纳米级多孔负载人骨形成蛋白2基因修饰支架对前成骨细胞株分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.005

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (38): 5657-5663.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.005

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纳米级多孔负载人骨形成蛋白2基因修饰支架对前成骨细胞株分化的影响

阮蔷，赵刚，郭睿，肖月，李超

佳木斯大学口腔医学院，黑龙江省佳木斯市 154007

收稿日期:2016-07-10 出版日期:2016-09-16 发布日期:2016-09-16
通讯作者: 赵刚，硕士生导师，副教授，佳木斯大学口腔医学院，黑龙江省佳木斯市 154007
作者简介:阮蔷，女，1988年生，内蒙古自治区包头市人，汉族，佳木斯大学在读硕士，主要从事正畸方面的研究。
基金资助:
黑龙江省自然科学基金项目(H201487)；佳木斯大学研究生创新项目(LZR2015_015)

Effects of nano porous beta-tricalcium phosphate/collagen scaffold modified with human bone morphogenetic protein 2 gene on differentiation of MC3T3-E1 cell lines

Ruan Qiang, Zhao Gang, Guo Rui, Xiao Yue, Li Chao

School of Stomatology, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China

Received:2016-07-10 Online:2016-09-16 Published:2016-09-16
Contact: Zhao Gang, Master’s supervisor, Associate professor, School of Stomatology, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China
About author:Ruan Qiang, Studying for master’s degree, School of Stomatology, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province, No. H201487; the Postgraduate Innovation Project of Jiamusi University, No. LZR2015_015

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
高浓缩成骨基因聚合物：为高浓缩人骨形成蛋白2基因修饰的β-磷酸三钙/胶原复合材料，具有良好生物相容性、骨诱导和骨传导性佳，是很有潜力的新型骨缺损修复材料，而高浓缩更大程度上有利于成骨能力。
DNA支架：在两种具有互补特性的生物可降解材料多孔壁β-磷酸三钙/胶原复合的研究基础上，通过阳离子多聚体的静电作用将带负电荷磷酸基团的 DNA 固定于支架上，设计编码骨形成蛋白2 的DNA 释放蛋白传递系统。就是缓释材料包裹生物活性因子或以生化技术将人骨形成蛋白2基因转染至质粒、腺病毒及脂质体等基因载体，经种子细胞或成骨细胞吞噬后，表达骨形成蛋白产物。

背景：对于骨缺损，通常需要通过骨组织或成骨材料的移植或充填进行修复。切取自体骨组织会给患者带来额外的损伤和继发畸形，为此，新一代的成骨材料研究迫在眉睫。
目的：构建含人骨形成蛋白2质粒DNA的β-磷酸三钙/胶原支架材料，并观察其对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1分化的影响。
方法：制备纳米级多孔β-磷酸三钙/胶原支架并负载含人骨形成蛋白2目的基因的质粒DNA形成基因修饰的支架材料。建立小鼠前成骨细胞细胞株MC3T3-E1与复合支架的体外培养体系。将其分为支架组和平皿组，再根据质粒的浓度每组再分为2个小组。复合培养后取样通过扫描电镜和光镜进行细胞形态学观察；诱导1，3，7，14 d行茜素红染色观察钙结节情况；实时荧光定量PCR检测细胞周期；诱导1，3，7，14 d观察成骨细胞相关基因Ⅰ型胶原αⅠ链基因、锌指结构转录因子、骨唾液酸蛋白的表达。
结果与结论：①含人骨形成蛋白2为目的基因的质粒DNA修饰纳米β-磷酸三钙/Ⅰ型胶原溶液复合材料上细胞黏附数、分化数量及材料表面分布都高于单纯含人骨形成蛋白2为目的基因的质粒DNA(P < 0.05)；②通过用茜素红染色、实时荧光定量PCR检测，结果显示支架组对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨能力的影响优于平皿组；③结果提示，负载人骨形成蛋白2基因修饰的β-磷酸三钙/胶原支架材料将具有骨传导性的支架与具有生物活性的成骨因子复合，形成复合支架同时具备骨传导性和骨诱导性，是一种理想的骨缺损修复材料。

