CD133脐血干细胞对妊娠期糖尿病的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：脐血中含有大量的造血干细胞、丰富的间充质干细胞，与外周血及骨髓干细胞相比，新生儿脐血干细胞的异体排斥反应小，免疫原性低。
目的：观察CD133脐血干细胞植入治疗小鼠妊娠期糖尿病的可行性，为临床妊娠期糖尿病的治疗提供新的途径。
方法：采用高糖高脂喂养方法对孕鼠进行妊娠期糖尿病造模，流式细胞分选技术对脐血干细胞进行分离筛选。将筛选出的CD133脐血干细胞通过尾静脉植入妊娠期糖尿病小鼠体内，移植7 d后，测定小鼠空腹血糖、空腹胰岛素、总胆固醇和三酰甘油水平，采用苏木精-伊红染色观察小鼠胰腺组织的损伤和修复情况，采用胰岛素抵抗稳态模型分析小鼠胰岛素抵抗指数和胰岛功能。
结果与结论：采用流式细胞分选技术可以从脐血单核细胞中分选出CD133脐血干细胞，分选纯度可达到(90.24±2.56)%；尾静脉移植脐血干细胞7 d后，妊娠期糖尿病孕鼠总胆固醇、三酰甘油水平、空腹血糖和空腹胰岛素水平均明显下降(P < 0.05)，胰岛素抵抗指数下降，胰岛功能改善(P < 0.05)，孕鼠胰腺组织萎缩情况逆转，炎性浸润减少。结果表明脐血干细胞移植可以使妊娠期糖尿病病情得到改善，可能与其修复胰腺损伤、降低胰岛素抵抗指数、改善胰岛功能有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 妊娠期糖尿病, CD133脐血干细胞, 流式细胞分选技术, 胰岛素稳态模型, 胰岛素, 空腹血糖, 血脂

Abstract:

BACKGROUND: Human umbilical cord blood contains a large number of hemopoietic stem cells and mesenchymal stem cells. Neonate umbilical cord blood-derived stem cells show milder immunological rejection and lower immunogenicity than peripheral blood- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility of umbilical cord blood-derived CD133 cells for treatment of gestational diabetes, so as to provide novel methods for clinical treatment of gestational diabetes.
METHODS: Mouse models of gestational diabetes were established by high-fat and high-sugar diet feeding. Umbilical cord blood-derived CD133 cells were sorted by flow cytometry sorting technique and then transplanted into mouse models of gestational diabetes via the tail vein. At 7 days after cell transplantation, serum levels of fasting blood glucose, fasting insulin, total cholesterol and triacylglycerol were measured and mouse pancreatic tissue injury and repair was observed by hematoxylin-esoin staining. Mouse insulin resistance index and pancreatic islet function were analyzed using the homeostatic model assessment.
RESULTS AND CONCLUSION: Umbilical cord blood-derived CD133 cells could be isolated from umbilical cord blood monocytes using flow cytometry sorting technique, with cell purity of (90.24±2.56)%. At 7 days after cell transplantation, serum levels of fasting blood glucose, fasting insulin, total cholesterol and triacylglycerol were
significantly decreased, insulin resistance index was significantly decreased, and pancreatic islet function was significantly improved in mouse models of gestational diabetes (all P < 0.05). In addition, atrophy of pancreatic tissue and infiltration of inflammatory cells were reduced. These results show that umbilical cord blood-derived CD133 cell transplantation can improve the disease condition of gestational diabetes by repairing injured pancreatic tissue, decreasing insulin resistance index and improving pancreatic islet function.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cord Blood Stem Cell Transplantation, Diabetes, Gestational, Islets of Langerhans, Blood Glucose, Insulin

中图分类号:

R394.2

宁力，袁雨，谭彬. CD133脐血干细胞对妊娠期糖尿病的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(23): 3658-3663.

