镁合金支架对成骨细胞功能的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.34.001

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (34): 5021-5026.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.34.001

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镁合金支架对成骨细胞功能的影响

王勇平¹，刘小荣²，张炳春³，何耀华⁴

¹兰州大学第一医院骨科，甘肃省兰州市 730000；²甘肃省第二人民医院检验科，甘肃省兰州市 730000；³中国科学院金属研究所，辽宁省沈阳市 110016；⁴上海交通大学附属第六人民医院骨科，上海市 200233

收稿日期:2016-05-23 出版日期:2016-08-19 发布日期:2016-08-19
通讯作者: 何耀华，主任医师，上海交通大学附属第六人民医院骨科，上海市 200233
作者简介:王勇平，男，1975年生，甘肃省宁县人，汉族，博士、博士后，副主任医师，主要从事关节外科及骨科生物材料研究。
基金资助:
兰州大学第一医院科研基金资助项目(ldyyyn2013-01)；国家自然科学基金资助项目(81271961，81572106)

Effect of magnesium alloy scaffolds on osteoblast function

Wang Yong-ping¹, Liu Xiao-rong², Zhang Bing-chun³, He Yao-hua⁴

¹Department of Orthopedics, First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; ²Department of Laboratory, Second People’s Hospital of Gansu, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; ³Institute of Metal Research, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; ⁴Department of Orthopedics, Sixth Affiliated People’s Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China

Received:2016-05-23 Online:2016-08-19 Published:2016-08-19
Contact: He Yao-hua, Chief physician, Department of Orthopedics, Sixth Affiliated People’s Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China
About author:Wang Yong-ping, M.D., Associate chief physician, Department of Orthopedics, First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
Supported by:
the Scientific Research Foundation of the First Hospital of Lanzhou University, No. ldyyyn2013-01; the National Natural Science Foundation of China, No. 81271961, 81572106

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
镁合金支架材料：可降解；弹性模量接近人骨，能有效降低应力遮挡效应；良好的生物相容性；是人体不可缺少的重要营养元素，几乎参与人体内所有新陈代谢过程，如参与蛋白质合成、能激活体内多种酶、调节神经肌肉和中枢神经系统活动等。因此，镁合金具备成为骨组织工程支架材料的潜力。
MC3T3-E1细胞：是小鼠前成骨细胞系，该细胞系具备体外培养成骨细胞的各种生物学特性，包括碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原合成和基质矿化等，可作为良好的成骨细胞体外模型系统。

背景：课题组在前期研究的基础上，将镁合金加工成多孔支架。
目的：探讨镁合金多孔支架对成骨细胞功能的影响。
方法：分别将镁合金多孔支架、纯镁多孔支架与成骨细胞MC3T3-E1共培养，培养6，12，24 h，通过吖啶橙染色观察成骨细胞在支架表面的黏附能力；培养1，3，5 d，利用MTT法评价成骨细胞在支架表面的增殖能力；培养21 d，采用钙黄绿素染色观察支架对成骨细胞矿化功能的影响。
结果与结论：镁合金多孔支架组培养24 h的黏附细胞数量多于纯镁多孔支架组(P < 0.05)，培养3，5 d的细胞增殖数量多于纯镁支架组(P < 0.05)，培养21 d的支架表面矿化结节数量及面积大于纯镁多孔支架组(P < 0.05)。结果表明，多孔镁合金多孔支架能促进成骨细胞的黏附、增殖及矿化，具有良好的生物功能性。

