人新型脱细胞真皮制备及性状分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.07.013

摘要/Abstract

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文题释义：

脱细胞真皮基质生物材料技术特点：采用复合酶溶液法脱表皮，仅用三四小时就能将表皮和真皮完全分离；超声技术脱细胞，两三小时将细胞破碎后去除；采用胰蛋白酶和超声联合作用修饰空间结构，增加胶原纤维间隙，提高植入后血管化速度；戊二醛溶液对细胞外基质进行交联及甘氨酸溶液中和等方法，制成的脱细胞猪真皮基质，完全去除了细胞成分，免疫原性低，生物相容性好。

背景：早期快速血管化是创面修复的关键。高孔隙率、大孔径的真皮支架可以促进种子细胞更快更好的黏附、生长、迁移并促进创面修复中血管化的快速形成。

目的：通过改良人脱细胞真皮基质制备方法，以期得到孔隙率高、细胞渗透性更好、组织相容性良好的同种异体皮。

方法：健康成人皮肤，分别用传统方法及改良方法脱去细胞成分。改良方法采用无菌条件下剪除皮下脂肪组织，1 mol/L NaCl溶液37 ℃ 24 h，去表皮，2%NaOH 45 ℃摇床处理4 h，PBS冲洗至溶液成中性，冷冻干燥，4 ℃保存备用。对两种方法制备脱细胞真皮基质孔隙率、体外降解时间的差异及材料浸润液对脂肪干细胞毒性进行检测；苏木精-伊红染色、扫描电镜检测其脱细胞效率、胶原完整性、脂肪干细胞细胞相容性及支架孔隙等。

结果与结论：两种处理方法均可完整脱去细胞成分，并较好保持胶原支架的完整性；改良型脱细胞真皮基质孔隙率达(93.22±0.99)%明显高于传统(74.28±2.06)%(P < 0.001)；体外降解时间无明显差异(P > 0.05)；改良方法制备脱细胞真皮材料浸润液对干细胞无明显细胞毒性；改良脱细胞真皮基质基底面接种细胞3-7 d后细胞可突破基底层并迁移、游走至真皮深面，传统脱细胞真皮基质中细胞在基底面单-复层生长，无明显真皮浸润。结果提示新型脱细胞真皮基质拥有较传统脱细胞真皮基质更大的孔径、孔隙率，更适合细胞的浸润生长。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-0269-5040(金培生)

关键词: 组织构建, 组织工程, 脱细胞真皮, 种子细胞, 干细胞, 脂肪干细胞, 生物支架, 组织相容性, 创面修复, 组织工程皮肤

Abstract:

BACKGROUND: Early vascularization is crucial for wound healing. A high-porosity, macrovoid allogeneic skin leads to the rapid vascularization and cellular infiltration.
OBJECTIVE: To obtain a new allogeneic skin product with high porosity, good cell permeability and good histocompatibility using an improved preparation method of human acellular dermal matrix.
METHODS: Cell components of healthy human skins were removed by the improved method and the traditional method, respectively. The improved method was to remove the subcutaneous fat, eliminate the epidermis (1 mol/L NaCl solution at 37 ℃ for 24 hours) followed by shaking processing (2% NaOH at 45 ℃ for 4 hours), and then, the solution was neutralized with PBS rinsing, dried and stored at 4 ℃ for standby. We detected the porosity and degradation time in vitro of the acellular dermal matrices prepared by two methods and the cytotoxicity of the material infiltration liquid on the adipose-derived stem cells. Hematoxylin-eosin staining was used for the detection of the cell residual, the integrity of collagen and cell biocompatibility. Scanning electron microscopy was used to detect the pore size.
RESULTS AND CONCLUSION: Both the two methods could completely remove the cell components, and maintain the integrity of the collagen scaffold. The porosity of acellular dermal matrix with the improved method was (93.22±0.99)%, which was significantly higher than that with the traditional method [(74.28±2.06)%; P < 0.001]. However, there was no significant difference in in vitro degradation time between the two kinds of acellular dermal matrices (P > 0.05). No obvious cytotoxicity of the acellular dermal matrix prepared with the improved method was detected. At 3-7 days of co-culture, the adipose-derived stem cells cultured on the acellular dermal matrix prepared with the improved method could penetrate the basement membrane to the deep dermis, while there was no obvious cell invasion and growth in the deep dermis prepared by the traditional method. Compared with the traditional method, the improved method is more suitable for cell infiltration and growth with higher porosity and larger pore size.

