2.1   酰化胶原蛋白制备方法   
2.1.1   利用琥珀酸酐制备酰化胶原蛋白   琥珀酸酐又称丁二酸酐，是一种有机化合物，分子式C4H4O3，化学结构式如图3。




酰化胶原蛋白一般是由天然胶原蛋白与酸酐反应制得，使用最多的是琥珀酸酐。琥珀酸酐是一种重要的有机合成中间体，可以用于合成药物、染料、香料等化合物。此外，琥珀酸酐还可以作为酰化剂，将它与一些含有活泼氢的化合物反应可以得到相应的酰化产物。同时在化学反应中，琥珀酸酐常用作酯化剂、酰化剂、烯醇化剂和脱水剂等。胶原蛋白可与琥珀酸酐发生酰基化反应，反应机制见图4。



胶原蛋白侧链的ε-氨基会使得琥珀酸酐开环，与其生成酰胺键，另一端变成羧基，结果显示胶原蛋白不仅引入琥珀酸酐亲水基团，同时引入长碳链亲油基团，使胶原蛋白成为具有双极性基团的高分子表面活性剂，使得胶原蛋白的水溶性有明显提高。然而，这类反应存在两大技术难点：琥珀酸酐在过高或过低的pH环境下水溶性差，为了让胶原蛋白与琥珀酸酐顺利反应，一般反应体系中会使用有机溶剂如乙醇、二甲基亚砜等；反应过程产生的羧酸会导致反应体系的pH值下降，然而酰化反应最佳pH值在9-10，否则琥珀酸酐与胶原蛋白的反应速率降低，产率也相应地降低。为了解决该问题，改性反应进行的同时需要一直调节pH值，WANG等[28]将冻干胶原蛋白溶解在0.5 mol/L乙酸，得到2 mg/mL的胶原蛋白溶液，将该溶液于磷酸盐缓冲溶液(pH=9.0)在4 ℃透析3 d，琥珀酸酐以不同摩尔比加入胶原蛋白溶液并与胶原蛋白的氨基反应，反应体系在15 ℃下搅拌4 h，以完成胶原蛋白的琥珀酰化；酰化后溶液在4 ℃下与磷酸盐缓冲液(pH=7.4)或去离子水透析3 d，然后冷冻干燥保存。张军涛等[29-30]也利用酰化反应来实现天然胶原的N端精准接枝改性，将提取胶原后加入氨基保护试剂如丁二酸酐、2，3-二甲基马来酸酐等[31]，得到侧链保护的酰化胶原蛋白，进一步对侧链保护的酰化胶原蛋白进行N端接枝，这一研究拓展了酰化胶原蛋白的应用领域。虽然琥珀酸酐的引入能使天然胶原蛋白的等电点降至3.5以下，但是该方法制备的琥珀酰化胶原蛋白热稳定性较差，琥珀酰化胶原蛋白变性温度是34 ℃，低于正常天然胶原蛋白的变性温度(38 ℃)，不利于三螺旋结构的稳定。作者所在课题组利用新的缓冲体系制备酰化胶原蛋白，制备过程简洁稳定，pH值相对稳定；将酰化胶原蛋白冻干溶解在细胞培养基中，不仅可以促进成纤维细胞增殖，还可以使成纤维细胞迁移。由此可见，酰化胶原蛋白广泛参与细胞增殖与细胞迁移的过程，基于胶原蛋白的生物材料在组织修复和细胞增殖中扮演着重要角色。酰化胶原蛋白在保留胶原蛋白三螺旋结构的同时，还增加水溶性，让其使用浓度相比胶原蛋白增加了不少，扩大了胶原蛋白的应用范围。
此外，研究人员在天然胶原蛋白分子的自由氨基上引入了疏水性的月桂酰基和亲水性的琥珀酸基[32]，反应机制如图5所示[33]：将天然胶原蛋白海绵溶于二甲基亚砜，然后在反应体系中加入适量月桂酰氯，在20 ℃下搅拌约24 h，中间产物用醋酸透析3 d；将含有琥珀酸酐的二甲基亚砜溶液加入中间产物溶液中搅拌约4 h，最后用去离子水对酰化胶原蛋白进行透析3 d。纯化的酰化胶原蛋白溶液在-50 ℃下冷冻干燥2 d，在4 ℃下保存直至使用。研究结果表明，通过双改性方法获得的酰化胶原蛋白不仅具有良好的水溶性和表面活性，而且具有更强的热稳定性，更加适合于促进疏水药物的分散和缓释。



2.1.2   利用降冰片烯二酸酐制备酰化胶原蛋白   降冰片烯二酸酐，降莰烯的桥环烃，是一种白色固体，有刺激性酸味，化学式为C7H10，该分子由环己烯环和亚甲基桥(C-3和C-6之间)组成。降冰片烯进行酸催化水合反应，与水形成降冰片。降冰片烯二酸酐常用于过渡金属催化去影响亲电子过渡金属的迁移。相较于琥珀酸酐，降冰片烯二酸酐的优势在于：它与胶原蛋白反应后不仅可以提供在中性溶液中的良好溶解性，并且可以通过硫醇-烯化学快速光聚合成共价交联的水凝胶。GUO等[34]利用降冰片烯二酸酐与胶原蛋白反应产生额外羧基，从而显著改善胶原蛋白在中性缓冲液中的溶解度以及与其他聚合物的混溶性。利用降冰片烯二酸酐制备酰化胶原蛋白的反应机制如图6，胶原蛋白的赖氨酸ε-氨基与降冰片烯二酸酐反应，它使混合生物墨水能够对多种刺激作出反应，从而在混合水凝胶中形成连续交联的中性可溶性胶原蛋白网络。