细胞胆固醇外流率的测定以及细胞外胆固醇和脂多糖对其的抑制作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.07.012

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

脂多糖的结构特征：脂多糖是脂质和多糖的复合物；为革兰阴性细菌外璧层中特有的一种化学成分，相对分子质量大于10 000，结构复杂，在不同类群、甚至菌株之间都有差异。以沙门氏菌为例，其脂多糖由核心多糖、O-多糖侧链、和类脂A组成。为革兰阴性细菌细胞壁的主要成分，脂多糖是内毒素和重要群特异性抗原(O抗原)。

脂多糖：由3部分组成，与磷脂相似，有一亲水头和一疏水尾。脂质A(Lipid A)为构成内毒素活性的糖脂，以共价键联结到杂多糖链，有两部分：一是核心多糖，在有关的株内是恒定的；另一O特异性链(O-specific chain)是高度可变的。大肠杆菌的脂多糖在实验室免疫学中是常用的B细胞促分裂因子即多克隆活化因子(polyclonal activator)。

背景：胆固醇与动脉粥样硬化等疾病的发生、发展密切相关。目前研究细胞胆固醇动态变化的方法有局限性。

目的：通过BODIPY-Cholesterol标记RAW 264.7小鼠巨噬细胞，检测细胞胆固醇的外流率，并研究细胞外胆固醇浓度和脂多糖对其的影响。

方法：RAW264.7细胞采用含有体积分数10%FBS的DMEM培养基体外培养，再用0.025 mmol/L的BODIPY-Cholesterol标记细胞1，2，4，8 h，以无血清DMEM洗涤细胞后，再孵育细胞6，12，24，48，96 h，优化标记细胞的时间及孵育时间。分别采用胆固醇、脂多糖、异常高胆固醇人血清和正常胆固醇人血清处理细胞，再对其胆固醇外流率进行测定和比较。

结果与结论：BODIPY-Cholesterol标记细胞2-8 h后，测定胆固醇外流率的结果较好。RAW 264.7小鼠巨噬细胞经过BODIPY-Cholesterol荧光染料标记2 h后，测定胆固醇外流率，发现其随外加胆固醇浓度(0.1，0.5，2.5 mmol/L)的增大呈递减趋势(P < 0.01)。脂多糖刺激后细胞的胆固醇外流率降低(P < 0.05)。采用高胆固醇人血清处理细胞后，胆固醇的外流率降低(P < 0.05)。结果说明，利用BODIPY-Cholesterol可以定量测定细胞胆固醇外流率，并能研究环境中胆固醇和脂多糖对其的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-5583-6257(刘杰)

关键词: 组织构建, 组织工程, 胆固醇外流率, RAW 264.7, BODIPY-Cholesterol, 脂多糖

Abstract:

BACKGROUND: Cholesterol is closely linked to the occurrence and progression of atherosclerosis. Current approaches to study cellular cholesterol dynamics have their own limitations.
OBJECTIVE: To measure the cholesterol efflux rate of RAW 264.7 mouse macrophages by BODIPY-Cholesterol labeling and to explore the effects of extracellular cholesterol and lipopolysaccharide on the cholesterol efflux rate.
METHODS: RAW 264.7 cells were cultured in vitro with DMEM containing 10% fetal bovine serum, and labeled with BODIPY-Cholesterol for 1, 2, 4, 8 hours. Then, the cells were rinsed with serum-free DMEM and inoculated for 6, 12, 24, 48, 96 hours to optimize the labeling time and incubation time. We measured and compared the cholesterol efflux rates after cultured cells were treated with cholesterol, lipopolysaccharide, human sera with high cholesterol or human sera with normal cholesterol.
RESULTS AND CONCLUSION: The best labeling time for BODIPY-Cholesterol was 2-8 hours. Cholesterol efflux rates were gradually decreased after the cells that were labeled for 2 hours were incubated with increasing concentrations of cholesterol (0.1, 0.5, 2.5 mmol/L, P < 0.01). Treating cells with lipopolysaccharide also decreased the cholesterol efflux rate (P < 0.05). Furthermore, the cholesterol efflux rate was decreased after cells were treated with human sera with high cholesterol (P < 0.05). These findings indicate that BODIPY-Cholesterol can be used to measure cellular cholesterol efflux rate and to study the effects of extracellular cholesterol and lipopolysaccharide on the cholesterol efflux rate.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

刘杰，郑云梅，田志辉，常光明，李海东. 细胞胆固醇外流率的测定以及细胞外胆固醇和脂多糖对其的抑制作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(7): 1000-1005.

Liu Jie, Zheng Yun-mei, Tian Zhi-hui, Chang Guang-ming, Li Hai-dong. Inhibitory effects of extracellular cholesterol and lipopolysaccharide on cellular cholesterol efflus[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(7): 1000-1005.