ORCID: 0000-0002-4322-1423(阮蔷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 人骨形成蛋白2, β-磷酸三钙/胶原, 分化, 骨缺损, 黑龙江省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone tissue transplantation or osteogenic material filling is after used for bone defect repair. To remove autologous bone tissues can lead to additional damage and secondary deformity, therefore, it is extremely urgent to search for a new osteogenic material.
OBJECTIVE: To construct the porous β-tricalcium phosphate (β-TCP)/collagen scaffold modified with human bone morphogenetic protein 2 (hBMP2) gene, and to observe its effects on differentiation of MC3T3-E1 cell lines.
METHODS: The porous β-TCP/collagen scaffold modified with hBMP2 gene was prepared. Then in vitro culture system of MC3T3-E1 cell lines with composite scaffold was established. There were scaffold and plate groups, and each group was divided into two subgroups according to the different concentrations of plasmid. Samples were collected and observed morphologically by scanning electron microscope and light microscope after complex culture. After 1, 3, 7 and 14 days of induction, calcium nodules were observed through alizarin red staining, the cell cycle was detected by real-time PCR, and expressions of α I-chain collagen type I gene, Osterix and bone sialoprotein were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: The number of cells adhered, differentated and distributed on the composite scaffold was significantly higher than that of the single scaffold (P < 0.05). Alizarin red staining and real-time PCR detection showed that the osteogenesis ability of MC3T3-E1 cell lines in the scaffold group was stronger than that in the plate group. To conclude, the porous β-TCP/collagen scaffold modified with hBMP2 gene is an appropriate candidate for bone defect repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Bone Morphogenetic Proteins, Collagen, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

阮蔷，赵刚，郭睿，肖月，李超. 纳米级多孔负载人骨形成蛋白2基因修饰支架对前成骨细胞株分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(38): 5657-5663.

Ruan Qiang, Zhao Gang, Guo Rui, Xiao Yue, Li Chao.

Effects of nano porous beta-tricalcium phosphate/collagen scaffold modified with human bone morphogenetic protein 2 gene on differentiation of MC3T3-E1 cell lines

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(38): 5657-5663.

图/表（结果） 5

2.1 形态学观察结果

2.1.1 支架电镜观察结果含人骨形成蛋白2质粒DNA修饰的纳米级β-磷酸三钙/Ⅰ型胶原复合材料的扫描电镜观察结果见图1，显示复合材料的表面上有大量大小不一的孔隙。

2.1.2 人骨形成蛋白2转染效率转染绿色荧光蛋白对照质粒的细胞显示绿色荧光超过90%(见图2A，B)，说明成功将外源基因转染至细胞中。同时对转染了人骨形成蛋白2的细胞中人骨形成蛋白2的表达进行实时荧光定量PCR检测，发现人骨形成蛋白2的表达升高(见图3)。

2.2 茜素红染色检测钙结节小鼠前成骨细胞在成骨诱导第1，3，7，14天分别进行茜素红染色，在第1，3天对照结果不是很显著，第7，14天后，茜素红结果显示平皿组可见略有结节突起成微红色(见图4A)，支架组能明显观察到突起的结节，钙结节着色较平皿组深，呈橘色，数量较多(见图4B)。

2.3 实时荧光定量PCR检测细胞成骨相关基因表达结果实验使用实时荧光定量 PCR 法测定成骨细胞相关基因Ⅰ型胶原αⅠ链基因、锌指结构转录因子、骨唾液酸蛋白的表达，从而证明细胞的成骨活性。小鼠前成骨细胞在成骨诱导1，3，7，14 d后，支架组成骨细胞相关基因Ⅰ型胶原αⅠ链基因、锌指结构转录因子、骨唾液酸蛋白表达量均明显高于平皿组(P < 0.05)。图5结果表明，复合支架材料由于掺入了具有生物活性的质粒，在一定时期内提高了成骨细胞的相关基因表达水平。据此，推测该类材料的成骨活性主要通过影响和调控成骨基因的表达，从而促进成骨细胞的生长、分化和骨基质形成。