具体改性过程为：在搅拌下，将溶于丙酮(胶原蛋白溶液的1/20体积)的降冰片烯二酸酐(1，3和6 mg/mg的胶原蛋白)逐滴加入胶原蛋白溶液中，在加入降冰片烯二酸酐期间让反应体系的pH值保持在9.0；在4 ℃和无菌环境下搅拌2 h，在4 ℃下将混合物置于水中使用8 000-14 000 Da的透析管透析14 d，溶液被冻干成白色多孔泡沫，并储存在4 ℃。根据对中性可溶性胶原蛋白的一系列表征结果分析，中性可溶性胶原蛋白在pH值为7.0时的电荷变负值，而胶原蛋白的电荷则为0，结果显示酰化增加了胶原蛋白在中性溶液的溶解度。同时中性可溶性胶原蛋白仅在pH=5时表现出低溶解度，而胶原蛋白在3-5的酸性pH值范围内溶解度大，结果表明，可溶性胶原蛋白可溶于中性粒子溶液。



2.1.3   利用马来酸酐及柠檬酸酐制备酰化胶原蛋白   马来酸酐，简称顺酐，含有共轭马来酰基，一个乙烯基相连2个羰基，化学性质非常活泼，常用于接枝改性。柠檬酸酐是由柠檬酸2个羧基脱水形成，具有吸水性和酰化能力。混合酸酐的使用可以使反应更加快速和稳定。PAMFIL等[31]利用2，3-二甲基马来酸酐或柠檬酸酐反应合成带有乙烯基的多孔酰化胶原蛋白，其反应机制：胶原蛋白的侧链ε-氨基与2-甲基马来酸酐或N，N-二甲基乙酰胺发生开环反应，从而使开环的2-甲基马来酸酐或N，N-二甲基乙酰胺连接上胶原蛋白。胶原蛋白溶液是以质量分数1%的氢氧化钠溶液制备的，反应混合物pH值保持在9.0时，几乎所有存在于胶原蛋白分子上的赖氨酸ε-氨基都从质子化的形式中解放出来，且能够于改性剂反应。溶解在二甲基亚砜中的酸酐在室温下连续搅拌24 h后，滴加到反应瓶中的胶原蛋白溶液上(胶原蛋白∶酸酐质量比为1∶3或1∶5)，加入氢氧化钠溶液保持pH值不变；用去离子水透析3 d以去除未反应的化合物，净化所得产品。经过2-甲基马来酸酐或N，N-二甲基乙酰胺修饰的胶原蛋白特性黏度和固有黏度显著增加，与未修饰的胶原蛋白相比，修饰的胶原蛋白在溶液中的黏度和分子质量增加，表明胶原蛋白大分子的形状和尺寸在修饰后发生了变化。酸酐化学改性后的胶原蛋白在固态下具有良好的热稳定性，且在酸性介质中具有增强的溶解度和高反应性。
2.1.4   利用双官能团改性剂制备酰化胶原蛋白   研究表明，酰化胶原蛋白一般是由天然胶原蛋白与酸酐反应制得，最常用的酸酐是琥珀酸酐，但这种改性是有缺陷的，琥珀酰化胶原蛋白变性温度是34 ℃，低于正常的天然胶原的变形温度(38 ℃)。天然胶原蛋白本身热稳定性较差，在37-40 ℃以上会变性，由于酰化修饰导致胶原蛋白的三螺旋构象不稳定性加剧，导致热稳定性下降，所以需要通过不同途径去加强酰化胶原蛋白的热稳定性。
ZHANG等[35]设计了一种新型的双官能团改性剂γ-聚乙醇酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，将胶原蛋白溶解于稀盐酸酸化的水中，用氢氧化钠溶液调节pH值至9.0，加入γ-聚乙醇酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，在添加过程中，加入氢氧化钠溶液使pH值保持在9.0，反应混合物在室温搅拌30 min，最后用去离子水透析3 d，将生成的溶液在-50 ℃下冷冻干燥2 d，在4 ℃下储存直至使用。同时对改性后的胶原蛋白进行流变学行为的研究，结果表明改性胶原蛋白溶液是假塑性流体，并且改性胶原蛋白溶液的热稳定性有所提高[36]。此外，细胞实验证实改性胶原蛋白表现出良好的细胞相容性。
YANG等[37]也设计了以聚丙烯酸和N-羟基琥珀酰亚胺为原料合成的一种新型双功能改性剂，改性过程具体为：将冻干后的胶原蛋白溶解于稀盐酸溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH值至9.0。将聚丙烯酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于二甲基亚砜中，滴加到胶原蛋白溶液中，搅拌(聚丙烯酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯与胶原蛋白的质量比为1/2)，在反应过程中加入氢氧化钠溶液，使胶原蛋白溶液的pH值保持在9.0；24 h后，将粗制的改性胶原蛋白在去离子水中透析72 h，冷冻干燥，保存至使用。