图/表（结果） 4

2.1 BODIPY-Cholesterol测定胆固醇外流率用BODIPY-Cholesterol荧光染料标记RAW 264.7细胞1，2，4，8 h后，洗去多余的染料，再以无酚红的培养基孵育0，6，12，24，48，96 h后，测定胆固醇外流率。见图1。BODIPY-Cholesterol标记细胞1 h后，胆固醇的外流率随着孵育时间延长而增加，但是在12 h左右趋于平缓，96 h后有下降趋势。BODIPY-Cholesterol标记细胞2，4，8 h后，胆固醇的外流率随着孵育时间呈递增趋势。

2.2 细胞外胆固醇对细胞胆固醇外流的抑制作用 RAW 264.7小鼠巨噬细胞经过BODIPY-Cholesterol荧光染料分别标记2，8 h，洗过之后，再以0.1，0.5， 2.5 mmol/L的胆固醇处理48 h，测定胆固醇外流率。见图2。BODIPY-Cholesterol标记细胞2 h后测定的胆固醇外流率随着加入的胆固醇浓度的增加呈递减趋势(P < 0.01；图2A)，而BODIPY-Cholesterol标记细胞8 h后测定的胆固醇外流率随着加入的胆固醇浓度的增大无明显的变化趋势(P > 0.05；图2B)。

2.3 脂多糖对细胞胆固醇外流的抑制作用 RAW 264.7小鼠巨噬细胞经过100 μg/L脂多糖刺激2 d后，用BODIPY- Cholesterol标记2 h，洗去多余的染料，再以无酚红的培养基孵育不同时间(0，6，12，24，48，96 h)，检测细胞胆固醇外流率，见图3。经过脂多糖刺激后的RAW 264.7小鼠巨噬细胞胆固醇的外流率随着孵育时间呈递增趋势，但与对照组相比，脂多糖刺激后的胆固醇外流率均降低(P < 0.05)。

2.4 高胆固醇人血清抑制细胞胆固醇外流采用10%异常高胆固醇人血清和正常胆固醇人血清处理RAW 264.7小鼠巨噬细胞72 h，再以BODIPY-Cholesterol染色并测定胆固醇外流率，见图4。与正常人血清处理组比较，采用高胆固醇人血清处理RAW 264.7小鼠巨噬细胞的胆固醇外流率显著降低(P < 0.05)。

参考文献

[1] Mao M, Lei H, Liu Q,et al.Effects of miR-33a-5P on ABCA1/G1-mediated cholesterol efflux under inflammatory stress in THP-1 macrophages. PLoS One.2014;9(10): e109722.
[2] Pisetsky DS, Spencer DM. Effects of progesterone and estradiol sex hormones on the release of microparticles by RAW 264.7 macrophages stimulated by Poly(I:C). Clin Vaccine Immunol.2011;18(9): 1420-1426.
[3] 王智.他汀与动脉粥样硬化斑块逆转[J].临床荟萃.2013, 28(7): 831-834.
[4] Iizuka M, Ayaori M, Uto-Kondo H,et al.Astaxanthin enhances ATP-binding cassette transporter A1/G1 expressions and cholesterol efflux from macrophages. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo).2012;58(2): 96-104.
[5] Yvan-Charvet L, Wang N, Tall A R. Role of HDL, ABCA1, and ABCG1 transporters in cholesterol efflux and immune responses. Arterioscler Thromb Vasc Biol.2010; 30(2): 139-143.
[6] Li Z,Mintzer E,Bittman R.First synthesis of free cholesterol- BODIPY conjugates. J Org Chem. 2006; 71(4):1718-1721.
[7] 黄柳倩. BODIPY基荧光传感器对半胱氨酸的检测[J]. 杭州师范大学学报:自然科学版, 2014, 13(5): 499-502.
[8] Gao S, Wang L, Liu W, et al.The synergistic effect of homocysteine and lipopolysaccharide on the differentiation and conversion of raw264.7 macrophages. J Inflamm (Lond).2014;11:13.
[9] Cho W, Kang JL, Park YM. Corticotropin-Releasing Hormone (CRH) Promotes Macrophage Foam Cell Formation via Reduced Expression of ATP Binding Cassette Transporter-1 (ABCA1). PLoS One.2015; 10(6): e0130587.
[10] 洪雪华,生瑜. BODIPY类荧光染料的研究进展[J].广州化工, 2012, 40(7): 65-68.
[11] Solanko LM, Honigmann A, Midtiby HS, et al. Membrane orientation and lateral diffusion of BODIPY-cholesterol as a function of probe structure. Biophys J. 2013;105(9): 2082-2092.

