 h内的细胞数量和细胞活率差别不大。24 h后，培养基组和培养基含低分子肝素钙组的细胞总数和细胞活率优于生理盐水含因子组、生理盐水组、培养基+生理盐水组。干细胞制剂制备完成后，冷藏运输24 h内细胞活率可达90%以上，保存液中的营养成分及合适的pH值，可使细胞活率显著提高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 保存时间, 脐带源间充质干细胞, 培养基, 低分子肝素钙, 细胞总数, 存活率, 保存液

Abstract:

BACKGROUND: The relationship between placing time after stem cell preparation and cell survival is the basis of safety and effectiveness for the clinical application.
OBJECTIVE: To observe effects of different preservation solutions and different storage time on survival rate of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, and to provide important evidence for identifying effectiveness of stem cells.
METHODS: Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were selected to prepare stem cell preparation, which was preserved in physiological saline, medium, medium+physiological saline, physiological saline containing epidermal growth factor, and medium containing low molecular heparin calcium suspension. Cold closet was selected for imitating cellular transport conditions. Samples were obtained at 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 and 48 hours. Total cell number and cell survival rate were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The difference in cell number and survival rate was not great within 24 hours in each group. Twenty-four hours later, total cell number and survival rate were better in the medium and medium containing low molecular heparin calcium groups than in the physiological saline containing epidermal growth factor, physiological saline, and medium+physiological saline groups. These findings suggest that after stem cell preparation, the cell survival rate can reach more than 90% within 24 hours under refrigerated transport conditions. Nutritional ingredients and proper pH value of preservation solution can make the cell survival rate increased greatly.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

设计：体外细胞学观察实验。
时间及地点：于2014年8至9月在四平市中心医院中心实验室完成。
材料：
脐带标本：脐带组织由四平市中心医院提供，无菌采集剖宫产产妇自愿捐献的脐带组织，乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒检测均阴性。实验经四平市中心医院伦理委员会批准。

脐带源间充质干细胞制备、保存、细胞活性检测所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
α-MEM培养基	HyClone公司，SH30265.01
血清	HyClone公司，SV30087.02
胰蛋白酶	Invitrogen公司
白蛋白	奥克特珐玛药剂生产有限公司，注册号：S20130030
生理盐水	巨能药业
无酚红培养基	Gibco公司
锥虫蓝	SIGMA公司，T8070
低分子肝素钙	葛兰素史克，注册号：H20080480
细胞培养瓶	JET公司，JET-TCF011600
移液管、离心管	Corning公司
细胞计数板	上海求精生化仪器有限公司
低温运输箱	广州赛能冷藏科技有限公司
离心机	Thermo Fisher，X3R
正置显微镜	Olympus 公司，CX31
倒置显微镜	Olympus 公司，CKX41
生物安全柜	北京东联哈尔仪器公司，class II TYPE A2

实验方法：
细胞保存液分组：总悬浮细胞的溶液体积为50 mL。①生理盐水组：生理盐水47.5 mL+白蛋白2.5 mL。②培养基组：无酚红培养基47.5 mL+白蛋白2.5 mL。③培养基+生理盐水组：无酚红培养基︰生理盐水=1︰1(共47.5 mL)+白蛋白2.5 mL。④生理盐水含因子组：生理盐水47.5 mL+白蛋白2.5 mL+20 μg/L表皮生长因子。⑤培养基含低分子肝素钙组：无酚红培养基47 mL+白蛋白2.5 mL+1支低分子肝素钙(0.4 mL)。
脐带源间充质干细胞制剂的制备：按照实验室建立的脐带间充质干细胞的培养方法，分离培养脐带源间充质干细胞[19]。取50瓶(T182)生长状态良好的第4代脐带源间充质干细胞C20140425，显微镜下分别观察并照相，各瓶细胞生长状态及融合率基本一致，融合率均达95%。每10瓶细胞为1组，制备成1支干细胞制剂，选择对干细胞培养技术熟练的两名技术人员操作，具体步骤为：将各瓶干细胞随机分组转移至生物安全柜内，弃去培养基，PBS洗涤，每瓶加入6 mL胰蛋白酶消化3 min，显微镜下观察细胞完全脱离瓶底，加入5倍胰酶量的PBS终止消化。收集细胞悬液于50 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤3次。按不同分组用相应保存液混匀悬浮细胞，70 μm滤膜过滤后盛装于50 mL无菌玻璃瓶中，取样计细胞总数及活率后封口。此时，记为第0小时。
保存取样：将制备的5瓶干细胞制剂保存于低温运输箱中，模拟运输条件，每小时轻轻晃动1次，使细胞悬起。每间隔6 h从低温运输箱中取出细胞瓶，混匀细胞，在生物安全柜中操作，取样1次，即第6，12，18，24，30，36，42，48小时取样，并交由2名具有细胞计数丰富经验的技术人员双盲进行细胞总数、细胞活率检测，每个样本平行检测3次，记录检测结果。最后一次检测结束后，将细胞重新接种于细胞瓶中，待细胞贴壁培养24 h后观察细胞形态及生长状态，照相。
细菌检测：取哥伦比亚血琼脂平板，将第0，6，12，18，24，30，36，42，48小时取出的样本接菌环取样涂板，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱培养24 h，观察有无菌落。
细胞总数和活率测定：将计数板及盖玻片用乙醇擦拭干净，取样后立即进行检测，手指轻轻弹匀EP管中的细胞，微量取样枪混合取样，将细胞悬液与锥虫蓝染液1︰1体积混合，室温下染30 s，再混合取样冲池^[3]。
按公式计算出细胞总数：细胞数(个)=(四个大格的总数/4)×10 000×稀释倍数×细胞悬液体积；细胞活率(%)=未染色的细胞数/细胞总数×100%。
判断标准：死亡的细胞着浅蓝色或蓝色并膨大，无光泽。活细胞不着色并保持正常形态，有光泽。
每次打开冷藏箱取样，观察温度显示并记录。
主要观察指标：细胞数量、细胞存活率、有无菌落生长、温度。