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引言

颌骨缺损修复一直是临床治疗中的难题^[1]。临床上颌骨缺损是一种常见、多发而又治疗相当复杂的先天性、发育性及后天性的疾患，不仅会导致患者非常严重的形态畸形和功能活动障碍，同时给社会也会带来沉重的经济和医疗负担^[2]。目前成骨材料已经日益广泛的被应用，其中主要包括有机物如胶原等和无机盐如磷酸钙复合物等，这些成骨材料基本上都是骨的组成部分，均具备良好的骨传导性，然而却由于不具备生物活性因子如人骨形成蛋白2而缺乏骨诱导活性，从而只能作为颌骨缺损修复的充填材料或支架，以实现“爬行替代”的诊疗过程^[3-4]。伴随着组织工程技术日益发展，支架材料复合成骨生长因子已经成为颌骨缺损修复一门新兴技术^[5]。在种类相当繁多的的支架材料中，β-磷酸三钙是构成骨组织众多无机物质中的一种，它具有良好的生物相容性，但是不少学者发现β-磷酸三钙大多数情况下组织的相容性尚可，但其生物的响应性-即受植区组织对其反应性远远不如自体的骨组织^[6-8]，因此解决此类问题成为国内外学者们潜心钻研论证的课题。当今国内外的研究均集中于如何应用缓释材料(如纳米微囊)包裹生物活性因子或者以一种生化技术将该类因子(主要为人骨形成蛋白2)基因转染至质粒、腺病毒及脂质体等基因载体，经过种子细胞或成骨细胞吞噬后，表达人骨形成蛋白2蛋白产物^[9-10]。这种方法虽然技术已经非常先进，但是仍然需要不断的探索，从而使之臻于成熟。

实验根据以上种种质疑将研究的主方向定位到新一代的成骨材料上，将具有骨传导性能的支架与具有生物活性能的成骨因子进行复合，形成的复合支架材料以期同时具备骨传导性和骨诱导性。实验研究组在掌握了先进技术和提供专业材料的基础上，评估检测并论证具备微一纳孔结构的β-磷酸三钙/胶原复合材料的生物相容性，课题组在预实验阶段已经成功制备了微-纳孔结构的β-磷酸三钙/胶原复合材料，利用该支架材料的胶原成分作为质粒DNA载体进行体外实验。将其应用于临床基础实践，将有效促进细胞的活性，从而促进骨组织再生，为临床基础研究提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞观察性实验。

1.2 时间及地点于2015年3月至2016年1月在佳木斯大学基础实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验材料负载目的基因的人骨形成蛋白2质粒DNA购于大连宝生物工程有限公司；负载人骨形成蛋白2为目的基因质粒DNA修饰纳米β-磷酸三钙/胶原溶液复合材料购于北京奥精医药科技有限公司；小鼠前成骨细胞MC3T3-E1于北京协和细胞资源中心购买。

1.3.2 实验仪器层流超声工作台(上海博讯实业有限公司，中国)；电热恒温培养箱(上海博迅实业有限公司)、超低温冰箱(Thermo，美国)；电镜日本岛津(SSX-550)倒置显微镜(Olympus BX5，日本)；辅助电动移液枪、离心管、微量移液器(Brand，德国)；高速Megafuge离心机(美国Thermo Scientific)；涡旋离心机(美国Scientific instrument)；LightCycler^@480 实时荧光定量PCR仪(Roche，瑞士)；PCR仪(美国Biorad)；NanoDrop 2000c微量分光光度计(Thermo Scientific)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组 ①支架组(Z)：根据支架上复合人骨形成蛋白2为质粒的量分为2组：Z0组(支架含14 μg对照质粒)和Z14组(支架含14 μg人骨形成蛋白2质粒)；②平皿组(M)：根据转染时在12孔板中所加人骨形成蛋白2为质粒的量分为2组：M0组(平皿加1 μg对照质粒)和M1组(平皿加1 μg人骨形成蛋白2质粒)。