对改性胶原蛋白进行表征且结果显示：在相同的pH值下，当聚丙烯酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯的酯化程度增加时，电动势会降低。根据曲线，原生胶原蛋白的等电点pI值为7.1±0.2，而在增加酯化程度后改性胶原蛋白的pI值明显下降到4.3±0.2，3.8±0.2，3.2±0.1和3.1±0.1，这表明用聚丙烯酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯对胶原蛋白进行改性后其水溶性明显改善，其改善水溶性的机制如图7，在中性pH值下，天然胶原蛋白的酸/碱氨基的电离程度几乎相等，因此紧凑组装的胶原蛋白分子不能被水分子分离。聚丙烯酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯的酯基与胶原蛋白的胺基之间的反应直接导致了自由胺基的消耗；此外，聚丙烯酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯的大量自由羧基被引入到改性胶原蛋白分子中，改性的胶原蛋白分子在中性溶液中可以很容易地被电离的羧基之间的强静电排斥力所分离，从而导致胶原蛋白的理想溶解能力。相反，改性胶原蛋白分子在醋酸溶液中不能被分离，因为在酸性的pH值下羧基很难被电离。



研究人员采用以天然高分子材料如透明质酸为媒介，将透明质酸与N-羟基琥珀酰亚胺\1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺反应进行改性，将改性后的透明质酸与天然胶原反应形成聚阴离子胶原蛋白，具体方案如下[38]：首先将胶原蛋白溶解在稀盐酸溶液(pH=4.0)中，加入氢氧化钠溶液使溶液的pH值为9.0，将透明质酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解在无水二甲基亚砜中，将其滴入胶原蛋白溶液中，以达到透明质酸-N-羟基琥珀酰亚胺/胶原蛋白的质量比为1/5；在反应过程中逐渐加入氢氧化钠溶液使胶原蛋白溶液的pH值维持在9.0，混合溶液搅拌24 h，然后用去离子水透析72 h，最后将改性胶原蛋白冻干并储存起来直到使用。
2.1.5   小结   酰化胶原蛋白作为改性胶原蛋白的一种，其制备方法主要是通过酰化反应来实现，而主要的反应物仍是以琥珀酸酐为主，近年来虽然有降冰片烯二酸酐等新的酸酐作为反应物，但是研究甚少。与琥珀酸酐对比，降冰片烯二酸酐可以与光引发剂反应生成水凝胶，而琥珀酸酐缺乏此功能，同时降冰片烯二酸酐低取代效果与琥珀酸酐高取代效果相当，改性之后的酰化胶原蛋白在中性溶液中的溶解度显著上升。总的来说，降冰片烯二酸酐可作为下一阶段性研究酰化胶原蛋白的主要反应物。而双官能团改性剂虽然也能使胶原蛋白的水溶性与热稳定性增强，但双官能团改性剂制备条件过于繁杂，并且引入材料过多，不可避免地使胶原蛋白掺杂过多基团。此外，对于酰化胶原蛋白的制备优化大多数针对于改性剂的选择与开发，而反应环境较统一。
2.2   酰化胶原蛋白表征及应用   
2.2.1   2，4，6-三硝基苯磺酸比色法(TNBS比色法)   琥珀酸酐及双官能团改性剂的反应位点一般都是胶原蛋白分子中赖氨酸的N端-氨基及ε-氨基，根据pH值的不同，反应的位点也会随之变化。研究表明，在pH=8.0以上胶原蛋白赖氨酸残基的ε-氨基组是首选的酰化位点，而在pH=6.5时胶原蛋白N端α-氨基组是有效的酰化位点。2，4，6-三硝基苯磺酸被用作确定肽、蛋白质和食品中的一级氨基[39]。2，4，6-三硝基苯磺酸会与蛋白质中赖氨酸的N端-氨基及ε-氨基发生亲核取代反应，反应产物会在光谱上有2个吸收值相近的高峰，分别位于355 nm和420 nm附近。然而一旦溶液酸化，中间络合物转化成三硝基苯-氨基酸，420 nm处的吸收值显著下降，而350 nm附近的吸收峰则移至340 nm处。利用2，4，6-三硝基苯磺酸与氨基酸反应的这一特性，可在420 nm处(偏碱性溶液)或在340 nm(偏酸性溶液)对氨基酸进行定量测定。
