鼻黏膜来源外胚间充质干细胞与磷酸钙骨水泥材料的体外相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0670

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (33): 5350-5355.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0670

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

鼻黏膜来源外胚间充质干细胞与磷酸钙骨水泥材料的体外相容性

史文涛¹，戴瑶²，陈平波²，毕士奇²，吕德明²，陆浩²，张志坚²

¹南京市高淳人民医院骨科，江苏省南京市 211300；²江苏大学医学院，江苏省镇江市 212000

修回日期:2018-07-19 出版日期:2018-11-28 发布日期:2018-11-28
通讯作者: 张志坚，教授，江苏大学医学院，江苏省镇江市 212000
作者简介:史文涛，男，1992年生，安徽省宣城市人，汉族，2018年江苏大学毕业，硕士，医师，主要从事脊髓损伤和骨缺损研究。
基金资助:
国家自然科学基金地区科学基金资助项目(81571830)，中文名称：TG2/SHH基因修饰EMSCs-Fibrin支架对NSCs命运调控机制及修复脊髓损伤研究

Compatibility of nasal mucosa-derived ectomesenchymal stem cells and calcium phosphate cement in vitro

Shi Wen-tao¹, Dai Yao², Chen Ping-bo², Bi Shi-qi², Lü De-ming², Lu Hao², Zhang Zhi-jian²

¹Department of Orthopedics, Gaochun People’s Hospital of Nanjing, Nanjing 211300, Jiangsu Province, China; ²School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China

Revised:2018-07-19 Online:2018-11-28 Published:2018-11-28
Contact: Zhang Zhi-jian, Professor, School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China
About author:Shi Wen-tao, Master, Physician, Department of Orthopedics, Gaochun People’s Hospital of Nanjing, Nanjing 211300, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81571830

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨形态发生蛋白2：大量研究表明骨形态发生蛋白2可促进体外培养的间充质干细胞分化为成骨细胞，目前已被批准应用于临床以促进骨折愈合，就针对骨形态发生蛋白2在体内代谢过快的缺点，组织工程学中常用缓释载体包埋骨形态发生蛋白2，使其获得更好的生物学功效。
鼻黏膜来源的外胚间充质干细胞：为分布于头面部黏膜内的特殊类型的干细胞，来源于胚胎时期的神经嵴，该细胞仍保留多向分化潜能。鼻腔黏膜包括呼吸部黏膜和嗅部黏膜，关于嗅黏膜干细胞和嗅鞘细胞修复神经系统损伤的研究较多。

摘要
背景：利用磷酸钙骨水泥载间充质干细胞治疗骨缺损已取得令人满意的成果，但是鼻黏膜来源的外胚层间充质干细胞与磷酸钙骨水泥的体外相容性尚不清楚。
目的：探讨磷酸钙骨水泥对大鼠鼻黏膜来源外胚间充质干细胞向成骨细胞分化的影响，进一步探讨鼻黏膜来源外胚间充质干细胞与磷酸钙骨水泥的生物相容性。
方法：体外培养扩增鼻黏膜来源外胚间充质干细胞，并将其种植于磷酸钙骨水泥表面和培养板(对照组)，均进行成骨诱导14 d。碱性磷酸酶活性法检测鼻黏膜来源外胚间充质干细胞的碱性磷酸酶活性，茜素红染色法测定钙结节面积大小，免疫荧光和免疫印迹法检测成骨诱导相关蛋白表达水平；鬼笔环肽染色法动态观察磷酸钙骨水泥表面的细胞形态；MTT法检测磷酸钙骨水泥对细胞增殖的影响。
结果与结论：①成骨诱导14 d后，磷酸钙骨水泥表面的鼻黏膜来源外胚间充质干细胞碱性磷酸酶活性较高，形成的钙结节较大，骨相关蛋白表达水平较高；②磷酸钙骨水泥对鼻黏膜来源外胚间充质干细胞的增殖有一定的促进作用；③结果表明，鼻黏膜来源外胚间充质干细胞与磷酸钙骨水泥支架材料具有良好的生物相容性，磷酸钙骨水泥对鼻黏膜来源外胚间充质干细胞向成骨细胞分化表现出一定的促进作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8451-5850(史文涛)