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图/表（结果） 5

2.1 脱细胞真皮基质理化性质观察传统脱细胞真皮基质大体观呈乳白或微黄色、质地柔软，表面可见致密毛囊开孔，见图1a。改良型脱细胞真皮基质乳白或微黄色、疏松均质状，表面可见明显疏松孔隙，见图1b。两种脱细胞真皮基质苏木精-伊红染色均未见蓝染细胞核，且胶原纤维完整，改良型较传统脱细胞真皮基质胶原纤维结构更加疏松，孔隙大小均匀，胶原纤细均匀，见图1c，d。

传统脱细胞真皮基质与改良脱细胞真皮基质孔隙率比较，根据公式Ⅰ的计算结果：孔隙率由传统的(74.28± 2.06)%逐渐增加到(93.22±0.99)%，差异有显著性意义(t=14.333，P < 0.001)，材料体外降解时间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2。

2.2 材料浸润液细胞毒性 CCK-8 检测2，4，6 d各实验组与空白对照组A值之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。各实验组浸润液的毒性等级均在0-1级之间(表2)，说明实验制备的人脱细胞真皮基质符合人体生物材料植入人体要求。

2.3 脱细胞真皮基质的细胞相容性及细胞渗透性检测接种P4脂肪干细胞，3，7 d见细胞在传统脱细胞真皮基质基底膜面生长，无明显真皮内浸润，见图4a，b。新型脱细胞真皮基质接种3，7 d后干细胞可突破基底层浸润生长，并且随时间增加，浸润深度逐渐增大，细胞数目明显增多，见图4c，d。

2.4 脱细胞真皮基质孔隙大小比较扫描电镜下可见脱细胞真皮基质胶原纤维完整，分布均匀，排列整齐。新型脱细胞真皮基质较传统脱细胞真皮基质孔隙率高，孔腔直径大，胶原纤维纤细、粗细均匀，见图5a-d。

两种脱细胞真皮基质真皮网状面孔径差异有显著性意义(P < 0.05)。基底层面孔径差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5e。

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引言

材料方法

1.1 设计组织工程皮肤体外构建实验。

1.2 时间及地点 2014年10月至2015年7月在徐州医学院中心实验室完成。

1.3 材料皮肤、脂肪取自徐州医学院附属医整形外科、甲乳科。经医院伦理委员会批准。入选年龄23-45岁，排除传染性、皮肤病变，供者对实验过程完全知情同意。

试剂：NaCl、NaOH(上海国药)；PBS(北京中杉金桥)；DMEM-L(美国Gibco)；双抗、胰酶(上海碧云天)；Ⅰ型胶原酶(美国Sigma)；FBS(澳洲Gibco)；CO₂培养箱(美国Thermo JA3003N)；电子天平(上海精科)；冷冻干燥机(日本日立)；Quanta250扫描电镜(美国FEI)。

1.4 实验方法

1.4.1 传统脱细胞真皮基质制备参照文献[2，8-9]方法制备脱细胞真皮基质，无菌条件下剪除皮下脂肪组织，1mol/L NaCl溶液37 ℃ 24 h去表皮，2% NaOH 37 ℃ 16 h，PBS冲洗至溶液成中性，-80-37 ℃反复冻融4次，4 h/次。冷冻干燥机冻干，4 ℃保存备用。

1.4.2 改良脱细胞真皮基质制备无菌条件下剪除皮下脂肪组织，1 mol/L NaCl溶液37 ℃ 24 h，去表皮，2% NaOH 45 ℃摇床处理4 h，PBS冲洗至溶液成中性。冷冻干燥，4 ℃保存备用。

1.4.3 体外降解时间测定冷冻干燥后称0.02 g脱细胞真皮基质，1.0 mL胶原酶37 ℃消化至液体完全澄清，记录时间。

1.4.4 孔隙率测定冷冻干燥后称质量(m₁)，精确至0.001 g，置入50 mL含体积分数75%的乙醇离心管。抽真空至不再有气泡溢出，称含有乙醇和支架材料离心管(m₂)，将含有乙醇的支架材料取出，称剩余的乙醇及离心管(m₃)。