Ning Li, Yuan Yu, Tan Bin. Human umbilical cord blood-derived CD133 cells for treatment of gestational diabetes [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(23): 3658-3663.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验前纳入雌鼠45只，有5只未受孕，将40只孕鼠随机分为正常对照组和高糖高脂饲养组各20只，其中高糖高脂饲养组有5只妊娠期糖尿病造模不成功，最终进入结果分析正常对照组20只，高糖高脂饲养组15只。

2.2 不同饲料喂养的孕鼠空腹血糖对妊娠0，9，18 d的孕鼠进行空腹血糖测量，发现与正常饲料喂养的孕鼠比较，高糖高脂喂养的孕鼠在9，18 d时空腹血糖水平明显增加，其中15只孕鼠在妊娠第9天时空腹血糖为(5.56±0.14) mmol/L，妊娠第18天时空腹血糖为(5.84±0.37) mmol/L (P < 0.05)，说明有15只孕鼠妊娠期糖尿病模型造模成功，见表1。

2.3 不同饲料喂养孕鼠体质量的变化对妊娠0，9，18 d的孕鼠进行体质量称量，发现与正常饲料喂养的孕鼠比较，高糖高脂喂养的妊娠期糖尿病孕鼠在9，18 d时体质量明显增加(P < 0.05)，见表2。

2.4 脐血干细胞的提取分离及培养流式细胞分选技术显示，从脐血中分离得到的单核细胞平均数量为(1.56± 0.47)×10¹⁰L^-1，经CD133磁珠分选得到的CD133富集细胞数量为(1.68±0.21)×10⁸ L^-1，新鲜脐血中CD133富集细胞占总单核细胞数的(1.08±0.33)%。经流式细胞技术鉴定发现所得CD133富集细胞纯度达到(90.24±2.56)%(图1)。对分选出的脐血干细胞进行培养，刚分离的细胞呈圆形，分离5 d后，贴壁生长，呈梭形，分离10 d的细胞长满培养瓶，细胞间间隙变小(图2)。

2.5 尾静脉注射移植脐血干细胞7 d后，孕鼠空腹血糖、空腹胰岛素、总胆固醇、三酰甘油水平的变化尾静脉注射移植脐血干细胞7 d后，与妊娠期糖尿病组孕鼠相比，脐血干细胞移植组的孕鼠空腹血糖水平、空腹胰岛素水平均明显下降(P < 0.05)，且血清中总胆固醇和三酰甘油水平也明显下降(P < 0.05)，见表3。

2.6 苏木精-伊红染色观察脐血干细胞移植组孕鼠胰腺组织的损伤和修复情况与正常对照组相比，妊娠期糖尿病孕鼠的胰腺组织明显萎缩，胰岛细胞发生空泡样病变，且炎性浸润增加，而移植了脐血干细胞组的孕鼠胰腺组织萎缩情况发生逆转，空泡变小，炎性浸润减轻(图3)。

2.7 脐血干细胞移植组和妊娠期糖尿病组孕鼠胰岛素抵抗稳态模型的分析对胰岛素抵抗稳态模型分析可知，与妊娠期糖尿病组相比，脐血干细胞移植组胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)降低，胰岛细胞功能(HOMA-β)改善(P < 0.05)，见表4。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2014年1月至2015年1月在重庆医科大学附属医院干细胞实验室完成。
材料：
实验动物：C57BL/6J小鼠60只，其中雄鼠15只，雌鼠45只，8周龄，体质量18-25 g，由北京富众科技发展有限公司提供。以雄鼠雌鼠比例1∶3将小鼠合笼交配，饲养于SPF清洁级实验室内，室内温度22-26 ℃，相对湿度40%-70%，自由进水进食。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

CD133脐血干细胞治疗妊娠期糖尿病实验所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	厂家
正常饲料、高糖高脂饲料	北京惠特比生物科技有限生物公司
血糖仪试纸	北京新兴华创科技有限公司
Histopaque-1077、FcR阻断剂、磁珠分选仪、缓冲液	德国Milienyibiotech
CD133荧光抗体	Cell signaling technology
胰岛素检测ELISA试剂盒	武汉博士德生物有限公司
全自动生化分析仪	美国Beckman
DMEM/F12、RMPI-1640、胎牛血清、青霉素、链霉素	武汉博士德生物有限公司
苏木精-伊红试剂盒	北京索莱宝科技有限公司