有研究表明，胶原蛋白赖氨酸的功能化程度可用2，4，6-三硝基苯磺酸比色法来测定。TRONCI等[40]研究光活性胶原蛋白系统中，使用2，4，6-三硝基苯磺酸比色法、氢核磁共振及表面衰减全反射红外光谱证实了胶原蛋白赖氨酸的共价和可调整的功能化。2，4，6-三硝基苯磺酸比色法主要是以评估自由的、未反应的ε-氨基摩尔含量，从而量化胶原蛋白的功能化程度。ZHANG等[41]研究了丙烯酸接枝-胶原蛋白接枝密度对胶原蛋白自组装的影响，不同接枝密度也是通过2，4，6-三硝基苯磺酸比色法测量得出，研究结果表明侧链丙烯化对胶原蛋白的自组装影响很大。WANG等[28]研究发现，琥珀酰化胶原蛋白的接枝密度过高会提高其亲水性，但会削弱其自组装性。尽管琥珀酰化后胶原蛋白的三螺旋可以被保留，但修饰后的酰化胶原蛋白热稳定性略有下降。可以看出，2，4，6-三硝基苯磺酸比色法已被广泛用于测定胶原蛋白改性的接枝密度。
此外，作者所在课题组采用邻苯二甲醛方法去测定修饰后胶原蛋白的接枝率，该方法相对于2，4，6-三硝基苯磺酸比色法存在着一定优势：2，4，6-三硝基苯磺酸比色法所用试剂的稳定性差、有毒性且易爆炸，所以试剂在保存及配制过程中应避光，相比之下邻苯二甲醛法的显色剂稳定性好，避免了这方面的问题，并且反应迅速，测定结果相对稳定。
2.2.2   茚三酮显色法   茚三酮显色法虽然与2，4，6-三硝基苯磺酸比色法原理上都是与氨基酸反应，但茚三酮与2，4，6-三硝基苯磺酸的反应位点截然不同。茚三酮只与蛋白质中的游离N端-氨基反应，且茚三酮溶液需要与氨基酸共热，生成氨，氨与茚三酮和还原性茚三酮反应生成紫色化合物，颜色的深浅与氨基酸的含量呈正比，可通过测定570 nm处的吸光度测定氨基酸的含量[42]。因此，茚三酮显色法不能用于特殊氨基酸的表征。根据学者研究茚三酮显色法测定游离氨基含量的结果大致为2，4，6-三硝基苯磺酸比色法的50%[43]，而这一结果与茚三酮不能与ε-氨基发生定量反应有一定关系，同时也说明了2，4，6-三硝基苯磺酸比色法的测定结果更能接近游离氨基的实际浓度，所以多数学者表征酰化胶原蛋白选择的方法为2，4，6-三硝基苯磺酸比色法而不是茚三酮显色法，并且茚三酮显色反应需要加热煮沸，而加热也会导致胶原蛋白的结构遭到破坏，对实验结果存在一定的影响。
2.2.3   十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)   SDS-PAGE是一种根据分子质量分离蛋白质的技术，通常被用来识别蛋白质模式和确定胶原蛋白肽的分子质量分布。通过使用这一手段，可以根据蛋白质的分子质量大小将其和其他片段相互分离。在电泳中，分子质量越小的多肽移动得越快，分子质量越大的多肽移动得越慢，主要是由于两者在凝胶中所遇到的阻力不同。一般来说，不同类型的胶原蛋白，例如Ⅰ型的胶原蛋白是由2条α1链和1条α2链(约100 kD)组成(不同物种提取出来的胶原蛋白会有所差异)。
研究表明，改性后胶原蛋白的分子质量条带相较于改性前天然胶原蛋白的分子质量次条带会发生迁移或者条带颜色较弱，这可能是由于改性胶原蛋白的分子质量增加，阻碍了胶原蛋白分子通过聚丙烯酰胺凝胶微孔时的渗透作用，导致改性后胶原蛋白的条带会有所迁移以及条带颜色会变浅。而且凝胶上没有观察到分子质量较低的降解产物条带，说明胶原蛋白改性后仍保留有2条α1链和1条α2链，但仍需结合圆二色谱等其他结果证明胶原蛋白的三螺旋结构在改性后保持完整。由图8得知，酰化胶原蛋白与天然胶原蛋白相比分子质量有所增加。因而SDS-PAGE是改性后胶原蛋白的重要表征手段，尤其是涉及到胶原蛋白分子质量会随着改性而改变的情况，更加适宜用SDS-PAGE进行表征。此外，作者所在课题组对琥珀酸酐修饰的酰化胶原蛋白进行SDS-PAGE，结果如图9所示，相较于修饰前天然胶原蛋白的分子质量条带向上迁移，推测是修饰后导致胶原蛋白的分子质量增加。







