当归甙调控FOXO1干预高血压模型大鼠的血管内皮功能障碍

doi:10.12307/2023.198

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (23): 3628-3634.doi: 10.12307/2023.198

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当归甙调控FOXO1干预高血压模型大鼠的血管内皮功能障碍

张希倩1，谭高峰1，孙晓泽1，庞欣2，韩宇3

河南省中医院，1老年病科，2肾病科，3消化内科，河南省郑州市 450000

收稿日期:2022-01-19 接受日期:2022-06-13 出版日期:2023-08-18 发布日期:2023-01-14
通讯作者: 韩宇，硕士，主治医师，河南省中医院消化内科，河南省郑州市 450000
作者简介:张希倩，女，1988年生，河南省郑州市人，汉族，2015年河南中医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事老年病的科研与临床研究。
基金资助:
河南省中医药科学研究专项(20-21ZY2015)，项目负责人：韩宇

Sweroside intervenes with vascular endothelial dysfunction in hypertensive rats by regulating FOXO1 expression

Zhang Xiqian1, Tan Gaofeng1, Sun Xiaoze1, Pang Xin2, Han Yu3

1Department of Geriatrics, 2Department of Nephrology, 3Department of Gastroenterology, Henan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Received:2022-01-19 Accepted:2022-06-13 Online:2023-08-18 Published:2023-01-14
Contact: Han Yu, Master, Attending physician, Department of Gastroenterology, Henan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
About author:Zhang Xiqian, Master, Attending physician, Department of Geriatrics, Henan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
Supported by:
Henan Provincial Traditional Chinese Medicine Research Project, No. 20-21ZY2015 (to HY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

肾动脉缩窄高血压模型：在该模型中，通过用银夹夹住一条肾动脉，可在大鼠中观察到类似于肾血管性高血压的持续全身升压效应。肾血流量的减少可引起肾素-血管紧张素系统过度激活，随后血浆肾素活性和循环血管紧张素Ⅱ水平显著增加，血管壁中活性氧大量累积，导致血压立即升高。
氧化应激：被认为是活性氧形成与细胞抗氧化能力之间的失衡，是活性氧生成增强和/或抗氧化系统功能障碍的结果。生理上，活性氧作为信号分子，通过高度调节的氧化还原敏感信号转导影响细胞功能。在高血压中，氧化应激促进蛋白质的翻译后修饰和异常信号传导，导致细胞和组织损伤。

背景：当归甙可调控细胞氧化应激水平，但其在高血压诱导的内皮细胞氧化损伤中的作用尚不清楚。
目的：探讨当归甙是否通过调控叉头框转录因子O1(Forkhead box O1，FOXO1)表达调控高血压诱导的血管内皮功能障碍。
方法：①体内使用肾主动脉缩窄法建立高血压大鼠模型，40只雄性SD大鼠随机分为4组：假手术组；高血压组；高血压+ 25 mg/kg当归甙组；高血压+ 50 mg/kg当归甙组。采用TUNEL染色检测大鼠胸主动脉内皮细胞凋亡情况。②体外利用50 μmol/L H2O2刺激人脐静脉血管内皮细胞建立细胞氧化损伤模型，分为：对照组；H2O2组；H2O2 + 当归甙组(10，20，40 μmol/L当归甙)；H2O2+Vector(阴性对照载体)组；H2O2+pcDNA-FOXO1组；H2O2+当归甙(40 μmol/L)+Scramble(阴性对照载体)组；H2O2+当归甙(40 μmol/L)+si-FOXO1组。采用MTT和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况；采用ELISA检测血清和人脐静脉血管内皮细胞中血管紧张素Ⅱ、丙二醛和一氧化氮水平，以及胸主动脉组织和人脐静脉血管内皮细胞中血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1和E-选择素水平；采用RT-qPCR和Western blot检测胸主动脉组织和人脐静脉血管内皮细胞中FOXO1 mRNA和蛋白表达。
结果与结论：①在体内，与假手术组比较，高血压模型大鼠血压和细胞凋亡水平明显升高(P < 0.05)，FOXO1 mRNA和蛋白水平明显降低
(P < 0.05)，血管紧张素Ⅱ、丙二醛、血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1和E-选择素水平明显升高(P < 0.05)，一氧化氮水平明显降低(P < 0.05)。当归甙以剂量依赖方式改善高血压大鼠血管功能障碍。②在体外，与对照组比较，H2O2组细胞增殖、FOXO1表达水平、一氧化氮水平明显降低(P < 0.05)，细胞凋亡及丙二醛、血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1和E-选择素水平明显升高(P < 0.05)。当归甙或FOXO1过表达可改善H2O2诱导的人脐静脉血管内皮细胞功能障碍；FOXO1干扰可逆转当归甙的作用。③结论：当归甙通过促进FOXO1表达改善高血压大鼠血管内皮功能障碍。

https://orcid.org/0000-0002-4307-2149(张希倩)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 当归甙, FOXO1, 高血压, 氧化应激, 内皮细胞功能障碍