关键词: 鼻黏膜, 外胚间充质干细胞, 磷酸钙骨水泥, 成骨分化, 生物相容性, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The use of calcium phosphate cement (CPC) carrying mesenchymal stem cells for the treatment of bone defects has achieved satisfactory results. The in vitro compatibility of ectomesenchymal stem cells (EMSCs) derived from the nasal mucosa with CPC is unknown.
OBJECTIVE: To investigate the effect of calcium phosphate cement on the differentiation of rat nasal mucosa-derived EMSCs into osteoblasts and to further explore the biocompatibility of EMSCs and CPC.
METHODS: EMSCs were cultured, expanded in vitro and implanted onto the CPC surface or onto culture plates. Then, implanted EMSCs were induced to differentiate into osteoblasts for 14 days. Alkaline phosphatase activity assay was used to detect the alkaline phosphatase activity of EMSCs. The area of calcium nodules was determined by alizarin red staining. The expression level of osteogenesis-related proteins was detected by western blot assay and immunofluorescence method. Morphology of EMSCs on the CPC surface was dynamically observed using phalloidin staining. MTT assay was used to detect the proliferation of EMSCs on the CPC surface.
RESULTS AND CONCLUSION: After 14 days of osteogenic induction, there was higher alkaline phosphatase activity, larger calcium nodules and higher levels of osteogenesis-related proteins in the EMSCs implanted on the surface of CPC than those implanted on the culture plates. The CPC had a certain role in promoting the proliferation of EMSCs. To conclude, EMSCs and CPC scaffolds have good biocompatibility, and moreover, CPC can certainly promote the differentiation of EMSCs into osteoblasts.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Nasal Mucosa, Mesenchymal Stem Cells, Calcium Phosphates;, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

史文涛，戴瑶，陈平波，毕士奇，吕德明，陆浩，张志坚. 鼻黏膜来源外胚间充质干细胞与磷酸钙骨水泥材料的体外相容性[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(33): 5350-5355.

Shi Wen-tao, Dai Yao, Chen Ping-bo, Bi Shi-qi, Lü De-ming, Lu Hao, Zhang Zhi-jian. Compatibility of nasal mucosa-derived ectomesenchymal stem cells and calcium phosphate cement in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(33): 5350-5355.

图/表（结果） 4

2.1 EMSCs的形态学和表面标志物鉴定 鼻黏膜组织培养3 d后开始贴壁生长，5 d后可见较多贴壁细胞；贴壁细胞呈长梭形，鱼群样，形态均匀，呈极性排列，换液时去除悬浮的细胞；纯化后的细胞贴壁速度加快，增殖能力更强，细胞呈长梭形，形态均一；免疫荧光结果显示90%的EMSCs表达nestin、vimentin和CD133，提示获得了较高纯度的EMSCs(图1)。

2.2 MTT法检测两组EMSCs增殖情况 细胞接种后，CPC材料组和对照组在前5 d内保持正常的增殖速度，两者之间无明显差异，第7天可见CPC对EMSCs增殖有促进作用，两组之间差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.3 种植于CPC的EMSCs表面标志物 鉴定免疫荧光结果显示种植于CPC的EMSCs表达nestin、vimentin和CD133，提示CPC对EMSCs干细胞特性无明显影响(图2)。

2.4 鬼笔环肽染色结果 EMSCs种植于CPC材料表面3，5，7 d后用鬼笔环肽染色液染色，第3天时EMSCs形态呈圆形，细胞形态未完全伸展；第5天时EMSCs呈长梭形；第7天时可见EMSCs成堆生长(图3)

2.5 碱性磷酸酶染色结果 种植于CPC表面和培养板的EMSCs成骨诱导7 d时，两组细胞碱性磷酸酶活性无明显差异；诱导14 d时，种植于CPC表面的EMSCs碱性磷酸酶染色较深，说明碱性磷酸酶活性较强(图4)。

2.6 钙结节染色结果 对种植于CPC表面和培养板的EMSCs成骨诱导7 d和14 d后进行钙结节染色，数据显示两组细胞成骨诱导7 d后形成的钙结节面积大小无明显差别；成骨诱导14 d后CPC组形成钙结节面积明显大于对照组(P < 0.05，表2，图5)。

2.7 免疫印迹检测结果 成骨诱导14 d时，CPC组EMSCs表达COLⅠ、OCN和OPN高于对照组，同时骨形态发生蛋白2的表达水平也高于对照组(P < 0.05，图6)。