2.2.4   傅里叶变换红外光谱检测   红外光谱表征是物质定型的重要方法之一。红外光谱图能够提供许多关于官能团的信息，可以帮助确定部分乃至全部分子类型及结构。红外光谱可用于评估和识别胶原蛋白的结构完整性和化学成分，也被用来识别其类型。此外，多数学者为克服胶原蛋白本身所存在的缺陷，如水溶性差、机械性能弱等问题，会选择对胶原蛋白进行改性。对胶原进行改性，学者们不仅希望能够改善其机械性能、水溶性不足等问题，同时也希望能够保留住胶原蛋白的三螺旋结构，即保持胶原蛋白的生物活性。胶原蛋白也会随着来源不同导致傅里叶变换红外光谱检测结果有些许不同，而一般的Ⅰ型胶原蛋白主要有4个功能团的特征峰：C=O拉伸振动，N-H弯曲与C-N伸展相结合，N-H弯曲，N-H拉伸与氢键结合[44-45]。酰化胶原蛋白可以与天然胶原蛋白比较，从而得知胶原蛋白的三螺旋结构是否仍然保留。作者所在课题组将酰化胶原蛋白进行傅里叶变换红外光谱表征并与天然胶原蛋白对比，结果表明酰化胶原蛋白仍保留了5个功能团的特征峰，分别为酰胺A、酰胺B，酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ，保留了胶原蛋白的三螺旋结构。而不同来源胶原蛋白的折叠方式不同，产生不同的分子内和分子间氢键相互作用，而氢键的强弱程度影响了吸收峰的波数位置。酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ与肽链骨架结构密切相关，指示着胶原蛋白三螺旋结构状况。
2.2.5   等电点(pI)测定   等电点是蛋白质的一个重要参数，它与蛋白质含有的酸性氨基和碱性氨基残基比例有关。众所周知，当溶液的pH值处于pI时，蛋白质通常具有最差的溶解度[46]。同理，胶原蛋白属于两性蛋白质，也遵循这种原则。经文献报道，天然胶原蛋白的等电点一般在6.0-7.0 [47]，位于中性区域，这也表明了天然胶原蛋白在中性溶液如中性PBS、纯化水等液体中难以溶解，这一特性限制了胶原蛋白在生物医学上的应用。改性后胶原蛋白的等电点与改性前天然胶原蛋白的等电点相比有所下降。酰化胶原蛋白的等电点一般在4.0，这也从侧面证明用琥珀酸酐或双官能团改性剂对胶原蛋白进行改性后，其水溶性显著提高。酰化胶原蛋白改善水溶性的机制为：琥珀酸酐或双官能团改性剂引入大量自由羧基到酰化胶原蛋白分子中，当处于中性溶液时，酰化胶原蛋白分子可以很容易地被电离的羧基之间的强静电排斥力所分离，从而导致胶原蛋白在中性溶液的理想溶解能力，同时也导致了其难以溶解在酸性溶液中，因为处于酸性溶液中时羧基很难被电离出来。如图10显示，酰化胶原蛋白在中性溶液中的溶解能力好，在酸性溶液中的溶解能力差，天然胶原蛋白反之。



2.2.6   圆二色谱检测   圆二色谱是一种特殊的吸收谱，它通过测量蛋白质等生物大分子的圆二色光谱，从而得到生物大分子的二级结构相关信息，简单、快捷，被广泛应用于蛋白质折叠及构象研究、酶动力学等领域。有研究表明，胶原蛋白的圆二色性主要来源于胶原自身的活性生色基团和多肽的折叠，圆二色谱是研究胶原蛋白的热稳定性及三螺旋结构完整性方面的一个重要手段。
胶原蛋白是具有旋光性的蛋白质，在圆二色谱图像中胶原具有固定的特征峰位置，在220 nm附近会出现一个较为平缓的正峰，该峰为胶原蛋白三螺旋结构的一个特征峰。因此，圆二色谱是一种验证胶原蛋白是否变性的有效检测手段。研究人员可借助这种检测手段来表征酰化胶原蛋白分子是否还具有完整的三螺旋结构。天然胶原蛋白圆二色谱谱图在220 nm处出现一个正峰，在190 nm处出现一个负峰；酰化胶原蛋白也在220 nm处出现一个正峰，在190 nm处出现一个负峰，这也证明了酰化胶原蛋白仍保留着三螺旋结构，即保留胶原蛋白的生物活性。酰化程度不同，圆二色谱谱峰可能出现一定的偏差，酰化程度过高峰面会降低，会相对破坏胶原蛋白的一些三螺旋结构。
2.3   酰化胶原蛋白应用   
2.3.1   酰化胶原蛋白在眼部疾病的应用   酰化胶原蛋白作为一种改性胶原蛋白，由于缺乏对其系统性的表征及性能评估，导致其应用研究相比天然胶原蛋白少。HADASSAH等[48]尝试了将琥珀酰化胶原蛋白绷带镜代替目前用于治疗各种角膜疾病的其他绷带镜，用于各种眼部疾病如丝状角膜炎、干眼症、复发性角膜糜烂、异物取出和上皮创伤。该研究结果表明，琥珀酰化胶原蛋白绷带镜在人眼中具有完全的角膜贴合性和良好的舒适性；透明度可保持较长时间，同时患者视力尚可，泪液水平也有所改善。目前用于治疗各种角膜疾病的其他绷带镜片的缺点可以通过琥珀酰化胶原蛋白绷带镜镜片来克服。同时，HADASSAH等[49]还研究了用琥珀酰化胶原蛋白点滴塞治疗干眼症的临床评估，结果表明所有患者在使用琥珀酰化胶原蛋白点滴塞闭塞小孔后症状都得到了一定程度的缓解，在治疗干眼症的过程中琥珀酰化胶原蛋白点滴塞是一种很有前途的替代方法，可以替代其他的点状塞子。RYU等[50]评价局部应用琥珀酰化胶原蛋白治疗眶周皱纹的效果，并与腺苷治疗结果相比较，对眶周皱纹硅胶铸型的分析显示，琥珀酰化胶原蛋白对眶周皱纹有部分作用。琥珀酰化胶原蛋白可能是一种有效治疗上侧皱纹的选择，需要进一步研究，包括更长的治疗时间和更大的受试者群体来验证这些结果。
