1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2020年1-6月在河南中医药大学第二临床医学院(河南省中医院)中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 8周龄20-25 g雄性SPF级C57BL/6小鼠50只,购自北京维通利华实验动物科技有限公司(No.11400700270554),使用许可证号:SYXK(京)2017-0033。饲养于河南中医药大学中心实验室SPF级动物房,12 h光照,室温(26±3) ℃,湿度(45±10)%,自由饮食。此次研究目的及实验操作经河南中医药大学第二临床医学院动物实验伦理委员会批准,批准号:PZ-HNSZYY-2020-001。
1.3.2 主要试剂 RO4929097(英国Selleckchem,s1575);CD31(GB12063)、DAPI(G1012)(武汉塞维尔);血管内皮生长因子试剂盒(KE10009);碱性成纤维细胞生长因子试剂盒(美国Abcam,ab100670);GAPDH抗体(5174)、缺氧诱导因子1α抗体(36169)、NICD抗体(又cleaved Notch1,4147s)、Hes1(11988)(美国CST);心肌营养素1抗体(美国ImmunoWay,YT0638)。
1.3.3 主要仪器 小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司,ALC-V8);小动物超声成像仪(加拿大VisualSonics,Vevo 2100);数字切片扫描仪(匈牙利Pannoramic MIDI,3DHISTECH);倒置显微镜(德国Leica,DMIL-RF1);酶标仪(美国Biotek,Epoch2);凝胶成像仪(美国Bio-Rad,ChemicDoc XRS+)。
1.4 实验方法
1.4.1 小鼠心肌梗死模型建立及分组 50只小鼠给予3%戊巴比妥钠,按10 mL/kg腹腔注射,待小鼠完全麻醉后将其固定并行气管插管,胸部消毒后分离皮下组织,暴露心脏,于左心耳下方1.0-2.0 mm处进针,无菌医用带线缝合针迅速结扎小鼠左前降支冠状动脉,关闭胸腔后依次缝合肌肉层和皮肤组织,再次碘伏消毒,其中10只假手术组小鼠仅穿针不结扎。将20只造模成功的小鼠按数字表法随机分为模型组和RO4929097(抑制剂)组,每组10只。用1%羧甲基纤维素钠和0.2%吐温80配置RO49290974,RO4929097组小鼠术后第2天按10 mg/(kg·d)每天灌胃给药1次[7],假手术组和模型组小鼠给予等体积生理盐水,灌胃20 d。
1.4.2 小动物超声检测 给药第21天行小鼠超声检测,麻醉小鼠后用脱毛膏将胸前毛发脱净,涂以耦合剂后进行检测。将探头置于左胸前,并指向其右上,获得左室长轴切面,取3个连续心动周期测量的平均值。
1.4.3 取材 3%戊巴比妥钠按10 mL/kg小鼠腹腔注射,每组10只小鼠心脏取血并离心(3 000 r/min 离心15 min)后进行酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测;每组取5只小鼠心脏组织放入甲醛固定液保存,进行马松和免疫荧光染色;每组取3只小鼠心脏放入-80 ℃冻存,行免疫蛋白印迹实验。
1.4.4 马松染色 小鼠心肌样本在40 g/L多聚甲醛中固定12 h后,经二甲苯和不同浓度乙醇脱水,脱水后的样本经石蜡固定后依次进行切片、烤片和马松染色。用数字切片扫描仪对染色后的样本进行横断面扫描。用Adobe Photoshop CC软件对病理组织切片中蓝色部分和红色部分分别进行分析,计算相对梗死面积。
1.4.5 CD31免疫荧光染色 按上述步骤预留1张白片进行免疫荧光染色。小鼠组织切片抗原修复后用组化笔在组织周围画圈,用自发荧光淬灭剂孵育5 min,流水冲洗后,在圈内滴加牛血清白蛋白孵育30 min,进行封闭。滴加一抗后放于湿盒内4 ℃孵育过夜,洗涤后加二抗避光室温孵育50 min。滴加DAPI染核,避光室温孵育10 min。洗涤后稍甩干,用抗荧光淬灭封片剂封固。每个样本在缺血区域随机采集5个视野,用ImageJ分别计算CD31平均吸光度。
1.4.6 ELISA检测血清血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子水平 提前取出试剂盒及样本,平衡至室温,96孔板各孔中加入标准品及样品各100 μL,37 ℃孵育90 min;倒去孔内液体,加入100 μL生物素化抗体/抗原工作液,37 ℃孵育60 min,洗涤3次;加入100 μL酶结合物工作液,37 ℃孵育30 min,洗涤5次;加入90 μL底物溶液,37 ℃孵育15 min左右;加入50 μL终止液,立即在450 nm波长处测量A值。
1.4.7 免疫蛋白印迹检测心肌缺氧诱导因子1α、心肌营养素1、NICD及Hes1水平 取50 mg小鼠心肌组织,加入500 μL裂解液和蛋白酶抑制剂的混合液,电动匀浆器匀浆后13 000 r/min、4 ℃离心20 min,取上清进行蛋白定量及蛋白样本制备。BCA法检测蛋白浓度,用裂解液将所有样品调至最低样品的浓度,加入凝胶加样缓冲液后95 ℃变性5 min。配置SDS-PAGE凝胶,待胶凝后每孔加入20 μL样品,浓缩胶80 V电压跑20 min转120 V电压跑50 min停止;取出分离胶,160 mA电流转PVDF膜100 min;转膜完毕后用5%牛血清蛋白封闭;一抗4 ℃冰箱孵育过夜(缺氧诱导因子1α、NICD、Hes1及GAPDH稀释浓度1∶1 000,心肌营养素1稀释浓度1∶500);洗膜后二抗常温孵育1 h;ECL化学发光试剂盒中A、B液按1∶1比例混合后,将PVDF膜浸泡1 min取出并成像。
1.5 主要观察指标 ①小鼠左室射血分数;②心肌病理组织学变化和梗死面积;③血管新生标志物CD31表达量;④血清血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子水平;⑤心肌组织缺氧诱导因子1α、心肌营养素1、NICD及Hes1表达。
1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析,计量数据以x±s表示,方差齐时多组间比较用单因素方差分析,方差不齐时用非参数检验,P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经河南中医药大学第二临床医学院(河南省中医院)生物统计学专家审核。