2.8 免疫荧光染色结果 成骨诱导14 d时，CPC组EMSCs高表达COLⅠ、OPN、OCN和骨形态发生蛋白2，而对照组相对较弱(图7)。

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引言

骨缺损是骨科常见的疾病，其中大段骨缺损的治疗比较困难^[1]。目前解决骨缺损常用的治疗手段是骨移植术，植骨来源包括自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨移植及人工骨移植，但各种骨移植术都有一定的局限性。简单概括，自体骨移植疗效佳，无免疫排斥，但取骨量有限，需进行二次手术，对患者机体损伤较大；异体骨移植会发生免疫排斥反应^[2-3]。骨水泥有着良好的生物相容性，应用较多的是磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)，其具有良好的生物相容性以及骨诱导性，被广泛用作临床骨修复和骨替代材料^[4]。

鼻黏膜来源的外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells，EMSCs)为分布于头面部黏膜内的特殊类型的干细胞，来源于胚胎时期的神经嵴，在胚胎发育过程中，神经嵴细胞可迁移增殖分化为神经细胞和胶质细胞，该细胞仍保留多向分化潜能^[5-6]。鼻腔黏膜包括呼吸部黏膜和嗅部黏膜，呼吸部黏膜的取材量较大，手术取材主要集中在下鼻甲部位，操作方便，损伤性小，因此对呼吸部黏膜干细胞的研究更有应用价值^[7-8]。课题组发现体外培养的EMSCs在特定条件下可向成骨细胞分化，EMSCs能在体外大量扩增，扩增的EMSCs仍可高表达干细胞标志蛋白，并维持其干性^[9]。同时，EMSCs取材可由患者本人提供，不仅不存在医学伦理学问题，而且具有取材简便对机体无损害的特点^[10]。EMSCs作为一种优秀的种子细胞已成为国内外研究的热点。然而，临床中常用的CPC与EMSCs生物相容性以及CPC对EMSCs成骨分化的影响，一直是科研中的一项空白。实验通过体外培养EMSCs，将其种植于CPC表面，探讨CPC与EMSCs的生物相容性以及EMSCs在CPC表面向成骨细胞分化的潜在机制，为进一步的体内实验提供基础医学理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年8月至2018年1月在江苏大学医学院基础研究所2408实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验材料和试剂 CPC(固相由等摩尔质量无水磷酸氢钙和磷酸四钙组成，购自英国施乐辉公司)；胎牛血清(Gibco公司)；0.25%胰酶(Sigma公司)；DMEM/F12(Hyclone通用公司)；二巯基乙醇(北京鼎国生物科技有限公司)；Loadingbuffer(武汉博士德生物有限公司)；羊抗兔collagenⅠ(COLⅠ)，osteopontin(OPN)和osteocalcin(OCN)、羊抗鼠nestin和vimentin (武汉博士德公司)；骨形态发生蛋白2、CD133抗体(Abcam公司)；山羊抗鼠-cy3 IgG、山羊抗兔-cy3 IgG、山羊抗兔IgG HRP、山羊抗鼠IgG HRP(武汉博士德公司)；鬼笔环肽(Sigma公司)；碱性磷酸酶检测试剂盒(索来宝公司)；多聚甲醛干粉(国药有限公司)；Triton-100(北京生物化学试剂公司)。

1.3.2 实验动物 SD大鼠10只，6-8周龄，雌雄不限，体质量100-150 g，由江苏大学动物实验中心提供。

1.4 实验方法

1.4.1 CPC制备 CPC粉剂与生物活性固化液按照质量体积比例为22.5 g∶100 mL(每个试件需要粉剂0.18 g，生物活性固化液0.8 mL)混合调拌，将液态CPC平铺于培养板中，待其形成固态CPC，厚度约为0.5 mm。

1.4.2 EMSCs的分离、原代培养及传代 SD大鼠颈椎脱位，处死；于无菌操作台中分离大鼠下鼻甲，置于4 ℃ PBS中，完整取出鼻中隔并分离全层鼻黏膜，弃去鼻中隔软骨；鼻黏膜取出后用无血清DMEM/F12(含青霉素200 U/mL和链霉素200 U/mL)漂洗3次，然后用眼科剪充分剪碎，弃上清，加入0.25%胰酶37 ℃消化10 min，PBS漂洗3次，离心，去除胰酶，接种于细胞培养瓶，加入4 mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12(含青霉素100 U/mL和链霉素100 U/mL)，置于37 ℃，饱和湿度，体积分数为5%CO₂培养箱内培养，每隔2 d半量换液，当细胞铺满瓶底85%时，进行消化传代。实验选用第3代EMSCs进行以下实验。