Abstract: BACKGROUND: Sweroside can regulate cellular oxidative stress, but its role in hypertension-induced oxidative damage of endothelial cells remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate whether sweroside regulates hypertension-induced vascular endothelial dysfunction by regulating Forkhead box O1 (FOXO1) expression.
METHODS: (1) In vivo: The renal aorta constriction method was used to establish a hypertensive rat model. Forty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: sham group, hypertension group, hypertension+25 mg/kg sweroside group, and hypertension+50 mg/kg sweroside group. TUNEL staining was used to detect the apoptosis of rat thoracic aorta endothelial cells. (2) In vitro: 50 μmol/L H2O2 was used to stimulate human umbilical vein endothelial cells to establish a cell oxidative damage model. Damaged cells were divided into control group, H2O2 group, H2O2+10, 20, or 40 μmol/L sweroside groups, H2O2+Vector group (negative control), H2O2+pcDNA-FOXO1 group, H2O2+40 μmol/L sweroside+Scramble group (negative control), and H2O2+40 μmol/L
sweroside+si-FOXO1 group. MTT and flow cytometry were used to detect cell proliferation and apoptosis, respectively. ELISA was used to detect the levels of angiotensin II, malondialdehyde, and nitric oxide levels in rat serum and human umbilical vein endothelial cells, as well as vascular cell adhesion molecule 1, intercellular adhesion molecule 1, and E-selection levels in rat thoracic aorta tissues and human umbilical vein endothelial cells. RT-qPCR and western blot were used to detect the mRNA and protein expression of FOXO1 in rat thoracic aorta tissues and human umbilical vein endothelial cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vivo: compared with the sham group, blood pressure and apoptosis were significantly increased (P < 0.05), the expression levels of FOXO1 mRNA and protein were significantly reduced (P < 0.05), the contents of angiotensin II, malondialdehyde, vascular cell adhesion molecule 1, intercellular adhesion molecule 1, and E-selectin were significantly increased (P < 0.05), and the content of nitric oxide was significantly reduced (P < 0.05) in hypertensive rats. Sweroside could improve vascular dysfunction in hypertensive rats in a dose-dependent manner. (2) In vitro: compared with the control group, cell proliferation, FOXO1 expression and nitric oxide content were significantly reduced (P < 0.05), and cell apoptosis and malondialdehyde, vascular cell adhesion molecule 1, intercellular adhesion molecule 1, and E-selection contents were significantly increased (P < 0.05) in the H2O2 group. Sweroside treatment or FOXO1 overexpression could improve the dysfunction of human umbilical vein endothelial cells induced by H2O2, and the interference of FOXO1 could reverse the effect of sweroside. To conclude, sweroside can improve vascular endothelial dysfunction in hypertensive rats by promoting FOXO1 expression.

Key words: sweroside, FOXO1, hypertension, oxidative stress, vascular endothelial dysfunction

中图分类号:

张希倩, 谭高峰, 孙晓泽, 庞欣, 韩宇. 当归甙调控FOXO1干预高血压模型大鼠的血管内皮功能障碍[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(23): 3628-3634.

Zhang Xiqian, Tan Gaofeng, Sun Xiaoze, Pang Xin, Han Yu. Sweroside intervenes with vascular endothelial dysfunction in hypertensive rats by regulating FOXO1 expression[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(23): 3628-3634.

图/表（结果） 3

2.1 动物实验结果
2.1.1 实验动物数量分析实验选用大鼠40只，分为4组，每组10只，全部进入结果分析。
2.1.2 当归甙干预后各组大鼠血压、FOXO1表达、活性氧水平以及细胞凋亡的变化与假手术组比较，高血压模型大鼠建模7 d后血压开始升高，并在第28天达到较高水平(P < 0.01)；与高血压组比较，25 mg/kg或50 mg/kg当归甙干预后大鼠血压明显降低，且高剂量处理后血压下降更明显，见图1A。与假手术组比较，高血压模型大鼠主动脉组织中FOXO1的mRNA和蛋白表达水平明显降低；与高血压组比较，25 mg/kg或50 mg/kg当归甙给药后FOXO1的表达水平显著上调，且50 mg/kg当归甙处理后上调更显著，见图1B-D。与假手术组比较，高血压大鼠血清血管紧张素Ⅱ和丙二醛浓度明显升高，而一氧化氮浓度明显减少；与高血压组比较，25 mg/kg或50 mg/kg当归甙给药后大鼠血清血管紧张素Ⅱ和丙二醛浓度明显降低，而一氧化氮浓度明显升高，且50 mg/kg当归甙组效果更显著，见图1E-F。与假手术组比较，高血压大鼠胸主动脉组织中细胞凋亡、活性氧水平及血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1、E-选择素水平明显升高；与高血压组比较，25 mg/kg或50 mg/kg当归甙干预后主动脉组织中细胞凋亡、活性氧水平以及血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1和E-选择素水平显著下调，且50 mg/kg当归甙处理后效果更显著，见图1G-K。