实验方法：
实验动物分组与造模：小鼠合笼交配后，每日清晨检查雌鼠阴道栓，发现有阴道栓的记为怀孕第0天，将孕鼠分笼单独饲养，统计孕鼠数量和怀孕天数。
将40只孕鼠随机分为2组，正常对照组和高糖高脂饲养组各20只。正常对照组给予普通饲料喂养，高糖高脂组给予高糖高脂饲料喂养(猪油20 g，鸡蛋黄15 g，白糖10 g加热溶解后，与普通饲料混合均匀)，自由进水进食，两组分别于怀孕0，9，18 d称体质量并检测空腹血糖(测定前 10 h禁食)，空腹血糖> 5.1 mmol/L视为妊娠期糖尿病造模成功^[13]。
将妊娠期糖尿病造模成功小鼠15只随机分为妊娠期糖尿病组7只和妊娠期糖尿病+脐血干细胞组8只。
孕鼠体质量和空腹血糖的检测：检测前10 h孕鼠禁食，次日清晨进行鼠尾取血，采用血糖仪试纸检测各组孕鼠空腹血糖含量，采用电子称量器记录孕鼠体质量。
脐血干细胞的分离和培养：
标本采集：采集新生的足月健康婴儿脐血标本15份，60 mL/份，于采集脐血6 h内完成脐血干细胞的提取分离，标本提取经医学伦理会讨论通过，并经产妇(或家属)书面同意用于科学研究。
采用密度梯度离心和红细胞裂解法提取出单核细胞：每管加入15 mL脐血，加入15 mL PBS进行稀释，缓慢加入Histopaque-1077 14 mL，室温下2 000 r/min离心30 min，上清液为已分离的血清，于-20 ℃保存待用。血沉层即为已分离的单核细胞，取离心管，加入30 mL已分离的单核细胞，加入20 mL RMPI-1640培养基，混匀，于室温下2 000 r/min离心5 min；移去上清液后，再次用40 mL PBS悬浮细胞，于室温下2 000 r/min离心5 min；用20 mL PBS再次悬浮细胞后，进行单核细胞的计数^[14]。
流式细胞技术分选脐血干细胞：取已分离的单核细胞，加入200 μL缓冲液，100 μL FcR阻断剂，100 μL CD133磁珠抗体，于4 ℃冰箱内孵育30 min；加入荧光抗体孵育10 min，加入PBS洗细胞，1 000 r/min离心10 min，移去上清，加入500 μL PBS使细胞悬浮，在磁珠上加入500 μL细胞悬浮液，PBS冲洗磁珠4次，取下磁珠，用活塞快速推出黏附于磁珠上的CD133细胞，PBS重悬，进行流式细胞分选与纯度分析^[15]。
脐血干细胞的生长情况：将上述分离得到的脐血干细胞置于DMEM/F12培养基中培养，加入体积分数为20%胎牛血清，青霉素、链霉素混合物100 μL，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内培养，于倒置显微镜下观察脐血干细胞生长情况。
脐血干细胞的移植：将脐血干细胞以2×10¹¹ L^-1细胞浓度重悬于150 μL无菌磷酸盐缓冲生理盐水中，在妊娠期糖尿病造模成功后，通过尾静脉一次性注射移植入妊娠期糖尿病+脐血干细胞组孕鼠体内。
移植脐血干细胞7 d后空腹胰岛素、空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油的测定：于移植脐血干细胞7 d后，处死小鼠(处死前10 h禁食)，摘眼球取血，采用血糖仪试纸检测空腹血糖；眼眦取血1 mL，装于有肝素抗凝的离心管中，混匀，离心(5 000 r/min，10 min)，收集上层血清，用ELISA检测空腹胰岛素水平；采用Beckman全自动生化分析仪检测总胆固醇、三酰甘油水平。
ELISA检测空腹胰岛素水平：不同浓度的标准品各 0.1 mL依次加入一排7孔中，加入稀释的待检测样品0.1 mL，置于37 ℃孵育90 min，甩去酶标板中的液体。将准备好的抗体工作液按每孔0.1 mL依次加入，置于37 ℃孵育 60 min，用PBS洗涤3次，每次浸泡1 min左右；将准备好的ABC工作液按每孔0.1 mL依次加入，置于37 ℃孵育30 min，用PBS洗涤5次，每次浸泡1 min左右；按每孔90 μL依次加入TMB显色液，置于37 ℃避光反应15-20 min；按每孔100 μL依次加入TMB终止液，此时蓝色立刻转为黄色，用酶标仪在450 nm处测定吸光度^[16]。
苏木精-伊红染色观察小鼠胰腺组织损伤和修复情况：取小鼠胰腺组织样本做冰冻切片，切片后在室温下干燥 10 min，于37 ℃烘箱烤片90 min，将切片放入苏木精中浸泡3 min，然后用自来水冲洗1 min，用1%盐酸乙醇分化30 s，自来水冲洗2 min，镜下观察是否着色；1%十二水磷酸氢二钠溶液返蓝1 s，自来水冲洗2 min，伊红着色30 s，然后浸入体积分数为80%无水乙醇2 min，体积分数为95%无水乙醇Ⅰ中2 min，体积分数为95%无水乙醇Ⅱ中2 min，体积分数为100%无水乙醇Ⅰ中2 min，体积分数为100%无水乙醇Ⅱ中2 min，最后浸入二甲苯中4 min，稍吹干后滴加中性树胶封固，于镜下观察^[17]。
胰岛素抵抗稳态模型分析：胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=空腹胰岛素×空腹血糖/22.5；胰岛β细胞功能(HOMA-β%)=20×空腹胰岛素/(空腹血糖-3.5)。
主要观察指标：①孕鼠空腹血糖、空腹胰岛素、总胆固醇、三酰甘油水平。②孕鼠胰岛损伤修复情况。③孕鼠胰岛素抵抗指数和胰岛β细胞功能。
统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件分析，研究数据符合正态分布，以x±s表示，计量资料采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