1.4.3 EMSCs免疫荧光鉴定 取培养扩增的第3代细胞，接种于96孔板，待细胞铺满培养板底的75%时，用40 g/L多聚甲醛4 ℃固定8 h，PBS漂洗3次，每次10 min，洗去多余的多聚甲醛；然后2% BSA封闭30 min，0.1% Triton-100破膜30 min，PBS洗3遍，加入一抗(nestin，vimentin和CD133)4 ℃孵育12 h，漂洗一抗；然后加入山羊抗鼠二抗(cy3-IgG，1∶250)，37 ℃孵育1 h，DAPI染核30 min，甘油封固后于荧光显微镜下拍摄图片。

1.4.4 MTT法检测EMSCs增殖活性 将1.0×10⁴ EMSCs接种于CPC表面培养1，3，5，7，14 d，用无血清DMEM培养液冲洗，以去除未贴壁的细胞，并将材料/细胞复合物移入新的无菌培养板中，每孔加入0.01 mo1/L MTT溶液100 μL，继续培养4 h，小心吸除培养液，每孔加入500 μL二甲基亚砜，振荡10 min，取200 μL溶解液转入96孔板中，在酶联免疫测试仪上测定波长490 nm处各孔吸光度值(A值)。每组4个复孔，以EMSCs直接接种于96孔培养板底部作为对照，以上实验重复至少3遍。

1.4.5 CPC与EMSCs相容性评价 为了观察种植于CPC表面的EMSCs形态，采用鬼笔环肽染色法标记细胞外骨架。配制0.01%的鬼笔环肽染色液；取种植于CPC表面3，5，7 d的EMSCs，弃去培养基，PBS漂洗3遍，加入鬼笔环肽工作液，37 ℃作用30 min，甘油封固，于荧光显微镜下观察EMSCs形态；然后取种植于CPC表面7 d的EMSCs，采用免疫荧光法检测nestin，vimentin和CD133的表达，具体操作步骤见1.4.3。

1.4.6 成骨诱导分化方法 取生长状况良好的EMSCs，以1×10⁸ L^-1细胞浓度接种于铺有CPC的6孔细胞培养板和48孔细胞培养板，以将EMSCs直接种植于培养板作为对照组，当细胞铺满培养板底的85%时，弃去培养液，PBS洗2次，加入足量的成骨诱导培养基(含10 mmol/L β-磷酸甘油钠、25 μg/L抗坏血酸、体积分数为15%胎牛血清及0.1 µmol/L地塞米松的DMEM)，每7 d换液。

1.4.7 碱性磷酸酶活性检测 按照试剂盒说明书配制工作液，取成骨诱导培养7 d和14 d种植于CPC表面和培养板(对照组)的EMSCs，弃去培养液，PBS漂洗3次，加入工作液，37 ℃作用1 h，甘油封固，于显微镜下观察染色情况，并拍摄图片。

1.4.8 钙结节染色 配制0.3%的茜素红染液；取成骨诱导培养7 d和14 d种植于CPC表面和培养板(对照组)的EMSCs，40 g/L多聚甲醛固定20 min，ddH₂O小心漂洗3次；干燥；加入适量的0.3%茜素红染液，作用30 min；弃去染液；再次干燥；甘油封固，倒置显微镜直接观察细胞外钙盐沉积情况并拍摄图片，采用Image-Proplus软件计算形成钙结节的面积。

1.4.9 免疫印迹方法检测骨相关蛋白表达 取成骨诱导培养14 d种植于CPC表面和培养板(对照组)的EMSCs，PBS洗3遍，每孔中加入含有1%蛋白酶抑制剂的裂解液100 μL置于冰上1 h，然后轻轻刮取置于EP管中；在4 ℃下10 000 r/min离心10 min，吸取上清液煮沸后-20 ℃保存；加样品于10% SDS-PAGE电泳分离蛋白样品，350 mA恒流转膜90 min，PVDF用3%脱脂奶粉封闭1 h；将膜分别与对应的一抗COLⅠ(1∶500)、OCN (1∶500)、OPN(1∶500)、骨形态发生蛋白2(1∶500)和β-tubulin(1∶500) 4 ℃孵育12 h，TBST漂洗3次，10 min/次；然后加入抗兔或抗鼠IgG-HRP (1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，TBST漂洗3次，10 min/次；用超敏形ECL发光液显示阳性条带，在Typhoon系统上扫描结果，Image J软件分析灰度值。