2.2 细胞实验结果
2.2.1 当归甙对各组HUVECs 增殖、凋亡、活性氧和FOXO1的影响使用不同浓度当归甙处理HUVECs 48 h，细胞活力无显著变化，见图2A。与对照组比较，H2O2组细胞增殖显著下调，细胞凋亡显著上升，FOXO1的mRNA和蛋白表达明显减少；与H2O2组比较，当归甙处理显著促进细胞增殖和FOXO1的表达，显著抑制细胞凋亡，且40 μmol/L当归甙组效果优于10 μmol/L和20 μmol/L当归甙组，见图2B-G。与对照组比较，H2O2组一氧化氮浓度显著下调，活性氧及丙二醛、血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1、E-选择素水平显著上调；与H2O2组比较，当归甙组一氧化氮浓度显著升高，活性氧及丙二醛、血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1、E-选择素水平显著降低，且40 μmol/L当归甙组效果优于10 μmol/L和 20 μmol/L当归甙组，见图2H-K。

2.2.3 FOXO1干扰对各组HUVECs增殖、凋亡和活性氧水平的影响与对照组比较，H2O2组FOXO1蛋白表达和细胞增殖显著下调，细胞凋亡显著上升；与H2O2组比较，H2O2+当归甙组FOXO1蛋白表达和细胞增殖显著升高，细胞凋亡显著降低；与H2O2+当归甙+Scramble组比较，FOXO1 siRNA组FOXO1蛋白和细胞增殖显著下调，细胞凋亡显著升高，见图4A-E。与对照组比较，H2O2组一氧化氮浓度显著下调，活性氧及丙二醛、血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1、E-选择素水平显著上调；与H2O2组比较，H2O2+当归甙组一氧化氮浓度显著升高，活性氧及丙二醛、血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1、E-选择素水平显著降低；与H2O2+当归甙+Scramble组比较，FOXO1 siRNA组一氧化氮浓度显著减少，活性氧及丙二醛、血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1、E-选择素水平显著升高，见图4F-I。