2.3.2   酰化胶原蛋白作为生物材料的应用   酰化胶原蛋白不仅在眼部疾病有应用潜力，其良好水溶性拓宽了胶原蛋白作为生物材料的应用。SRIPRIYA等[51]研究了一种用于控制药物释放的改良型胶原蛋白双层敷料，敷料由琥珀酰化胶原蛋白制备，敷料中含有抗生素环丙沙星，而敷料作为一个阴离子储库来容纳阳离子环丙沙星，药物停留在双层系统中，当接触到伤口时开始释放，达到缓释作用；体内研究结果证实了该敷料在控制大鼠感染方面的效率。NOISHIKI等[52]研究用琥珀酰化胶原蛋白水凝胶作为密封胶包裹着血管假体，结果表明超过95%的涂层胶原蛋白可被吸收，大量成纤维细胞迁移至移植物壁内，毛细血管浸润移植物壁内，无异体反应，说明琥珀酰化胶原蛋白可快速内皮化。重庆凝骄生物科技有限公司开发一种仿生基质水凝胶面膜以及一种生物仿生基质的3D打印墨水，这两种发明的原料都包括琥珀酰化胶原蛋白，研究结果证明该复合水凝胶材料具有良好的力学强度，并且软骨重建功能细胞在复合水凝胶内分散性良好，有望成为生物仿生基质的良好材料。PAMFIL等[53]在过硫酸铵和四甲基乙二胺的存在下，通过自由基聚合/交联取代的酸酐改性胶原蛋白与甲基丙烯酸2-羟乙酯获得了半互穿网络水凝胶，该水凝胶的热稳定性佳，且与水的结合能力也增加，水状态分析证明该材料具有很强的亲水特性，可能被用作生物材料。研究表明，酰化胶原蛋白既可以作为水凝胶包裹血管假体，也可作为敷料防止伤口表面干燥，说明酰化胶原蛋白作为生物材料的应用潜力巨大。此外，作者所在课题组针对酰化胶原和胶原蛋白进行一系列的对比表征，表征结果显示：酰化胶原改性之后仍保留胶原蛋白独特的三螺旋结构和大部分生物活性；酰化胶原蛋白与天然胶原蛋白均具有促进细胞增殖的能力，并且在细胞划痕实验中发现酰化胶原蛋白相较于天然胶原蛋白促进细胞迁移的能力更强。酰化胶原蛋白有作为细胞培养营养物质的潜力。作者所在课题组探索酰化胶原蛋白对伤口愈合的治疗效果，与天然胶原蛋白对比，酰化胶原蛋白良好的水溶性导致伤口吸收更快、伤口愈合也相对加快。
2.3.3   酰化胶原蛋白在化妆品领域的应用   酰化胶原蛋白在化妆品领域也展现出了极大的应用潜力。琥珀酰缺端胶原蛋白也是酰化胶原蛋白的一种，它作为一种化妆品原料并已获得中国食品药品监督管理局(CFDA)证书。琥珀酰缺端胶原蛋白一般是作为表面活性剂可降低水油界面张力，具有润湿、增溶、起泡等作用，可用于保湿产品。上海益好纳米科技有限公司开发的一种新型固体护肤品以及免洗全吸收型纳米纤维功能面膜里面的原料都包含着琥珀酰缺端胶原蛋白，同时也有许多化妆品成分里包含了琥珀酰缺端胶原蛋白，如Cossen公司的部分化妆品以酰化胶原蛋白作为原料，东莞胶原生物科技有限公司也有酰化胶原蛋白的相关产品。虽然已经取得了一些商业上的成功，但仍有许多化妆品公司正在开发酰化胶原蛋白的更多用途，因此将会在将来看到更多的酰化胶原蛋白产品。

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胶原蛋白是动物体内最丰富的结构蛋白，约占动物蛋白质的30%，广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物的皮肤、肌腱、韧带等部位。胶原蛋白是由3个α链组成的具有独特三螺旋结构的纤维蛋白质，主要为动物和人体组织提供强度和弹性，以满足生物医学、制药和化妆品行业的需要。目前，市售的胶原蛋白分为重组胶原蛋白和动物提取的天然胶原蛋白，动物提取主要来源于牛皮[1-2]、牛跟腱、海洋生物及大鼠尾巴[3-6]。