1.4.2 合成带有人骨形成蛋白2基因的质粒DNA 按所查阅的参考文献[11]制备出含人骨形成蛋白2目的基因的真核表达载体，以购自ATCC的人骨形成蛋白2基因作为模板进行PCR扩增，人骨形成蛋白2基因的序列号为：NM-001200.2，ID：650，PCR的产物通过分离纯化后经Xba I、Hind Ⅲ双酶切，插入相同双酶切的pcDNA3.1 (-)表达载体，再经过测序及酶切鉴定后大量扩增并纯化，制备液态人骨形成蛋白2/pcDNA3.1(-)其浓度为 3 g/L，于-20 ℃保存，备用。

1.4.3 负载人骨形成蛋白2为目的基因质粒DNA修饰纳米β-磷酸三钙/Ⅰ型胶原溶液复合材料该复合材料购于北京奥精医药科技有限公司，纳米级多孔β-磷酸三钙/Ⅰ型胶原复合仿生材料按照参考文献[12]制备：室温下将胶原与稀盐酸溶液(pH=2)以100 mg/100 mL比例混合形成稳定的悬浮液，缓慢加入纳米级β-磷酸三钙粉末(其β-磷酸三钙/Ⅰ型胶原的质量比为2∶1)形成均匀的悬浮溶液，-20 ℃冷冻干燥；0.1%戊二醛浸泡12 h，无水乙醇，去离子水漂洗，冻干，得到纳米级多孔β-磷酸三钙/Ⅰ型胶原复合材料。将已制备好的含有人骨形成蛋白2为目的基因液体的质粒DNA滴加至支架材料，然后经过低温冻干的处理后，制备成含质粒的浓度分别为1，14 μg的2组支架材料，将材料切割成5 mm× 5 mm× 2 mm的小长方体，于-20 ℃保存，备用。

1.4.4 小鼠前成骨细胞培养的方法使用含体积分数10%胎牛血清、1%双抗(链霉素和青霉素)的α-MEM (Hyclone)的培养基于37 ℃，体积分数5%CO₂的孵箱中培养细胞。每48 h更换1次培养液，约72 h传代1次，使用细胞传代20代以前的小鼠前成骨细胞。

1.4.5 材料与细胞复合培养

细胞接种：所有支架材料经过高压蒸汽灭菌，再经紫外线光照射3 h，从而达到分组材料灭菌的目的。将支架材料放入24孔板中，再加入1 mL含体积分数10%胎牛血清的α-MEM预先润湿过夜。采用负压将支架材料上的液体抽干，将5×10⁴个小鼠前成骨细胞细胞滴加到支架上，并在37 ℃，体积分数5%CO₂的孵箱中孵育3 h，之后加1 mL完全培养基。平皿培养是直接在24孔板中接种5×10⁴个细胞。

细胞转染：待24孔中细胞达到70%汇合率时，进行人骨形成蛋白2转染。含人骨形成蛋白2的质粒由大连宝生物工程有限公司合成，转染前先将完成培养基换成无血清α-MEM。分别在两个1.5 mL EP管中加入50 μL α-MEM，其中一管中加入2.4 μL脂质体(汉恒生物，中国)，另一管中加入含人骨形成蛋白2的质粒DNA(分别为1 μg、14 μg)或对照质粒，混匀后孵育5 min，将脂质体滴加到质粒DNA中孵育20 min后，均匀滴加到孔内。支架组只加脂质体。6 h后换为正常的完全培养基。

1.5 主要观察指标

1.5.1 形态学观察体外细胞样品经过取材、固定、脱水等预先处理后，扫描电镜、光镜进行细胞形态学观察。

1.5.2 茜素红染色检测钙结节 24孔板培养细胞，成骨诱导14 d。0.1%茜素红-Tris-HCl(pH 8.3)溶液配制。取1 g茜素红溶于 100 mL三蒸水，使用HCl缓慢滴加与上述溶液中调定pH值于8.3，再加入0.1 g茜素红，现用现配。具体方法：①吸出培养基后，用PBS清洗3遍；②40 g/L多聚甲醛固定30 min；③双蒸水清洗2遍，每孔加入500 μL 0.5%茜素红染液，避光室温放置1 h；④吸出茜素红染液，双蒸水清洗2遍。大体和显微镜下观察钙结节形成情况。