参考文献

[1] LI Y, YANG L, WANG L, et al. Burden of hypertension in China: A nationally representative survey of 174,621 adults.Int J Cardiol. 2017;227:516-523.
[2] OLIVEROS E, PATEL H, KYUNG S, et al. Hypertension in older adults: Assessment, management, and challenges. Clin Cardiol. 2020;43(2):99-107.
[3] MILLS KT, STEFANESCU A, HE J. The global epidemiology of hypertension. Nature Reviews Nephrology. 2020;16(4):223-237.
[4] Touyz RM, Rios FJ, Alves-Lopes R, et al. Oxidative stress: a unifying paradigm in hypertension. Can J Cardiol. 2020;36(5):659-670.
[5] TOUYZ RM, ANAGNOSTOPOULOU A, CAMARGO L, et al. Vascular biology of superoxide-generating NADPH oxidase 5 (Nox5)- implications in hypertension and cardiovascular disease. Antioxid Redox Signal. 2019;30(7):1027-1040.
[6] MA LQ, YU Y, CHEN H, et al. Sweroside Alleviated Aconitine-Induced Cardiac Toxicity in H9c2 Cardiomyoblast Cell Line. Front Pharmacol. 2018;9:1138.
[7] YANG G, JANG JH, KIM SW,et al. Sweroside Prevents Non-Alcoholic Steatohepatitis by Suppressing Activation of the NLRP3 Inflammasome. Int J Mol Sci. 2020;21(8):2790.
[8] WEI S, CHEN G, HE W, et al. Inhibitory effects of secoiridoids from the roots of Gentiana straminea on stimulus-induced superoxide generation, phosphorylation and translocation of cytosolic compounds to plasma membrane in human neutrophils. Phytother Res. 2012;26(2):168-173.
[9] LI J, ZHAO C, ZHU Q, et al. Sweroside Protects Against Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury by Inhibiting Oxidative Stress and Pyroptosis Partially via Modulation of the Keap1/Nrf2 Axis. Front Cardiovasc Med. 2021;8:650368.
[10] DHARANEESWARAN H, ABID MR, YUAN L, et al. FOXO1-mediated activation of Akt plays a critical role in vascular homeostasis. Circ Res. 2014;115(2):238-251.
[11] JIAN D, WANG Y, JIAN L, et al. METTL14 aggravates endothelial inflammation and atherosclerosis by increasing FOXO1 N6-methyladeosine modifications. Theranostics. 2020;10(20):8939-8956.
[12] GRAVES DT, MILOVANOVA TN. Mucosal Immunity and the FOXO1 Transcription Factors. Front Immunol. 2019;10:2530.
[13] LIU X, CAO K, LV W, et al. Punicalagin attenuates endothelial dysfunction by activating FoxO1, a pivotal regulating switch of mitochondrial biogenesis. Free Radic Biol Med. 2019;135:251-260.
[14] WANG R, DONG Z, LAN X, et al. Sweroside Alleviated LPS-Induced Inflammation via SIRT1 Mediating NF-κB and FOXO1 Signaling Pathways in RAW264.7 Cells. Molecules. 2019;24(5):872.
[15] NATALIN HM, GARCIA AF, RAMALHO LN, et al. Resveratrol improves vasoprotective effects of captopril on aortic remodeling and fibrosis triggered by renovascular hypertension. Cardiovasc Pathol. 2016;25(2):116-119.
[16] TIAN Z, LIANG M. Renal metabolism and hypertension. Nat Commun. 2021;12(1):963.
[17] DAIBER A, CHLOPICKI S. Revisiting pharmacology of oxidative stress and endothelial dysfunction in cardiovascular disease: Evidence for redox-based therapies. Free Radic Biol Med. 2020;157:15-37.
[18] MIDAOUI AE, FANTUS IG, BOUGHROUS AA, et al. Beneficial Effects of Alpha-Lipoic Acid on Hypertension, Visceral Obesity, UCP-1 Expression and Oxidative Stress in Zucker Diabetic Fatty Rats. Antioxidants. 2019;8(12):648.
[19] GRIENDLING KK, CAMARGO LL, RIOS FJ, et al. Oxidative stress and hypertension. Circ Res. 2021;128(7):993-1020.
[20] NASH KM, SCHIEFER IT, SHAH ZA. Development of a reactive oxygen species-sensitive nitric oxide synthase inhibitor for the treatment of ischemic stroke.Free Radic Biol Med. 2018;115:395-404.
[21] CHEN L, JIANG M. Hypotensive Effect of Magnolin on Spontaneously Hypertensive Rats by Reversing Nitric Oxide Synthase Uncoupling. Revista Brasileira de Farmacognosia. 2022;32(1):65-73.
[22] PICKERING RJ. Oxidative Stress and Inflammation in Cardiovascular Diseases. Antioxidants (Basel). 2021;10(2):171.
[23] MARZIANO C, GENET G, HIRSCHI KK. Vascular endothelial cell specification in health and disease. Angiogenesis. 2021;24(2):213-236.
[24] WILSON C, ZHANG X, BUCKLEY C, et al. Increased Vascular Contractility in Hypertension Results From Impaired Endothelial Calcium Signaling. Hypertension. 2019;74(5):1200-1214.
[25] SILVA I, FIGUEIREDO R, RIOS D. Effect of Different Classes of Antihypertensive Drugs on Endothelial Function and Inflammation. Int J Mol Sci. 2019;20(14):3458.
[26] LIAO L, GONG L, ZHOU M, et al. Leonurine Ameliorates Oxidative Stress and Insufficient Angiogenesis by Regulating the PI3K/Akt-eNOS Signaling Pathway in H2O2-Induced HUVECs.Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:9919466.
[27] ZHUANG T, LIU J, CHEN X, et al. Endothelial Foxp1 Suppresses Atherosclerosis via Modulation of Nlrp3 Inflammasome Activation. Circ Res. 2019;125(6):590-605.
[28] HUANG S, SHAO T, LIU H, et al. SIRT6 mediates MRTF-A deacetylation in vascular endothelial cells to antagonize oxLDL-induced ICAM-1 transcription. Cell Death Discov. 2022;8(1):96.
[29] WANG S, SHI M, LI J, et al. Endothelial cell–derived exosomal circHIPK3 promotes the proliferation of vascular smooth muscle cells induced by high glucose via the miR-106a-5p/Foxo1/Vcam1 pathway. Aging (Albany NY). 2021;13(23):25241-25255.
[30] CHEN L, YIN Y, LIU G. Metformin alleviates bevacizumab-induced vascular endothelial injury by up-regulating GDF15 and activating the PI3K/AKT/FOXO/PPARγ signaling pathway. Ann Transl Med. 2021;9(20):1547.
[31] LIU S, LAI L, ZUO Q, et al. PKA turnover by the REGγ-proteasome modulates FoxO1 cellular activity and VEGF-induced angiogenesis. J Mol Cell Cardiol. 2014;72:28-38.
[32] WANG J, HU JQ, SONG YJ, et al. 2′-Fucosyllactose Ameliorates Oxidative Stress Damage in d-Galactose-Induced Aging Mice by Regulating Gut Microbiota and AMPK/SIRT1/FOXO1 Pathway. Foods. 2022;11(2):151.
[33] IANNI A, KUMARI P, TARIGHI S, et al. An Insight into Giant Cell Arteritis Pathogenesis: Evidence for Oxidative Stress and SIRT1 Downregulation. Antioxidants (Basel). 2021;10(6):885.