按公式(Ⅰ)计算孔隙率(P)：

1.4.5 细胞毒性检测参考Zuk^[10]及课题组前期实验方法提取脂肪干细胞^[11-12]。脱细胞真皮基质以含体积分数10% FBS的DMEM-L37 ℃孵育48 h后提取材料浸润液。P3 脂肪干细胞以4 000/孔密度接种于96孔板， 37 ℃恒温培养24 h后分别加入100%、50%浓度材料浸润液、体积分数10% FBS的DMEM-L 100 μL。加样后2，4，6 d行CCK-8细胞毒性检测。

按公式(Ⅱ)计算细胞相对增殖率(relative growth rate，RGR)：

根据《非直接接触血液的医用生物材料生物性能测试标准》6级毒性分级法(表1)，评定改良脱细胞真皮基质材料浸润液细胞毒性，评级≥2级判定材料存在细胞毒性。

1.4.6 苏木精-伊红染色及生物相容性脱细胞真皮基质置于40 g/L多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，树脂封固，光镜下观察并拍照。

P4 脂肪干细胞以2×10⁴/孔接种于提前浸泡完全培养基48 h的脱细胞真皮基质，孵育3，7 d后甲醛固定，苏木精-伊红染色。

1.4.7 扫描电镜检测孔隙率脱细胞真皮基质以3%戊二醛固定4 ℃过夜，PBS冲洗10 min 3次，梯度乙醇脱水，梯度乙醇+六甲基二硅氨烷脱乙醇，冷冻干燥、喷金，上机检测。

1.5 主要观察指标 ①脱细胞真皮基质的结构及理化特征。②脱细胞真皮基质体外细胞毒性及生物相容性。

1.6 统计学分析实验数据用SPSS 16.0分析处理，数据采用x(_)±s表示，两样本统计结果独立样本t 检验，各组间A值进行单因素方差分析，结果均以P 值表示，P < 0.05认为差异有显著性意义。

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讨论

文献显示，人工真皮Integra和Dermagraft的胶原孔径大小0-150 μm、孔隙率为95%以上时比较适合细胞渗透、组织长入及早期血管化^[13]，从而可以高效的促进创面愈合。提示高孔隙率及大孔径可以促进血管化快速形成，而早期快速血管化又是创面愈合的关键，血管化不良的真皮创面床成为导致上皮化失败的主要原因^[14]。人脱细胞真皮基质与人工真皮相比，其供区来源广泛，保留了原有正常胶原三维结构及基底膜成分，易于血管化，与异体真皮相比，去除了引起免疫反应的表皮和真皮层细胞成分，抗原性低，移植后几乎不发生排斥反应，且生物亲和性强，降解速度适中，并可以与自体细胞结合紧密，为细胞的黏附、生长、繁殖提供一个良好的支架，能促进血管化及创面早期愈合的发生^[2]，是目前组织工程皮肤主要的研究材料。但其存在孔隙率低，孔隙多为非贯通性，细胞渗透性差等问题，均影响到细胞的浸润生长^[15]。

传统的反复冻融法、碱消蚀法、酶消化法、化学交联法、高渗盐水法、去污剂法等制备方法结果证实单一方法往往难以将皮肤内所有的细胞和细胞碎片清除，目前采用多种方法相结合的方式制备一个较理想的支架材料。现在认为理想的真皮支架材料应具备相对完整的三维结构，有利于宿主细胞、血管的迁徙浸润及组织再生，而且应该保持一个良好的低免疫原性，移植后不会引起明显宿主炎症反应，并最终形成类似原组织的结构^[16]。

本课题组前期进行了大量异种脱细胞真皮基质及不同年龄阶段患者脱细胞真皮基质实验^[15^，^17]，并证实传统方法制备脱细胞真皮基质普遍存在孔隙率低、孔腔直径小、孔隙多为非贯通性，细胞渗透性差等问题。如何增加脱细胞真皮基质的孔隙率及孔径，使其结构更为疏松，以利于细胞的长入一直是本课题组研究的重点内容。前期研究结果表明老龄化皮肤脱细胞真皮基质较青年人疏松，孔隙率更高，主要考虑为皮肤老化后，胶原的分解增加、合成减少导致含量大量减少，真皮萎缩且纤维的空间结构改变，纤维老化、缩短、数目减少。这一研究提示通过物理或化学方法溶解部分胶原或者缩短胶原的长度，最终将结构致密的脱细胞真皮基质转变为更加疏松的胶原支架。