1.5.3 实时荧光定量PCR检测各组细胞在第1，3，7，14天4个时间点用TRIzol进行裂解细胞，使用氯仿、异丙醇等提取mRNA，1 μg mRNA反转录为cDNA后，采用LightCycler@480实时荧光定量PCR仪对细胞成骨相关基因Ⅰ型胶原αⅠ链基因、锌指结构转录因子、骨唾液酸蛋白的表达进行检测。基因引物见表1。

1.6 统计学分析在Windows XP操作系统上采用SPSS 11.5 统计软件进行分析，试验结果以x(_)±s表示，各组间比较采用单因素方差分析；并对人骨形成蛋白2蛋白表达强度比与细胞成骨活性之间作Pearson等级相关检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

颌骨缺损的治疗一直以来是临床上得热点，临床多采用自体骨移植骨来源为患者本身，不存在生物相容性和免疫反应问题，但供骨区和供骨量受限。且另需手术切口,引起疼痛、出血、感染、局部麻木和破坏组织结构完整性等缺点^[13-16]。以往的骨组织工程研究中，常将矿化物质骨模型、胶原和藻酸盐混合固态多孔的羟磷灰石、壳聚糖、磷酸钙和聚合物作为支架材料来促进颌骨组织再生^[17]。但是这些支架材料容易引起动物的免疫原性，可再生数量和保质期受限，且功能不显著，因此很少用于临床研究^[18-19]。

理想的颌骨缺损修复材料应具备优良的骨诱导活性，大量的研究实验证实人骨形成蛋白2具有最强的骨诱导能力^[20]，然而由于人骨形成蛋白2体内半衰期短，易被蛋白酶降解，及局部难以持续发挥诱导成骨作用等原因^[21]，因此本实验采用局部基因治疗的方法将编码人骨形成蛋白2基因的质粒DNA负载到纳米级多孔β-磷酸三钙/胶原支架材料植入体内后，支架缓释人骨形成蛋白2的DNA，转染细胞并持续表达人骨形成蛋白2。组织学观察显示单纯支架组骨缺损断端成骨活跃，中心成骨不明显，这表明β-磷酸三钙/胶原支架材料具有优良的骨传导性，它可提供支架使骨组织通过爬行替代的方式由断端向中心生长^[22-23]。人骨形成蛋白2基因修饰的β-磷酸三钙/胶原复合材料具有良好的生物相容性，与骨生长匹配的生物降解性，优良的骨传导和骨诱导性，是一种理想的骨缺损修复材料，具有良好的临床应用前景^[24-25]。通过扫描电镜、光镜下观察显示转染绿色荧光蛋白对照组质粒的细胞有超过90%的小鼠前成骨细胞显示有绿色荧光，说明已经成功将成骨相关因子外源基因转染至小鼠前成骨细胞中。实时荧光定量检测发现转染了人骨形成蛋白2的细胞中人骨形成蛋白的表达升高。这表明β-磷酸三钙/胶原复合支架材料能够实现临床上的骨组织缺损的修复替代过程，具有十分优良的骨传导活性。在茜素红染色检测中发现第7，14天后，茜素红结果显示平皿组可见略有结节突起成微红色，支架组能明显观察到突起的结节，钙结节着色较平皿组深，呈橘色，数量较多。进一步证实了负载目的基因的人骨形成蛋白2修饰的支架材料具备良好的骨诱导活性。