引言

中国是世界上高血压患者最多的国家，据统计，约有27.8%的成年人患有高血压，且患病率随着年龄的增长而增加[1]。尽管近年来高血压的治疗和管理取得较大进步，但20%-30%的高血压患者对至少3种抗高血压药物产生抗药性[2]。
由于高血压与严重的并发症有关，包括左心室肥大、动脉硬化和中风，因此有必要开发额外的治疗方法来预防心血管并发症[3]。有证据显示氧化应激增强是高血压的重要潜在因素[4]。此外，氧化应激已被证明在血管功能障碍发展中发挥关键作用，它可降低血管扩张分子(如一氧化氮)的生物利用度，进而导致内皮功能障碍[5]。
目前，中药被广泛用于治疗高血压。当归甙是中药龙胆草的提取物，具有抗炎、抗菌和抗过敏的功效，通常被用于治疗肝胆疾病[6-7]。此外，当归甙也可参与细胞氧化应激水平调控。当归甙可抑制N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰-苯丙氨酸诱导的嗜中性粒细胞中超氧化物生成[8]。当归甙还可通过抑制缺氧/复氧诱导的氧化应激，保护心肌细胞免受氧化损伤[9]。鉴于当归甙的抗氧化应激作用，猜测其可能作为高血压的潜在治疗药物。叉头框转录因子O1(Forkhead box O1，FOXO1)属于FOXO家族，是一种转录因子，可在血管稳态中发挥重要作用。FOXO1缺失可导致小鼠血管发育异常，沉默FOXO1可抑制内皮细胞迁移和增殖[10]。内皮源性收缩因子血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1及E-选择素已被报道是FOXO1的下游调控因子[11]。此外，FOXO1可参与调节机体氧化应激和能量代谢[12]。据报道，石榴多酚可通过上调FOXO1表达抑制棕榈酸酯诱导的人主动脉内皮细胞氧化应激[13]。前人研究显示，当归甙可在巨噬细胞中通过激活去乙酰化酶1上调FOXO1表达水平[14]。由此推测FOXO1可能作为当归甙的下游效应因子发挥作用。因此，该研究从体内和体外水平探究了当归甙是否通过调控FOXO1表达调控氧化应激，从而参与血管内皮细胞功能调控。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2020年9月至2021年7月在河南省中医药大学SPF级实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 40只雄性SPF级SD大鼠，鼠龄6-8周，体质量(190±10) g，购自河南中医药大学，动物生产许可证号：SYXK(豫)2020-0004。所有动物被饲喂于12 h光照/
12 h黑暗交替环境下，可随意获得常规食物和水。实验方案经河南省中医药大学动物实验伦理委员会批准(批准号为HNUCM-2020037)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂与仪器当归甙购自美国GLPBIO公司；血管紧张素Ⅱ、一氧化氮、丙二醛、血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1和E-选择素酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒均购自北京BioTeke公司；活性氧检测试剂盒购自北京百奥莱博公司；凋亡细胞检测试剂盒购自德国Miltenyi Biotec公司；兔单克隆FOXO1抗体和鼠单克隆甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体购自英国Abcam公司；HRP标记的兔抗鼠和羊抗兔二抗购自美国Sigma公司；实时荧光定量PCR反应试剂盒TRIzol购自美国Invitrogen公司；噻唑蓝(3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)染色液和过氧化氢(H2O2)购自大连Takara Biotechnology公司；ECL发光液、碘化丙啶(propidium Iodide，PI)染色液和TUNEL检测试剂盒购自美国Thermo公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和DMEM培养液购自美国Gibco公司；FOXO1过表达载体(pcDNA-FOXO1)、FOXO1小干扰RNA(si-FOXO1)和对应阴性对照载体Vector或Scramble购自美国Bio-Rad公司。智能无创血压仪Softron BP-98AL购自北京软隆生物技术有限公司；凝胶成像分析仪购自广州瑞丰实验设备有限公司；BD LSRFortessa细胞分析仪购自美国BD Biosciences公司；酶标仪购自美国ELX800公司。
1.4 实验方法
1.4.1 动物实验

(1)动物模型建立：将40只SD大鼠随机分为假手术组、高血压组、高血压+当归甙25 mg/kg组和高血压+当归甙(50 mg/kg)组，每组10只。使用2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠取右侧卧位固定于操作台，在左肋缘下方肾脏体表投影区域内消毒，剪去毛发，充分暴露手术区域，沿左肋弓下缘平行于脊柱约 1 cm处纵向切开皮肤1.0-2.0 cm，逐层分离皮肤、筋膜、肌层后充分暴露左肾，将左肾移出腹腔，用含生理盐水的纱布包裹，在肾门处用钝头镊小心分离肾动脉和肾静脉，利用内径0.25 mm的U形银夹缩窄左肾动脉，充分固定后将肾脏还纳腹腔并缝合建立高血压大鼠模型。假手术组仅分离血管，但不缩窄，其余操作与高血压组相同。建模4周后，若大鼠收缩压> 160 mmHg且解剖后左肾无坏死、萎缩或纤维化则建模成功。此时，利用当归甙(25 mg/kg或50 mg/kg)每天腹腔注射建模成功的大鼠，持续4周。手术后8周，在麻醉下断头处死所有大鼠。高血压建模成功率为100%。该动物模型通过减少肾血流量引起肾素-血管紧张素系统过度激活，并伴随血浆肾素活性和循环血管紧张素Ⅱ水平显著升高，以及血管壁中活性氧大量累积。

