Wnt/β-catenin信号通路对子宫内膜间质细胞的调节机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.07.014

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

Wnt信号通路：是对控制发育起重要作用的信号途径，信号转导过程发生异常或障碍，会导致细胞生长、分化、代谢及生物学异常，通路异常与多种疾病有关。经典的Wnt信号转导途径通过β-catenin核易位，激活靶基因的转录活性，其靶基因包括参与细胞发育、细胞增殖及细胞迁移的相关因子，如c-myc、细胞周期素蛋白D1(cyclin D1)、CD44、基质裂解蛋白、基质金属蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活物受体等。

子宫内膜干细胞与子宫内膜再生：子宫内膜干细胞在体外和体内实验中均显示出具有子宫内膜再生和修复功能。将人子宫内膜上皮干细胞和间充质干细胞接种到免疫缺陷小鼠肾包膜下，可以产生子宫内膜层和肌层组织。在卵巢切除的免疫缺陷小鼠中，再生的内膜有腺样结构、基质及肌层样组织，这些研究表明子宫内膜干细胞可能在子宫内膜的正常变化周期中发挥着重要作用。

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ORCID: 0000-0001-6522-1267(陈镘如)

关键词: 组织构建, 组织工程, 子宫内膜, 子宫内膜异位症, Wnt/&beta, -catenin信号通路

Abstract:

BACKGROUND: Increasing number of genes and signaling pathways are involved in regulating stem cells periodically, and wherein Wnt/β-catenin signaling pathway is an important pathway of stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the effects of Wnt/β-catenin signal pathway on mouse endometrial stromal cells.
METHODS: After injection of Wnt/β-catenin pathway inhibitor or activator, endometrial tissues from Balb/c mice were obtained, some of which were used for detection of invasion of endometrial stromal cells and western blot detection, and the rest of which were used for preparing animal models of endometriosis followed by immunohistochemical detection.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of β-catenin and GSK3β proteins was significantly higher in the activator group than the inhibitor group (P < 0.05). The number of transmembrane cells was significantly higher in the activator group than the inhibitor and control groups (P < 0.05). Immunohistochemical findings showed positive expression of E-cadherin in ectopic endometrial tissues of the inhibitory group, and strongly positive expression of vascular endothelial growth factor in ectopic endometrial tissues of the activator group. These findings indicate that Wnt/β-catenin signaling pathway may cause endometriosis by strengthening ectopic endometrial implantation, invasion and metastasis.

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年8至10月在四川省人民医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 Balb/c雌性小鼠30只，8周龄，体质量约40 g，由南京君科生物工程有限公司提供。无胸腺裸鼠15只，雌性，8周龄，体质量约25 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.3.2 主要试剂与仪器 Wnt-7a(美国Sigma公司)，SFRP-1(美国Gibco公司)，β-catenin、GSK 3β单克隆抗体(武汉博士德公司)，BCA蛋白测定试剂盒(上海西宝生物科技有限公司)，水合氯醛(上海北诺生物科技有限公司)，免疫组织化学染色试剂盒(武汉博士德公司)，血管内皮生长因子单克隆抗体(天津赛尔生物技术有限公司)，中性甲醛(上海子起生物科技有限公司)，Boyden侵袭小室(美国 BD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 Wnt/β-catenin信号通路调控位点选择与在位内膜干预^[5]30只Balb/c小鼠随机分为3组，每组10只，分别设为对照组、激活组、抑制组。激活组与抑制组经小鼠尾静脉注射Wnt-7a(0.02 mg/L Wnt-7a中添加BSA)或SFRP-1(0.05 mg/L SFRP-1中添加二甲基亚砜)0.3 mL，实施Wnt/β-catenin信号通路激活和阻断。每隔2 d注射1次，15 d后麻醉小鼠然后处死，获取子宫内膜组织。

1.4.2 蛋白免疫印迹法检测Balb/c小鼠子宫内膜组织中β-catenin、GSK3β蛋白的表达严格按照试剂盒说明书进行操作，用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量分析，SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭1 h，添加一抗4 ℃孵育过夜，添加辣根过氧化物酶标记的二抗室温封闭孵育1 h，添加化学发光剂，经显影、定影后用图像分析仪检测各条带的吸光度值。

1.4.3 子宫内膜间质细胞分离与培养收集上述获得的子宫内膜组织，D-Hank’s液冲洗后用眼科剪切成1 mm× 1 mm×1 mm大小，用含有300 g/L胶原酶Ⅲ和40 g/L脱氧核糖核酸酶Ⅰ的PBS，在37 ℃，150 r/min振荡培养箱内消化，用200目滤网过滤后离心，收集沉淀重悬于DMEM/F12培养液，接种于25 cm的培养瓶中，置于 37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱孵育，观察细胞生长情况，每3 d换液1次，去除未贴壁细胞，收集第3代子宫内膜间质细胞，保存备用。