本课题实验组茜素红染色和实时定量荧光检测实验结果分析中发现负载目的基因人骨形成蛋白2在体外实验小鼠前成骨细胞中得到了较好的表达，并且检测因子在14 d时成骨诱导因子人骨形成蛋白2的表达更加增强，与实验对照组相比单纯DNA支架组中的成骨诱导基因人骨形成蛋白2的表达相对较弱。从而说明了平皿和支架组均能促进成骨细胞的成骨活性有良好的生物相容性，然而实验结果显示支架组的成骨活性要明显优于平皿组。Zou等^[26]进行裸鼠胫骨节段性骨缺损实验，其结果显示支架材料持续释放具有诱导活性的人骨形成蛋白2，可以有效的促进节段骨缺损的愈合，Cao^[27]及Liu等^[28]的研究更确切证实了β-磷酸三钙成为质粒DNA载体的高效性。Keeney等^[29]的研究也发现β-磷酸三钙/胶原复合支架材料可以作为成骨相关基因DNA的高效载体，与本实验小组的研究结果一致。

小鼠前成骨细胞是一种前成骨细胞系，由新生小鼠颅盖骨细胞建株，在体外培养中具有成骨细胞的表型特征，可诱导成为成熟的成骨细胞，是一个很好的研究骨分化的模型^[30]。成骨细胞的分化包括增殖、细胞外基质沉积、基质成熟和矿化4个阶段^[31]。本实验中通过实时荧光定量PCR研究不同时间段的成骨细胞相关基因Ⅰ型胶原αⅠ链基因、锌指结构转录因子、骨唾液酸蛋白表达情况。其中成骨细胞相关基因Ⅰ型胶原αⅠ链基因是成骨细胞分化的早期标志物，锌指结构转录因子是成骨细胞分化过程中一个重要的成骨细胞特异性转录因子^[32]。骨唾液酸蛋白与细胞外基质的钙化高度相关，其表达量的高低可代表骨的成熟度和矿化水平^[33]。

随着再生医学的迅猛发展以及分子生物学技术在骨再生研究中的广泛应用，研究骨修复材料与成骨细胞及宿主间的相互作用成为当前骨再生医学的研究重点与热点^[34-36]。大量的研究表明高浓缩成骨基因聚合物包裹DNA支架在体内和体外均具有良好的生物学效应^[37-38]。

理想的骨缺损修复材料应具备优良的骨诱导活性，大量的研究实验证实人骨形成蛋白2具有最强的骨诱导能力^[39]。然而，由于人骨形成蛋白2体内半衰期短，易被蛋白酶降解，局部难以持续发挥诱导成骨作用^[40]。因此本实验采用含有含人骨形成蛋白2基因的高浓缩聚合物，包裹着DNA支架，以持续表达人骨形成蛋白2。尽管人骨形成蛋白2已投入到临床使用，但是高浓缩人骨形成蛋白2包裹DNA支架的病例在临床中尚未见报道^[41]。而且这种DNA支架的降解速率尚不清楚，其远期效果也未曾有过调查，需结合体内实验进一步探究。

以上论据能够充分证明人骨形成蛋白2目的基因修饰的β-磷酸三钙/胶原复合支架材料具有良好的生物相容性，优良的骨诱导性和骨传导性，可以有效弥补降解速度快的缺陷，是一种临床使用后效果非常理想的骨缺损修复替代材料，具有十分广泛的临床应用前景。负载人骨形成蛋白2基因修饰的β-磷酸三钙/胶原支架材料的生物相容性要明显优于人骨形成蛋白2、β-磷酸三钙及胶原三种材料分别对骨缺损替代修复的效果。负载目的基因人骨形成蛋白2修饰的β-磷酸三钙/胶原复合支架材料具有良好的骨诱导性，有利于组织细胞的黏附和分化，是一种临床应用前景广效果理想的骨缺损修复替代材料^[42]，可以更好地应用于口腔种植修复、口腔颌面外科及其与口腔正畸与其他外科学联合修复骨缺损治疗中。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

纳米级多孔负载人骨形成蛋白2基因修饰支架对前成骨细胞株分化的影响

Effects of nano porous beta-tricalcium phosphate/collagen scaffold modified with human bone morphogenetic protein 2 gene on differentiation of MC3T3-E1 cell lines

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