(2)大鼠血压监测：使用无创血压仪检测大鼠血压，血压监测前维持环境温度24 ℃左右，将大鼠放置于固定囊袋中，露出鼠尾，用乙醇擦拭使其尾动脉充分扩张，将加压尾套放置于鼠尾根部，使其与尾动脉紧密贴合。在大鼠安静的状态下，打开血压监测系统，待屏幕上的脉搏波信号出现并持续稳定5 min后开始测血压，连续测量5次，取平均值并记录。所有大鼠术前均进行基础血压测定，术后每周定期进行血压测定。
(3)测定大鼠血清血管紧张素Ⅱ、一氧化氮和丙二醛水平以评估建模的成功以及建模后的氧化应激水平：各组大鼠在手术后8周采用针刺心脏法采集血液并分离血清，破碎各组细胞并收集培养液上清，使用相应的ELISA试剂盒检测血清中血管紧张素Ⅱ、一氧化氮和丙二醛的水平和细胞中一氧化氮和丙二醛的水平。
(4)测定大鼠血管组织中的黏附分子水平以评估血管内皮细胞功能：手术后8周处死大鼠，收集大鼠胸主动脉组织使用液氮研磨法结合PBS制作组织匀浆，使用ELISA试剂盒检测组织匀浆中血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1和E-选择素水平。
(5)TUNEL染色法：手术后8周收集大鼠胸主动脉，用镊子分离胸主动脉内皮，使用40 g/L多聚甲醛固定48 h，用乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡浸润包埋，使用切片机将其切成2 μm左右的薄片，将切片放入45 ℃ 恒温箱烘干，二甲苯脱蜡，乙醇脱水。按TUNEL检测试剂盒的说明检测大鼠胸主动脉内皮细胞的凋亡，每个组从3个深度的切片组织中随机取10个切片，染色后，每个切片至少有100个细胞被评估。标记的细胞数表示为细胞总数的百分比，对平均百分比进行统计评估。使用光学显微镜观察并记录凋亡细胞。
(6)组织活性氧水平检测：手术后8周收集大鼠胸主动脉，并于冰上制作组织匀浆。按照说明书，在组织匀浆中加入5 μmol/L 2’，7’-二氯二氢-荧光素二乙酸酯(2′，7′-dichlorodihy-drofluorescein diacetate，DCFH-DA)探针，置于37 ℃环境下孵育20 min。使用荧光酶标仪测定荧光强度。
1.4.2 细胞实验

(1)细胞氧化损伤模型建立及处理：人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)购自美国ATCC细胞库。H2O2作为机体产生的一种活性氧，在自身浓度较高时可诱导大量活性氧生成，与动物模型一致可对内皮细胞造成氧化损伤。将细胞接种于6孔板，每孔约1.2×106细胞，每孔加入2 mL含体积分数10% FBS的DMEM培养液。

(2)MTT法检测HUVECs增殖：在细胞培养的第0，24，48和72 小时分别加入20 μL 5 g/L MTT，于37 ℃孵育4 h，吸出培养液并加入150 μL二甲基亚砜，待结晶全部溶解后，使用酶标仪检测A值，检测波长为 490 nm。
(3)流式细胞术检测HUVECs凋亡：以2×108 L-1的细胞浓度接种于培养基孵育24 h后。收集细胞并用预冷PBS洗涤3次。将细胞重悬在含有PI的缓冲液中，室温培养15 min后，使用BD LSRFortessa细胞分析仪进行流式细胞术检测细胞凋亡。
(4)RT-qPCR检测细胞和组织中FOXO1 mRNA水平：使用TRIzol试剂按照说明书提取细胞的总RNA，使用TaqMan试剂盒将提取的总RNA反转录成cDNA。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，FOXO1上游引物：5′-GGC TGA GGG TTA GTG AGC AG-3′，下游引物： 5′-AAA GGG AGT TGG TGA AAG ACA-3′；GAPDH上游引物：5′-GTC GGA GTC AAC GGA TTT GGT-3′，下游引物：5′-GCC ATG GGT GGA ATC ATA TTG G-3′。qPCR反应体系为20 μL，包含2 μL模板，2 μL 10×TaqMan酶，1 μL引物1，1 μL引物2和14 μL ddH2O。qPCR反应条件：95 ℃ 1 min，90 ℃ 30 s， 56 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。用SYBR Green Mater Mix试剂检测待检基因的mRNA水平，重复检测3次，mRNA水平以GAPDH作为内参。
(5)Western blot法检测FOXO1蛋白表达水平：使用RIPA裂解液裂解细胞并提取总蛋白，使用BCA试剂盒测定样品蛋白浓度。电泳结束后用蛋白转膜仪将蛋白转印至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶将膜封闭1 h，TBST洗膜完成后，用一抗FOXO1(1∶500稀释)和GAPDH(1∶500稀释)于4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加入HRP标记的兔抗鼠二抗(1∶1 000稀释)室温孵育2 h，洗膜完成后在ECL中显色。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参GAPDH条带灰度值。
(6)细胞活性氧水平检测：按照说明书的要求将DCFH-DA稀释至10 μmol/L，弃掉细胞培养液，加入DCFH-DA(1×109L-1)并置于37 ℃环境下孵育20 min。使用荧光酶标仪测定荧光强度。
(7)ELISA检测一氧化氮、丙二醛及黏附分子水平：各组细胞按分组方法分别处理48 h后取细胞上清液，利用ELISA测定细胞上清液中一氧化氮、丙二醛、血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1及E-选择素水平。
1.5 主要观察指标 ①大鼠建模后血压和FOXO1表达水平；②大鼠血清血管紧张素Ⅱ、一氧化氮和丙二醛水平；③大鼠胸主动脉组织中血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1和E-选择素的水平；④当归甙干预各组HUVECs 增殖、凋亡和FOXO1 mRNA和蛋白的表达；⑤FOXO1过表达干预各组HUVECs增殖、凋亡和FOXO1蛋白的表达；⑥FOXO1干扰各组HUVECs增殖、凋亡和FOXO1蛋白表达。
1.6 统计学分析使用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析，结果采用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用 LSD-t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经河南省中医药大学生物统计学专家的审核。