ORCID: 0000-0002-0663-0375(何耀华)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 镁合金支架, 成骨细胞, 黏附, 增殖, 矿化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: On the basis of the previous studies, the magnesium alloy is processed into porous scaffolds.
OBJECTIVE: To investigate the effect of porous magnesium alloy scaffolds on osteoblast function.
METHODS: MC3T3-E1 osteoblastic cell lines were seeded on the porous magnesium alloy scaffold or porous pure magnesium scaffold, respectively. After 6, 12 and 24 hours of incubation, the adhesion ability of osteoblasts on the scaffold was observed by acridine crange staining. At 1, 3 and 5 days after incubation, the proliferation ability of osteoblasts on the scaffold was evaluated by MTT assay; after 21-day incubation, the mineralization of osteoblasts was investigated using calcein staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The number of osteoblasts adherent to the porous magnesium alloy scaffold was significantly more than that adherent to the porous pure magnesium scaffold after 24-hour incubation (P < 0.05). And the proliferation assay showed that a significantly higher absorbance was observed on the porous magnesium alloy scaffold than that of the porous pure magnesium scaffold after 3 and 5 days of incubation (P < 0.05). Moreover, the number and area of mineralized nodules formed on the the porous magnesium alloy scaffold were greater than those on the porous pure magnesium scaffold after 21-day incubation (P < 0.05). These results show that the porous magnesium alloy scaffold with an excellent bioactivity can promote the adhesion, proliferation and mineralization abilities of osteoblasts.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Magnesium, Osteoblasts, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王勇平，刘小荣，张炳春，何耀华. 镁合金支架对成骨细胞功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(34): 5021-5026.

Wang Yong-ping, Liu Xiao-rong, Zhang Bing-chun, He Yao-hua. Effect of magnesium alloy scaffolds on osteoblast function[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(34): 5021-5026.

图/表（结果） 5

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引言

骨损伤及骨疾病导致的大块骨缺损是骨科临床面临的难题，传统的治疗方法主要有自体骨移植、异体骨移植、人工骨移植及骨移位等，但这些治疗方法均存在一定的缺点。骨组织工程技术为大块骨缺损修复提供了新的方向，成为目前研究的热点^[1-4]。

组织工程支架是骨组织工程基本要素之一^[5-6]。如何开发具有优良生物活性及适宜力学性能的支架材料，是该领域亟待解决的问题。理想的骨组织工程支架应满足以下基本条件^[7]：容易手术操作；支架材料的吸收速率与骨生长速率匹配；可用于形状不规则的骨缺损部位；具有骨传导及骨诱导能力；保证精确的力学性能；能促进骨质沉着；能促进骨生长；可防止软组织向移植物-骨组织界面生长；呈泡沫状，平均孔径在200-400 μm之间；对周围组织无不良影响。现有支架材料多为聚合物，包括天然聚合物和人工合成聚合物^[8]。天然聚合物支架如胶原等，具有表面亲水性，与细胞能相互作用；人工合成聚合物支架如聚羟基乙酸等，具有形态、降解速度易调控的特点，表面为疏水性，缺乏细胞识别信号。目前现有的聚合物支架材料均存在脆性大、力学强度差的缺点，难以完全满足骨缺损修复承载重量的要求。

目前为止，骨组织工程支架尚未涉及金属材料。由于金属材料具有强度大、韧性佳等优良的力学特性，因此，能否研发金属骨组织工程支架材料成为骨组织工程技术领域研究的新课题。临床常用的金属材料主要有不锈钢、钴基合金和钛基合金等，但这些材料均为不降解材料，不符合支架材料的基本要求。镁合金材料具有以下突出优点^[9-25]：可降解；弹性模量接近人骨，能有效降低应力遮挡效应；良好的生物相容性；是人体不可缺少的重要营养元素，几乎参与人体内所有新陈代谢过程，如参与蛋白质合成、能激活体内多种酶、调节神经肌肉和中枢神经系统活动等。因此，镁合金具备成为骨组织工程支架材料的潜力。

课题在前期研究的基础上^[26-30]，将镁合金加工成多孔支架，将MC3T3-E1细胞与镁合金支架共培养，观察其对MC3T3-E1细胞黏附、增殖及矿化功能的影响，初步评价其对成骨细胞生物功能性的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞观察实验。

1.2 时间及地点实验于2012年1月至2013年1月在上海交通大学附属第六人民医院完成。

1.3 材料 AZ31镁合金由中国科学院金属研究所提供，其中Al含量为1.92%，Zn含量为0.74%，Mn含量为0.35%，Si含量为0.026%，Ni含量为0.000 3%，Cu含量为0.002 8%，Fe含量<0.003%。

纯镁由中国科学院金属研究所提供，其中Mg含量≥99.99%，Si含量≤0.001 6%，Ni含量≤0.000 1%，Cu含量≤0.000 4%，Fe含量≤0.001 4%，Al含量≤0.000 5%。