胶原蛋白根据其功能和结构域的同源性可以分为形成纤维的胶原蛋白、具有中断的三螺旋纤维相关胶原蛋白、网络形成的胶原蛋白、跨膜胶原蛋白、产生内切蛋白的胶原蛋白、锚定纤维和珠状丝状胶原蛋白[7-8]，其中形成纤维的胶原蛋白广泛存在于哺乳动物中。胶原蛋白根据其结构特点通常可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型，在这些胶原蛋白的分类中，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型是最常见的类型，占人体胶原蛋白总量的80%-90%[9]。Ⅰ型胶原蛋白是由2条α1(Ⅰ)链和1条α2(Ⅱ)链组成的异构体，具有三螺旋结构。由于其生物特性、无毒性、与所有生物体的生物相容性和丰富性，胶原蛋白基质显示出低抗原性和低炎症反应，具有止血特性[10]，也能促进细胞增殖[11]。这是它们作为组织工程和再生医学材料在生物医学行业广泛使用的原因之一。
胶原蛋白是一种典型的两性聚合物，等电点约为7.0，意味着它在中性溶液下溶解度低。另外，胶原蛋白对紫外线辐射和高温值敏感[12-13]，因此其热稳定性和亲水性亟需改善。胶原蛋白可以通过物理、化学、生物酶等方法进行改性。物理改性方法一般是通过暴露在紫外线照射下，或通过脱氢热处理和光氧化等[14-15]，此外也可向胶原蛋白加入化学交联剂进行化学交联，交联剂一般包括醛类(如戊二醛[16]、甲醛、乙二醛)、京尼平[17]、酸酐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)[18-19]；同样它们也可通过与其他聚合物混合，包括天然聚合物(如透明质酸[20]、壳聚糖[21-22]、海藻酸钠[23-24]、磷酸钙[25])和合成聚合物(如聚氨酯、聚乙烯醇)。在众多改性方法中，化学交联剂酸酐具有显著的优势，酸酐交联后形成酰化胶原蛋白，可明显改善胶原蛋白的水溶性，也可改善胶原蛋白的热稳定性，因此，它们的使用可以使胶原蛋白的溶解性进一步提升，酰化胶原蛋白有潜力成为一种安全、热稳定性好、生物相容性好的材料。目前酰化胶原蛋白还存在不少问题，虽然酰化胶原蛋白的水溶性增加了，但其机械性能仍旧偏弱，且变性温度降低热稳定性差，这些小缺陷在一定程度上限制了其在生物材料领域方面的应用。例如：因其机械性能与热稳定性降低，酰化胶原蛋白作为生物支架的性能较天然胶原蛋白生物支架的性能弱。鉴于相关文献对于酰化胶原蛋白的研究仅局限于制备及表征两部分，对于其生物应用评估探究甚少，该文就酰化胶原蛋白制备、表征及应用三方面对酰化胶原蛋白进行论述，重点讨论国内外酰化胶原蛋白的制备及表征的研究现状，对酰化胶原蛋白的未来研究方向进行展望。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   资料来源   
1.1.1   检索人及检索时间   由第一作者在2023年2月进行检索。
1.1.2   检索文献时限   1992年1月至2023年2月。
1.1.3   检索数据库   中国知网和PubMed数据库及X-mol平台。
1.1.4   检索词   英文检索词为“acylated collagen，modified collagen，water-soluble collagen，acetic anhydride”，中文检索词为“酰化胶原蛋白，改性胶原蛋白，水溶性胶原蛋白”。
1.1.5   检索文献类型   图书、期刊、综述、专利。
1.1.6   手工检索情况   无。

1.1.7   检索策略   包括英文及中文检索词、检索词的逻辑组配等。中国知网检索策略：SU=’酰化胶原蛋白’ AND FT=’ 改性胶原蛋白+水溶性胶原蛋白’。PubMed数据库及X-mol检索策略见图1。

1.1.8   检索文献量   共检索到文献278篇，其中中文文献10篇、英文文献268篇。
1.2   纳入与排除标准
1.2.1   纳入标准   ①与酰化改性胶原蛋白相关的文献；②针对水溶性改性胶原蛋白的相关文献；③与胶原蛋白改性 相关的文献。
1.2.2   排除标准   内容相关性小、陈旧性、重复性文献；逻辑不严谨可信度差的文献。

1.3   质量评估与数据提取   选择与文章内容相关性大且新颖，并具有价值的文章进行分析讨论，排除与研究目的相关性差及内容陈旧、重复的文献，纳入53篇符合标准的文献进行综述，包括中文5篇、英文48篇，见图2。