1.4.10 免疫荧光染色观察骨相关蛋白表达 取成骨诱导培养14 d种植于CPC表面和培养板(对照组)的EMSCs，进行免疫荧光染色标记骨相关蛋白，具体操作步骤见1.4.3。

1.5 主要观察指标 ①CPC对EMSCs增殖能力的影响；②在成骨诱导培养条件下，CPC表面EMSCs表达骨相关蛋白COLⅠ、OCN和OPN水平；③在成骨诱导培养条件下，CPC表面EMSCs的碱性磷酸酶活性以及形成的钙结节面积大小；④鬼笔环肽标记种植于CPC表面的EMSCs形态。

1.6 统计学分析 使用SPSS 22.0统计学软分析，计量资料用x(_)±s表示，统计学方法采用配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

CPC具有良好的骨诱导能力且能吸收并被新骨取代，因此拥有广泛的临床应用前景^[11]。1996年，美国食品与药品监督管理局(FDA)批准通过了CPC用于修复人类颅颌面缺损，首次正式将CPC应用于临床^[12]。有研究报道，将人骨髓间充质干细胞接种在固定密度的CPC表面^[13]，结果显示人骨髓间充质干细胞在CPC表面附着、增殖、分化良好，这说明CPC具有良好的生物相容性^[14-15]。

EMSCs主要来源鼻部黏膜，在以往的研究中，作者发现此类细胞不仅可以在体外定向诱导为成骨细胞、神经样细胞、少突胶质细胞、脂肪细胞等^[7]，而且EMSCs可稳定传代至10代并且保持良好的干细胞特性，这些优点表明EMSCs能成为细胞治疗和组织工程人工骨构建的理想种子细胞。CPC是临床最常用的骨水泥，将载EMSCs的CPC构建成为人工骨，可为骨缺损带来新的治疗方法。然而，CPC与EMSCs生物相容性尚未知，此次研究将EMSCs种植于CPC表面，采用鬼笔环肽染色法动态观察EMSCs生长情况，结果显示种植第3天的EMSCs仅仅附着在CPC表面，形态呈圆球状；持续培养5 d，EMSCs已完全呈现原有的细胞形态；7 d后发现EMSCs开始发生成堆聚集现象，这说明CPC与EMSCs具有较好的生物相容性。进一步对种植于CPC表面的EMSCs进行免疫荧光标记其表面标志物，结果显示，EMSCs仍然高表达间充质干细胞和神经嵴细胞标志物vimentin和nestin^[16-17]，与此同时，CD133的表达水平未发现明显改变，说明CPC对EMSCs干细胞特性无明显影响^[18]。

MTT法是检测对比活细胞数的比较敏感的常规方法^[19]，MTT实验数据表明CPC可促进EMSCs增殖；碱性磷酸酶活性是决定成骨细胞分化的生物化学标志之一^[20-21]，也是决定骨分化和骨矿化的一个重要因素，在成骨诱导实验中，种植于CPC表面的EMSCs碱性磷酸酶活性较强，茜素红染色则被认为是判断成骨分化的“金标准”^[22]，在实验研究中，作者发现种植于CPC表面的EMSCs形成的钙结节面积较大，较强的碱性磷酸酶活性和钙结节大小说明CPC可促进EMSCs向成骨细胞分化。为了进一步确认CPC可促进EMSCs向成骨细胞分化，获得成骨诱导14 d的两组细胞蛋白进行免疫印迹分析成骨相关蛋白表达水平，数据显示种植于CPC的EMSCs COLⅠ、OPN和OCN表达水平明显高于对照组；COLⅠ是有机骨的主要成分，OPN和OCN则是成骨细胞代谢的生化标志物^[23-24]。另外，实验发现种植于CPC表面的EMSCs经成骨诱导后，可以分泌更多的骨形态发生蛋白2，众所周知，骨形态发生蛋白2可有效促进各类间充质干细胞向成骨细胞分化^[25-26]。综合实验结果，课题组考虑CPC促进EMSCs向成骨细胞分化的原因可能为CPC表面凹凸不平，使得EMSCs更易附着^[27]。与此同时，作者发现CPC表面物质可以有效促进EMSCs分泌骨形态发生蛋白2，可能是促进种植于CPC表面EMSCs持续、安全地向成骨细胞分化的原因之一。然而，CPC上调骨形态发生蛋白2表达水平的具体机制，还有待于进一步研究。

综上所述，EMSCs与CPC具有良好的生物相容性，CPC材料可以作为EMSCs的良好载体，为进一步的动物实验及临床应用提供理论依据。

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.