[12] Ariola FS, Li ZG, Cornejo C, et al. Membrane Fluidity and Lipid Order in Ternary Giant Unilamellar Vesicles Using a New Bodipy-Cholesterol Derivative. Biophys J. 2009;96(7): 2696-2708.
[13] Holtta-Vuori M, Uronen RL, Repakova J, et al. BODIPY-Cholesterol: A New Tool to Visualize Sterol Trafficking in Living Cells and Organisms. Traffic. 2008;9(11): 1839-1849.
[14] Wustner D, Solanko L, Sokol E, et al. Quantitative assessment of sterol traffic in living cells by dual labeling with dehydroergosterol and BODIPY- cholesterol. Chemistry and Physics of Lipids.2011; 164(3):221-235.
[15] 宋玮.荧光标记胆固醇用于测定人单核巨噬细胞脂质外流[J].中国动脉硬化杂志, 2012, 20(8):749-754.
[16] Zhang J,Cai S,Peterson BR,et al.Development of a cell-based, high-throughput screening assay for cholesterol efflux using a fluorescent mimic of cholesterol. Assay Drug Dev Technol. 2011;9(2): 136-146.
[17] Kanerva K, Uronen RL, Blom T, et al. LDL cholesterol recycles to the plasma membrane via a Rab8a- Myosin5b-actin-dependent membrane transport route. Dev Cell. 2013;27(3): 249-262.
[18] 张晔.细胞骨架改构在LPS作用后VE-Cad胞吞途径转化中的作用[J].中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(3): 269-273.
[19] 贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司对尿酸检测试剂盒、肌酐测定试剂盒、乳酸测定试剂盒、脂肪酶测定试剂盒、胆固醇测定试剂盒主动召回[J].中国医疗设备, 2015, 30(3):120.
[20] Ladeiras-Lopes R, Agewall S, Tawakol A, et al. Atherosclerosis: Recent trials, new targets and future directions. Int J Cardiol.2015;192:72-81.
[21] 吴先杰.动脉粥样硬化发生机制研究现状及思路[J].中华实用诊断与治疗杂志, 2012, 26(7): 629-631.
[22] Meiler S, Baumer Y, Toulmin E, et al. MicroRNA 302a Is a Novel Modulator of Cholesterol Homeostasis and Atherosclerosis. Arterioscl Throm Vas.2015; 35(2): 323-331.
[23] Li X H, Li Y, Cheng ZY, et al.The Effects of Phellinus linteus Polysaccharide Extracts on Cholesterol Efflux in Oxidized Low-Density Lipoprotein-Loaded THP-1 Macrophages. J Invest Med.2015;63(5): 752-757.

引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外对比实验。

1.2 时间及地点 2014年1月至2015年8月在天津医科大学生物化学与分子生物学实验室开展相关实验。

1.3 材料 DMEM(高糖)培养基(Invitrogen，USA)；胎牛血清(上海生工生物)；脂多糖lipopolysaccharide， LPS(Sigma-Aldrich，USA)；胆固醇(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)；CHOLESTEROL-BODIPY Invitrogen， USA；RAW 264.7小鼠巨噬细胞(美国ATCC细胞库)；人血清(天津医科大学总医院体检中心志愿者)；Fluoroskan Ascent酶标仪(Thermo Scientific，USA)。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养和处理 RAW264.7细胞采用含有体积分数10%FBS的DMEM培养基，在37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养，每隔2 d换液1次，待细胞覆盖培养皿底80%左右时，用0.25%的胰酶消化、洗脱、离心收集细胞后，继续传代培养。

1.4.2 BODIPY-Cholesterol标记和胆固醇外流率的计算取对数生长的RAW264.7小鼠细胞，按1×10⁴/孔接种于96孔板中。每孔用含有体积分数10%FBS的DMEM培养基100 μL孵育细胞24 h，再用浓度为0.025 mmol/L的BODIPY-Cholesterol标记细胞，标记时间为1，2，4，8 h，然后以无血清DMEM洗涤细胞2遍，分别加入含10% FBS的DMEM培养基孵育细胞6，12，24，48， 96 h后，取上清置于96孔板测定荧光强度(N_培养基)。分别向取完上清的单层细胞中加入0.1 mol/L的NaOH 100 μL，37 ℃孵育过夜，取NaOH上清置于96孔板测定荧光强度。每组3个复孔。采用488 nm激发光，510 nm发射光测定BODIPY荧光强度。

胆固醇外流率计算公式：胆固醇外流率(%)=N_培养基/ (N_培养基+N_细胞内)

1.4.3 胆固醇处理细胞 RAW264.7细胞培养于96孔板中，接种密度为1×10⁴ /孔，以含体积分数10%FBS的DMEM培养基过夜培养，弃上清后用含有0.025 mmol/L的BODIPY-Cholesterol标记细胞2，8 h，以无血清DMEM洗涤细胞2遍。实验组分别加入胆固醇至终浓度0.01，0.5，2.5 mmol/L，培养细胞48 h，取上清测定荧光强度。然后加入0.1 mol/L的NaOH过夜，取上清测定荧光强度。