3.1   既往他人在该领域研究的贡献和存在的问题   胶原蛋白的生物特性及在组织工程中的重要作用决定了其作为生物材料的应用尤为广泛，然而胶原蛋白的亲水性差、机械性能差等缺陷在一定程度上限制了其应用。采用酸酐作为交联剂，可以使胶原蛋白中赖氨酸N端-氨基及ε-氨基相互作用合成酰化胶原蛋白。研究表明该类方法制备的酰化胶原蛋白能使胶原蛋白的水溶性明显提升，且能进一步制备成适用于生物医学应用的不同类型材料。近年来随着研究的深入，酸酐交联剂种类增多(如琥珀酸酐、马来酸酐、柠檬酸酐、降冰片烯二酸酐等)。一些研究开发出新的双官能团改性剂发挥出了超越普通酸酐的局限性，不仅改善了胶原蛋白的水溶性，同时保持其热稳定性。更重要的是，酰化胶原蛋白在提高水溶性的同时保留了胶原蛋白原有的三螺旋结构及生物学活性。
3.2   作者综述区别于他人他篇的特点   目前很少有文章对酰化胶原蛋白的制备方法、表征以及应用进行综述，已经发表的综述大部分只关注胶原蛋白的改性种类及方法，并未对酰化胶原蛋白进行详细地阐述。该综述详细地阐明了酰化胶原蛋白的各种制备方法，并通过各种酰化反应示意图展示胶原蛋白酰化的不同方法。其次，该综述阐述了现有酰化胶原蛋白的表征方法，最后还详细阐述了酰化胶原蛋白在生物医学、组织工程及化妆品领域的应用形式与方法。
3.3   综述的局限性   该综述总结了酰化胶原蛋白制备方法的发展历程以及表征和应用，但是其体内研究及临床评估尚欠缺。总体而言，酰化胶原蛋白仍缺乏完整的体内实验来验证其实用性。
3.4   综述的重要意义与展望   胶原蛋白作为热门的生物材料，近年来挖掘的应用已受到胶原蛋白本身缺陷的限制，而酰化胶原蛋白的水溶性增加，无疑拓宽了胶原蛋白的应用领域，可以达到更高、更好的水平。虽然酰化胶原蛋白的制备方法已报道不少，但是目前制备的酰化胶原蛋白稳定性仍有待提升，且制备酰化胶原蛋白的技术仍不够成熟，大部分制备方法局限于实验室上的制备，需要优化才能够进一步实现工业化生产。另一方面，酰化胶原蛋白水溶性的提升将拓宽胶原蛋白在各种应用领域上的使用：①在医学领域方面，胶原蛋白对于皮肤损伤有良好的功效，但因水溶性差使用剂型受到局限，一般使用贴敷料，而酰化提高了胶原蛋白的水溶性，酰化胶原蛋白在伤口愈合方面产生出多种剂型，如液体制剂、水凝胶等，使其疗效变得更佳。②在组织工程方面，虽然胶原蛋白具有良好的生物降解性和生物相容性，但水溶性差，酰化改变了胶原蛋白分子的表面电荷，使其等电点下降，可以在中性溶液下溶解，克服了胶原蛋白作为生物墨水使用的主要障碍，使酰化胶原蛋白在未来可以作为生物墨水的原材料。同时，胶原蛋白作为细胞支架尤为广泛，但也因其水溶性差受到限制，而酰化胶原蛋白改变水溶性的同时仍具有良好的生物活性，具有制备合适孔隙结构水凝胶的潜力。③另外，根据现有的科学研究结果显示，经过酸酐改性成的酰化胶原蛋白不仅可以作为生物医学材料，同时还可以作为化妆品原料来使用，产生一定经济效益的同时也能为医学、组织工程研究提供原材料，拓宽了胶原蛋白在医学、组织工程领域的应用。今后应加强对酰化胶原蛋白的体内研究，为日后的实际应用以提供有效的数据以及思路。   中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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文题释义：

酰化胶原蛋白：通过酰化反应机制得到的改性胶原蛋白，其反应物主要是酸酐为主，酸酐可以引入亲水性极强的羧基使胶原蛋白的水溶性增强。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

作为一种低免疫原性和高细胞亲和性的生物材料，胶原蛋白在医学、组织工程和化妆品等领域广泛应用。然而，胶原蛋白存在水溶性、热稳定性和机械性能等方面的缺陷。酸酐酰化胶原蛋白作为一种改性胶原蛋白，通过针对水溶性问题进行改性，拓宽了胶原蛋白的应用领域。尽管酸酐酰化胶原蛋白已经在市场上得到应用，但是其相关研究甚少，对其制备方法、表征和应用的综述也比较缺乏。已有的综述大多只关注胶原蛋白的改性种类和方法，而未详细阐述酸酐酰化胶原蛋白的制备方法、表征和应用。因此，该文详细描述了酸酐酰化胶原蛋白的制备方法、各种表征手段以及在各领域的应用，并结合作者工作进行总结。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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