讨论

目前，国际上已有300多项干细胞的临床试验研究已获批准进行。脐带源间充质干细胞因其具有多向分化潜能、低免疫原性、无致瘤性等诸多优势在国内研究和应用的比较早而且最广泛^[20-26]。大多数实验室均可培养出脐带源间充质干细胞，但细胞的质量却差别较大。各研究和应用单位都是参照国家的指导原则再建立自己的质量标准^[27-28]，因此在临床试验研究中的质控标准有所不同。临床应用前细胞的数量和活率对治疗的安全性和有效性至关重要。目前，临床试验输注干细胞常用生理盐水悬浮输注，生理盐水的pH值为5.5左右，偏酸性，而且其中没有任何营养成分，干细胞悬浮在其中长期运输会影响细胞活率，因此在细胞运输液中添加营养及保护成分来改变干细胞的运输环境，对比不同运输液对干细胞数量及活率的影响。实验选择无酚红培养基是考虑到其没有颜色便于临床应用。根据多年实验经验，如果细胞直接悬浮于生理盐水中会发生聚集，造成细胞死亡从而减少有效细胞数量并且在临床输注时也会堵塞输血器及微血管。白蛋白具有维持胶体渗透压和结合离子的能力，防止细胞聚集的作用。人血白蛋白是临床常用药物，所以添加到干细胞制剂中不会影响使用安全。
实验结果显示，生理盐水组采用单纯盐水加白蛋白保存，随着放置时间的延长，细胞数量和活率都明显下降，尤其是在24 h后，细胞数量由最初的7.24×10⁷降至2.93×10⁷，细胞活率由刚制备完成时的98.20%降至45.63%。而生理盐水含因子组在生理盐水组的基础上添加了表皮生长因子，并没有明显改变，说明细胞因子对悬浮状态下的间充质干细胞无明显促进作用。培养基组用无酚红培养基来悬浮细胞，使细胞在放置过程中有了营养成分，在细胞数量和活率上都好于生理盐水组和生理盐水含因子组，尤其是24 h后，两个指标下降均不明显。培养基含低分子肝素钙组是在培养基组上增加肝素钙，肝素钙也是临床常用药物，起到抗凝的作用，实验添加此种药物观察其能否增加对细胞的保护作用，结果表明未明显起到保护作用，与培养基组相似。而培养基+生理盐水组是盐水和培养基等比混合，对细胞的保护作用介于单纯使用生理盐水和培养基之间。
实验在干细胞放置48 h后，重新接种到培养瓶中，结果培养基组和培养基含低分子肝素钙组细胞贴壁约70%，而生理盐水组则有5%贴壁。总体结果说明，脐带间充质干细胞无论用何种保护液运输，在24 h内细胞数量和活率无明显差别，但24 h后，悬浮液中有无营养成分对细胞数量和活率有一定的影响。重新接种的结果表明，细胞放置48 h后细胞计数活率虽然不低，但贴壁增殖能力下降。同时，实验还监测运输温度，模拟了实际运输的环境，提示温度的升高可能也是造成细胞死亡的原因之一。以上实验结果为干细胞应用研究中的运输环节提供了基础依据。

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