查阅文献发现，温度对真皮支架胶原结构具有明显的影响，胶原纤维经加热后，会产生不可逆收缩，这提示可以通过加热缩短胶原纤维长度来获得更为疏松的真皮支架。但有文献表明当加热至63-65 ℃，纤维长度变为原长九分之一，继续加热胶原分子的3股螺旋破坏，变性分解成为明胶从而失去其天然孔隙及其支架作用^[18]。Sun等^[19]应用二次谐波显微镜研究发现加热至54 ℃时胶原可能发生热变性，因此设定合适的温度尤为重要，经过多次重复试验筛选，作者选择45 ℃温度处理人脱细胞真皮基质，这一温度可以缩短胶原的长度，疏松胶原结构，但是不会改变胶原的三维空间结构，不会导致胶原永久变性。研究表明碱法控制对真皮孔径也存在较为明显的影响，胶原蛋白在一定浓度的碱液下会出现部分溶解，随着浓度的增加脱细胞真皮基质疏松程度逐渐增大^[20]。实验中作者发现45 ℃的水温加入2%NaOH可以快速获得疏松多孔的脱细胞真皮基质，提高制备的效率。因此本实验选取对人脱细胞真皮基质胶原比较稳定的45 ℃及适宜的NaOH浓度作为控制条件，成功构建一个大孔径、高孔隙率，降解时间与传统方法无明显差异的海绵状真皮支架。实验结果表明，新方法处理过的脱细胞真皮基质的孔隙率高于传统方法，改良脱细胞真皮基质孔隙率达(93.22±0.99)%高于传统脱细胞真皮基质(74.28±2.06)%，孔隙大小69-181 μm，且CCK-8检测无明显细胞毒性，而且其降解速度之间无显著差异，符合人工真皮的血管化要求。接种干细胞后见细胞在改良脱细胞真皮基质基底膜面黏附、生长、增殖，共培养7 d后可见真皮深部脂肪干细胞浸润。

Zuk等^[21]从脂肪抽吸液中获得脂肪来源干细胞称之为脂肪干细胞，并证实脂肪干细胞具有类似骨髓间充质干细胞样多向分化能力^[5]，在体外能向脂肪细胞、软骨细胞、表皮细胞、成骨细胞等多向分化^[2]，而且较之骨髓间充质干细胞含量丰富(1×10⁶/g)、取材简单、方便、创伤小、来源广泛^[22]。因此脂肪干细胞被认为组织工程研究中最有前景的种子细胞。课题组前期对脂肪干细胞进行表型鉴定、成脂、成骨、成表皮、成血管及其通路等进行了多方面研究^[12^，^23-25]，而且脂肪干细胞在创面修复中的作用不断被证实^[26-27]。脂肪干细胞可以促进创面的血管化、细胞外基质沉积^[28-29]，联合支架在创面修复和组织工程皮肤^[2^，^30]、脂肪及组织工程骨的构建方面有良好的前景。在此次实验中，作者将脂肪干细胞成功接种到脱细胞真皮基质上，通过对比试验证实，脂肪干细胞可以广泛迁入新型改良真皮支架内部。结果证明实验制备的新型高孔隙率、大孔径的脱细胞真皮基质可以作为携带种子细胞的良好生物支架材料。

实验研究表明，新型改良方法制备脱细胞真皮基质较传统脱细胞真皮基质具有更高的孔隙率，更大的孔径，脂肪干细胞可以广泛迁入支架内部而无明显细胞毒性，且与传统脱细胞真皮基质相比其完全降解时间无明显差异。本次实验是对新型脱细胞真皮基质制备方法的可行性、理化性质及组织相容性的初步研究，进一步结构改良和临床应用尚需要更多基础、临床试验和相关动物实验研究来协助完成，为临床难治性面积创面修复提供一种高效的组织工程支架材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程