1.4.4 子宫内膜间质细胞侵袭能力检测通过Transwell侵袭小室实验检测内膜间质细胞的侵袭能力。用Matrigel稀释液均匀包被Transwell小室膜内侧面，上室内加入对数生长期的内膜间质干细胞悬液 100 μL(细胞浓度为1×10⁸ L^-1)，下室内加入DMEM/F12完全培养基，于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱培养24 h，取出小室，剪下微孔滤膜，1%结晶紫溶液染色20 min，随机选取3个视野，计数穿膜细胞数。

1.4.5 子宫内膜异位模型制备与组织学检测^[6] 将15只裸鼠随机分为激活组、抑制组和对照组，每组5只，腹腔注射水合氯醛麻醉后，于腹正中切开0.5-1.0 cm纵行切口，分别取Wnt-7a或SFRP-1或PBS干预后的Balb/c小鼠子宫组织，置入裸鼠腹腔中。移植后肌肉注射苯甲酸雌二醇(30 μg/kg)，每3 d注射1次。14 d后脱颈处死，获得异位内膜组织标本，中性甲醛固定后免疫组织化学检测E-钙黏素蛋白、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶9表达情况。

1.5 主要观察指标 ①Balb/c小鼠子宫内膜组织中β-catenin、GSK3β蛋白的表达。②子宫内膜间质细胞侵袭能力。③裸鼠异位内膜组织E-钙黏素蛋白、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶9的表达。

1.6 统计学分析使用SPSS 18.0进行统计分析，组间比较予以单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

近年随着子宫内膜异位症病因学研究的不断深入，子宫内膜中存在干细胞且这些干细胞参与子宫内膜周期性活动的观点得以提出并陆续被验证。从干细胞理论角度进行分析，子宫内膜干细胞与子宫内膜修复与再生之间存在十分密切的联系^[7-11]。1978年Prianishnikov等^[12]通过研究首次指出，在子宫内膜中存在子宫内膜干细胞，可以对子宫内膜功能层的增生修复产生重要的影响。Gargett等^[13]利用正常女性子宫内膜组织进行体外培养，发现在子宫内膜间质细胞、上皮细胞中均存在干细胞，并认为干细胞可能是促进子宫内膜再生的重要原因。

Wnt是一种糖蛋白，富含半胱氨酸，通过自分泌和旁分泌的形式存在^[14]。Wnt蛋白可以通过一系列的效应因子和(或)其他信号通路对下游基因产生影响，调节相应基因的表达^[15-18]。Wnt信号通路具有高度保守性，β-catenin在Wnt信号通路开放过程中发挥出重要的调控作用。另外，Wnt信号通路的激活、失调还与多种疾病之间存在十分紧密的联系^[19-22]。在正常的成熟细胞中β-catenin以3种方式存在，大多数β-catenin与由细胞膜向细胞内伸出的E-cadherin结合，少部分游离β-catenin存在于细胞内，剩余β-catenin与APC，GSK3β等组成多聚蛋白降低复合体泛素化后被降解。足量、结构稳定且具有可溶性的β-catenin是调节Wnt信号通路的开关。通过检测细胞内β-catenin表达水平可以判断Wnt/β-catenin信号通路的激活情况，GSK3β是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，起到破坏多聚蛋白降解复合体的关键作用^[23-25]。朱利利等^[26]通过研究证实，Wnt/β-catenin信号通路与多种妇科肿瘤疾病的发生和发展以及预后转归等关系密切。Kandoth等^[27]也通过研究指出，与正常对照组比较，子宫内膜癌组细胞会出现β-catenin 明显聚集^[28-34]。实验结果显示，激活组GSK 3β、β-catenin蛋白表达量均显著高于抑制组 (P < 0.05)，可见GSK3β与β-catenin蛋白表达水平上升会激活Wnt/β-catenin信号通路。在激活状态下，Wnt/β-catenin信号通路会对下游靶基因产生调节作用^[35-38]。经细胞侵袭能力检测，激活组穿膜细胞数显著高于抑制组和对照组(P < 0.05)，通过激活Wnt/β-catenin信号通路可促进子宫内膜的异位黏附、侵袭。Wnt/β-catenin信号通路主要通过激活其下游靶基因，包括原癌基因和E-钙黏素蛋白以及基质金属蛋白酶等，调控Wnt信号靶基因的转录。经裸鼠异位内膜组织学检测，激活组内膜E-钙黏素蛋白呈阴性表达，血管内皮生长因子蛋白呈强阳性表达，基质金属蛋白酶9在腺体呈阴性表达，在间质有表达。结果表明，Wnt/β-catenin通路激活后，可以促进子宫内膜的异位黏附、侵袭和转移，从而促进子宫内膜异位症的发生。

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