讨论

高血压是全球心血管疾病和过早死亡的主要原因[16]。氧化应激是指活性氧等高活性酶的过量产生，导致细胞抗氧化能力失衡[17]。研究表明，氧化应激和高血压有着密不可分的联系，高血压大鼠血清中的超氧阴离子含量明显高于正常大鼠[18-19]。机体产生的自由基可进一步刺激血管内皮细胞，提高血管张力，而一氧化氮可以直接与自由基结合，形成过氧亚硝酸盐(ONOO)，从而达到清除自由基的目的[20]。丙二醛是脂质过氧化的标志，可反映体内自由基的水平[21]。而一氧化氮合成或生物利用度受损可导致内皮功能障碍[22]。内皮功能障碍是高血压的一个标志。血管内皮细胞通过多种机制在血管功能中发挥重要作用，包括以自分泌和旁分泌形式作用的物质合成和释放[23]。内皮功能障碍的特征是血管活性分子的产生或生物利用度发生变化，尤其是内皮源性舒张因子(如一氧化氮)和内皮源性收缩因子(如血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1和E-选择素)[24]。这些分子的变化对血管反应性的影响导致氧化应激增加和一系列信号通路的激活，进而诱导内皮功能障碍[25]。H2O2作为机体产生的一种活性氧，在自身浓度较高时可诱导大量活性氧生成，对内皮细胞造成氧化损伤[26]。因此，H2O2被广泛用于诱导血管内皮细胞氧化损伤。
当归甙已被证明可参与氧化应激的调控。据报道，当归甙可通过减少活性氧和丙二醛的积累，增强超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，缓解缺氧/复氧诱导的心肌细胞氧化损伤[9]。当归甙可在大鼠心肌细胞中抑制活性氧和丙二醛产生，促进超氧化物岐化酶活性，以保护心肌细胞免受乌头碱的毒性[6]。鉴于当归甙的抗氧化应激作用，猜测其可能作为抑制高血压诱导的血管内皮细胞氧化应激的潜在药物。此次研究通过肾主动脉缩窄法建立高血压大鼠模型，此方法通过减少肾血流量，引起肾素-血管紧张素系统过度激活，进而使血压立即升高，并伴随血浆肾素活性和循环血管紧张素Ⅱ水平显著升高，以及血管壁中大量生成活性氧[15]。该模型可在短时期内诱发明显的血压升高且维持时间较长。结果显示，建模后大鼠血压明显升高，且血清血管紧张素Ⅱ水平明显上调。而当归甙干预后可明显改善大鼠血压，抑制血清血管紧张素Ⅱ水平；其次，当归甙可显著抑制高血压诱导的活性氧和丙二醛生成并上调一氧化氮浓度；此外，当归甙还可抑制高血压大鼠的胸主动脉内皮细胞凋亡，并抑制血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1和E-选择素的水平，表明当归甙可能通过保护内皮细胞免受氧化应激损伤，从而缓解高血压大鼠的症状。在体外，此次实验利用H2O2刺激HUVECs建立内皮细胞氧化损伤模型。结果显示，H2O2刺激后HUVECs增殖能力和细胞上清液中一氧化氮浓度显著降低，细胞凋亡水平、活性氧生成能力及血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1和E-选择素水平显著升高，而当归甙处理可显著抑制H2O2诱导的HUVECs功能障碍。
FOXO1在血管内皮细胞中广泛表达，FOXO1过表达动脉粥样硬化小鼠体内病变的形成和单核细胞浸润明显减
少[27]。FOXO1沉默已被证明对血管内皮细胞迁移和增殖具有抑制作用[10]。血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1及E-选择素水平已被报道是FOXO1的下游调控因子[28-30]。据报道，甲基转移酶14可与FOXO1协作调控血管细胞黏附分子1和细胞间黏附分子1的转录[11]。蛋白激酶A催化亚基α可通过FOXO1调控E-选择素的表达[31]。此外，FOXO1还是氧化应激的关键调控因子。研究表明，石榴多酚可通过上调FOXO1表达抑制棕榈酸酯诱导的人主动脉内皮细胞氧化应激[13]。此次研究中，发现在HUVECs中过表达FOXO1，可抑制H2O2诱导的活性氧和丙二醛生成，并促进一氧化氮产生。此外，FOXO1还可阻碍H2O2诱导的细胞增殖减少、细胞凋亡及血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1和E-选择素水平增加，表明FOXO1可通过抑制细胞氧化应激活性减轻H2O2诱导的HUVECs功能障碍。WANG等[14]发现当归甙可在脂多糖刺激的巨噬细胞中上调FOXO1表达。猜测FOXO1可能作为当归甙的下游靶基因参与当归甙对高血压诱导的内皮功能障碍的调控。此次研究的结果显示，与假手术组比较，高血压大鼠主动脉组织中FOXO1的表达显著下调，而在当归甙干预后FOXO1显著上调。在体外，利用H2O2处理
HUVECs可显著抑制FOXO1表达，而当归甙处理可逆转H2O2对FOXO1的抑制作用。此外，利用siRNA沉默FOXO1，可有效中和当归甙对H2O2诱导的HUVECs功能障碍的保护作用，表明当归甙可通过调控FOXO1表达抑制氧化应激，从而缓解HUVECs功能障碍。
据报道，SIRT1可使FOXO1去乙酰化并在多个系统中激活FOXO1转录[32]，且WANG等[14]的研究发现当归甙可通过激活SIRT1上调FOXO1表达；此外，SIRT1可通过FOXO1通路刺激抗氧化剂的表达，而增加的活性氧水平又可直接和间接地控制SIRT1酶的活性[33]。因此，在此次研究中猜测当归甙可能通过促进活性氧累积以及调控SIRT1酶活性调控FOXO1的表达，但具体的调控机制尚不明确。因此，后续研究将集中于探究当归甙如何调控FOXO1表达以影响内皮细胞功能。
综上所述，在体内，当归甙干预可抑制高血压大鼠血压、血清血管紧张素以及胸主动脉组织氧化应激和细胞凋亡水平；在体外，当归甙处理可减轻H2O2诱导的HUVECs增殖能力下降、细胞凋亡和氧化应激水平上升。机制探究发现当归甙可通过促进FOXO1的表达抑制内皮细胞氧化应激，进而改善高血压大鼠血管内皮功能障碍。该研究结果表明当归甙可能作为高血压血管内皮损伤的潜在介入治疗药物。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