MC3T3-E1细胞由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供。

1.4 实验方法

试样制备：将镁合金和纯镁锭加工成直径5 mm× 5 mm×5 mm的多孔支架试样(图1)，表面抛光，用无水乙醇超声清洗10 min，在室温空气中干燥。实验前用环氧乙烷消毒。

MC3T3-E1细胞的培养：将MC3T3-E1细胞置于 25 mL细胞培养瓶中，加入含体积分数10%胎牛血清的a-MEM培养液，在37 ℃、95%相对湿度、含体积分数5%CO₂培养箱中培养。当细胞覆盖程度达到培养瓶底面积70%-80%时，进行细胞传代。传代培养时，先吸出细胞培养瓶中的旧培养液，用少量新鲜PBS洗去残留的旧培养液，加入1 mL胰酶，在倒置相差显微镜下观察，当细胞回缩变圆、细胞间隙增大时立即翻转培养瓶，将胰酶倒掉，加入少量含血清的新鲜培养液，终止消化，并用吸管反复轻轻吹打仍贴壁的细胞使其形成细胞悬液，然后按1∶2传代，分装到2个新培养瓶中进行培养，取传至2-4代成骨细胞作为实验细胞。

MC3T3-E1细胞的黏附：采用吖啶橙染色研究镁合金多孔支架和纯镁多孔支架试样表面MC3T3-E1细胞的黏附。将1 mL MC3T3-E1细胞悬液(细胞浓度为2×10⁷ L^-1)分别接种于镁合金多孔支架和纯镁多孔支架试样表面，加入含有10%胎牛血清的a-MEM培养液，置于37 ℃、95%相对湿度、含体积分数5%CO₂细胞培养箱中进行培养，每2 d更换新鲜的培养液。细胞培养6，12，24 h后，用PBS漂洗3次，每次1 min，去除材料表面未黏附的细胞，然后将黏附于支架试样表面的细胞用体积分数95%乙醇固定10 min，干燥后加入足量0.01%吖啶橙染液染色5 min，PBS洗1 min，0.1 mol/L氯化钙分色1 min，用PBS漂洗3次，每次数秒。在荧光显微镜下用蓝紫光激发滤片进行观察并拍照。随机在每个试样表面的5个不同视野进行细胞计数。

MC3T3-E1细胞的增殖：采用MTT法研究接种于镁合金多孔支架和纯镁多孔支架试样表面MC3T3-E1细胞的增殖功能。于24孔板中，将1 mL MC3T3-E1细胞悬液(细胞浓度为2×10⁷ L^-1)分别接种于镁合金多孔支架和纯镁多孔支架试样表面，加入含有体积分数10%胎牛血清的a-MEM培养液，置于37 ℃、95%相对湿度、含体积分数5%CO₂细胞培养箱中培养，每2 d更换新鲜的培养液1次。细胞培养1，3，5 d后，用0.25%胰酶消化试样表面的细胞，加入少量新鲜培养液，反复轻轻吹打，使其成为细胞悬液，离心后收集细胞，用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养液重新将细胞稀释成1 mL细胞悬液，接种于96孔培养板，200 μL/孔，每样品接种6孔，培养24 h后，PBS冲洗，加入20 μL 0.5%MTT培养4 h，加入150 μL DMSO，震荡10-15 min，用酶标仪在490 nm波长测量吸光度值(A值)。

MC3T3-E1细胞的矿化：于24孔板中，将1 mL MC3T3-E1细胞悬液(细胞浓度为2×10⁷ L^-1)分别与镁合金多孔支架和纯镁多孔支架试样共培养，加入含有体积分数10%胎牛血清、0.05 mmol L-抗坏血酸2-磷酸和 10 mmol β-甘油的a-MEM培养液，置于37 ℃、95%相对湿度、含体积分数5%CO₂细胞培养箱中培养，每3 d更换新鲜培养液1次。培养21 d后，大体可见乳白色斑点时，加入含50 mg/L钙黄绿素的培养液，继续培养 30 min，PBS漂洗3次，然后用体积分数95%乙醇固定 10 min。在荧光显微镜下进行观察，并用荧光显微镜自带的分析软件系统计算钙化结节面积。