患有妊娠期糖尿病的孕妇抵抗力明显下降，容易出现合并感染，发生流产、早产、死胎的概率明显高于健康孕妇，出现羊水过多的概率为10%-30%，且孕妇多伴有血管壁增厚和宫腔狭窄的情况^[18-20]。妊娠期糖尿病的孕妇容易出现酮症，若不及时纠正会发展为糖尿病酮症酸中毒，对母体和胎儿都会产生致命的危害^[21-23]。
脐血中含有大量的造血干细胞、丰富的间充质干细胞，与人骨髓中的数量相当，且脐血干细胞更为原始，具有更强的分化能力，不仅支持造血系统，还可向中胚层和外胚层来源的组织分化^[24-25]。长期以来，一直存在脐血干细胞移植、自体骨髓干细胞移植及外周血干细胞移植孰优孰劣的争论，随着对脐血来源干细胞研究的不断深入，现阶段脐血干细胞已广泛应用到临床，有研究表明，脐血干细胞移植治疗白血病、遗传性血液病、严重免疫缺陷性疾病、放射损伤等疾病的技术已比较成熟。妊娠期糖尿病会使胰腺β细胞受损害，脐血干细胞移植可能会逆转胰腺细胞的损害，从而起到治疗妊娠糖尿病的作用[26-30]。
研究结果显示，尾静脉注射移植脐血干细胞7 d后，孕鼠空腹血糖水平、空腹胰岛素水平均明显下降(P < 0.05)，且血清中总胆固醇和三酰甘油水平也明显下降(P < 0.05)；与正常对照组相比，妊娠期糖尿病孕鼠的胰腺组织明显萎缩，胰岛细胞发生空泡样病变，且炎性浸润增加，而脐血干细胞组孕鼠胰腺组织萎缩情况发生逆转，空泡变小，炎性浸润减轻；与妊娠期糖尿病组相比，脐血干细胞移植组胰岛素抵抗指数降低，胰岛细胞功能改善(P < 0.05)。以上研究结果说明，尾静脉注射移植脐血干细胞后，能逆转胰腺β细胞的损害，这可能是脐血干细胞打破了原先的免疫系统网络，使得免疫细胞、免疫调节因子、补体、抗体等发生改变，并在体内分化为胰岛细胞从而促进损伤的细胞再生，而另一方面，可以改善孕鼠血脂水平，缓解胰岛素抵抗的症状。
脐血干细胞移植可以使小鼠妊娠期糖尿病得到改善，这为临床妊娠期糖尿病的治疗提供了新的思路，脐血干细胞对于人妊娠期糖尿病的治疗还有待于更安全、科学的方法，这也是未来研究的重点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程