当归甙调控FOXO1干预高血压模型大鼠的血管内皮功能障碍

Sweroside intervenes with vascular endothelial dysfunction in hypertensive rats by regulating FOXO1 expression

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[1]	郭淑慧, 杨晔, 江杨洋, 许建文. 神经源性膀胱miRNA-mRNA调控网络的筛选与验证[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-8.
[2]	方兴艳, 田侦丽, 赵哲仪, 文平, 谢婷婷. 亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞损伤及鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号轴的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-7.
[3]	党祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹金, 熊山, 张顶梅, 王信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[4]	聂晨晨, 苏凯奇, 高静, 凡勇福, 阮晓迪, 袁洁, 段昭远, 冯晓东. 环状RNA调控脑缺血发病的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1286-1291.
[5]	梁家琪, 刘恒旭, 阳金鑫, 杨椅, 邓旭辉, 谭明健, 罗炯. 运动与肠道菌健康效益的关系[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1292-1299.
[6]	阮凌, 王光华, 吴荣平, 晋战, 吕镇庆, 张楠, 李寿邦. 运动强度与高脂饮食模型大鼠脂代谢紊乱和氧化应激的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1149-1155.
[7]	田沁玉, 田兴贵, 田壮, 眭翔, 刘舒云, 鲁晓波, 郭全义. 四氧化三锰纳米颗粒抗氧化损伤保护骨髓间充质干细胞的伸展功能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 821-826.
[8]	李志超, 谭国庆, 苏辉, 徐展望, 薛海鹏. 非编码RNAs作为潜在治疗靶点在脊髓损伤中的调控效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 758-764.
[9]	魏琴, 陈冰心, 赵翎, 阿曼古丽·如则, 赵帮豪, 姜涛, 张春, 李志强, 段明军, 高晓明. 松弛素抑制氧化应激反应保护小鼠心肌微血管内皮细胞的缺氧/复氧损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(23): 3621-3627.
[10]	王巍潼, 欧阳范献, 李军, 李佳琪. 海南省6-18岁在校学生高血压现患率及其影响因素分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(23): 3728-3735.
[11]	彭梦竹, 杨贤罡, 邢丽丽, 李国俊. 呼出气冷凝液标本用于检测运动时气道的健康状况[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(23): 3755-3762.
[12]	刘运琴, 林丽, 肖文昊, 戢秋明, 刘燕芹. 淫羊藿苷对精神分裂症模型大鼠认知及海马组织NRG1/ErbB信号通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(20): 3236-3241.
[13]	孙芳园, 孟佳磊, 马宇慧, 耿欢, 张涛. 川芎嗪对脂多糖诱导大鼠心肌细胞炎症及氧化应激的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(20): 3253-3258.
[14]	郭淑慧, 杨晔, 江杨洋, 许建文. 神经源性膀胱miRNA-mRNA调控网络的筛选与验证[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(20): 3143-3150.
[15]	税晓平, 李春莹, 李明娟, 李顺昌, 孙君志, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病模型大鼠海马抗氧化应激指标和脑源性神经营养因子表达的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 264-269.