1.5 主要观察指标镁合金多孔支架对成骨细胞功能的影响。

1.6 统计学分析用SPSS 13.0统计软件(SPSS公司，美国)进行统计分析，两组间均数的比较采用t 检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

医用材料置入人体后将与置入部位组织和细胞直接接触，这就要求医用材料必须具备良好的生物相容性^[31]。镁合金支架作为体内置入材料，在从基础研究向临床应用转化过程中，必须首先对其生物相容性进行系统评价。近年来，生物相容性的概念发生了较大变化，主要包括两大原则：一是生物安全性原则；二是生物功能性原则^[32-33]。作为骨科置入材料，镁合金支架主要用于修复骨损伤或骨缺损，骨损伤修复是成骨细胞与破骨细胞相互作用的一种动态平衡，在此过程中，作为材料置入部位的主要功能细胞-成骨细胞承担着骨的修复和改建功能，因此在骨科置入材料领域，应使用成骨细胞及与成骨相关的前体细胞建立体外评价体系，因为这种细胞在体外培养过程中可形成与体内环境一致的矿化结节，这种结节内含有类成骨细胞钙化的胶原基质，使体外细胞培养更好地模拟了生物材料与骨组织在体内的相互作用过程。MC3T3-E1细胞是小鼠前成骨细胞系^[34]，该细胞系具备体外培养成骨细胞的各种生物学特性，包括碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原合成和基质矿化等，可作为良好的成骨细胞体外模型系统。

实验选择MC3T3-E1细胞与镁合金多孔支架进行体外共培养，研究其对成骨细胞黏附、增殖及矿化功能的影响，评估其对成骨细胞生物功能性的影响。首先将MC3T3-E1细胞接种于镁合金多孔支架表面，培养不同时间后，采用吖啶橙染色分析黏附于镁合金多孔支架表面MC3T3-E1细胞的数量和形态变化，研究镁合金多孔支架对成骨细胞黏附能力的影响。培养24 h后吖啶橙染色结果表明，黏附于镁合金多孔支架表面的细胞数量比黏附于纯镁支架表面的细胞数量显著增加，这可能因镁合金多孔支架耐腐蚀性能增强，有利于细胞材料界面的稳定，从而有利于细胞在材料表面的黏附。

采用MTT法测定成骨细胞在两组材料表面的生长情况，研究镁合金多孔支架对成骨细胞增殖能力的影响。MTT法是一个快速简便的颜色反应测定，线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将黄绿色的MTT降解成蓝紫色的甲瓒，再用酶联免疫检测仪测定甲瓒的含量就能定量测定细胞活力，由于MTT只与活细胞相结合，可避免死细胞的干扰，比较真实地反映了成骨细胞增殖能力。实验结果显示，镁合金多孔支架表面的MC3T3-E1细胞数量随着时间而增加，在培养第3天和第5天时，与纯镁多孔支架组细胞数量相比有明显差异，表明镁合金多孔支架能促进成骨细胞增殖。这可能是因为适当的镁离子浓度可通过调节蛋白质的合成及其辅助过程而导致细胞活化，同时，沉积于镁合金支架表面的钙离子可共同促进成骨细胞增殖。

置入材料表面新骨形成的快慢直接影响材料与周围骨组织的整合，其中成骨细胞矿化能力至关重要。在分化晚期，成骨细胞骨将骨钙素等非胶原蛋白分泌至细胞外基质中，与钙、磷结合，钙和磷沿胶原分子长轴结合到胶原分子侧链的氨基酸残基上，形成羟磷灰石结晶，使骨基质矿化而形成新的骨组织，成骨细胞包埋于其中即成为骨细胞。实验利用钙黄绿素矿化结节染色来确定镁合金支架对MC3T3-E1细胞矿化功能的影响，结果显示镁合金多孔支架组矿化结节数量比纯镁多孔支架组多，矿化结节面积明显大于纯镁多孔支架组(P < 0.05)，表明镁合金多孔支架能促进成骨细胞的矿化功能。

总之，实验表明镁合金支架能促进成骨细胞的黏附、增殖及矿化功能，具有良好的生物功能性。

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