1.4.4 脂多糖处理细胞 RAW264.7细胞中加入 100 μg/L的脂多糖刺激2 d，将刺激后的细胞以1×10⁴/孔的密度接种于96孔板中，BODIPY-Cholesterol标记 2 h，然后孵育6，12，24，48，96 h，分别取上清置于96孔板测定荧光强度。分别向取完上清的单层细胞中加入0.1 mol/L的NaOH 100 μL，37 ℃孵育过夜，取上清测定荧光强度。

1.4.5 人血清处理细胞 RAW264.7细胞以1×10⁴/孔的密度接种于96孔板中，分别以10%和100%的高胆固醇人血清和胆固醇正常人血清孵育细胞72 h后，用BODIPY-Cholesterol方法检测胆固醇的外流率。人血清样本胆固醇浓度分别为5.32-8.72 mmol/L(高胆固醇，n=20)，3.37-4.58 mmol/L(正常，n=20)。孵育细胞的人血清为5个不同人血清样本的混合。实验重复4次。

1.5 主要观察指标 RAW264.7细胞胆固醇的外流率。

1.6 统计学分析结果以x(_)±s表示，使用GraphPad Prism 5统计软件处理数据。组间差异的分析采用t 检验或者单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

BODIPY(氟化硼二吡咯)作为一类新兴的荧光染料，具有良好的物理、生物学特性，在过去的20年中得到了广泛的研究^[10]。本实验采用的BODIPY- Cholesterol是对BODIPY的中心骨架进行功能化，将咯环与胆固醇的第24位碳侧链进行连接BODIPY的吡所合成的衍生物^[11]。BODIPY-Cholesterol能够标记细胞膜结构，在膜中与胆固醇的分布一致^[12]。有研究显示，以BODIPY-Cholesterol标记斑马鱼的脑区域并不会影响其脑部活动^[13]。通过荧光显微镜，BODIPY- Cholesterol使得胆固醇在生物膜中的行为可视化，同时可以将胆固醇在细胞中的运动展示出来^[14]。与传统的同位素标记法比较，采用BODIPY-Cholesterol不但操作步骤简单，而且具有更为精确的空间分辨率^[15]。

BODIPY-Cholesterol测定胆固醇外流率主要是基于BODIPY荧光的测定。因此为了排除自身荧光的干扰，实验中采用了无酚红的培养基孵育细胞以降低背景荧光值^[16]。

BODIPY-Cholesterol标记细胞后，其迅速分布于细胞的表面，并且也会进入到细胞内部^[17]，利用这一性质，本实验通过BODIPY-Cholesterol标记RAW 264.7小鼠巨噬细胞以检测其胆固醇的外流率。BODIPY- Cholesterol分别标记细胞1，2，4，8 h，洗去多余BODIPY-Cholesterol后，再将细胞进行孵育，分别在6，12，24，48，96 h时间点取上清液测定胆固醇的外流率。实验结果显示，经过BODIPY-cholesterol标记细胞2 h后的效果最好；胆固醇外流率与其他时间点的结果比较有显著性差异。胆固醇外流率随着孵育时间的延长呈明显的递增趋势。

本实验分别用胆固醇和脂多糖处理RAW 264.7小鼠巨噬细胞，对细胞进行培养、染色标记、孵育、检测，结果发现经过胆固醇处理过的巨噬细胞的胆固醇外流率较对照组相比有降低的趋势，且与胆固醇浓度呈依赖性，差异有显著性意义。

采用100 μg/L脂多糖处理巨噬细胞，对胆固醇的外流有一定的抑制作用。这也许是由于脂多糖处理后细胞的骨架结构发生了改变^[18]，导致巨噬细胞的胆固醇外流发生了变化。

目前一些商品化的胆固醇测定试剂盒可能存在干扰物质导致测定的结果不准确^[19]。利用BODIPY- Cholesterol可以定量测定细胞胆固醇水平，进一步计算细胞胆固醇外流率，因此本文中的方法可以替代原有的一些测定胆固醇外流的方法。

心脑血管疾病在全世界范围内呈现逐渐升高的发病率，动脉粥样硬化作为心脑血管疾病的危险因素，其发病机制一直是关注的热点^[20-21]，胆固醇代谢紊乱和其在巨噬细胞中的沉积是动脉粥样硬化发生和发展的重要因素^[22]，因此维持细胞和机体的胆固醇平衡是预防和治疗动脉粥样硬化的关键^[23]。本实验提供了有效的方法来检测细胞中胆固醇的动态变化，对动脉粥样硬化的研究有很重要的临床意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程