异氟醚对新生大鼠海马神经干细胞增殖及分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.01.021

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

神经干细胞：存在于神经发生过程以及成年哺乳类动物中枢神经系统的神经干细胞是一种多能性细胞，具有自我更新以及分化为神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞能力。从哺乳动物胚胎及脑组织中可以分离培养出神经干细胞，呈聚集式悬浮生长，形成典型的神经球形态，可表达其特异性标志物巢蛋白、CD133。

吸入麻醉：为挥发性麻醉药或麻醉气体经呼吸系统吸入，抑制中枢神经系统而产生全身麻醉的麻醉方法。吸入麻醉由于所用麻醉药在药理学性质上存在差别，其临床麻醉表现如诱导快慢、麻醉强度、苏醒快慢、对循环和呼吸的影响等也不相同，常用的吸入麻醉药物有乙醚、氟烷及七氟烷等。

背景：异氟醚麻醉药物会对神经系统产生一定的影响，研究表明其可能是通过影响神经干细胞功能或形态而引起神经功能障碍。

目的：探讨异氟醚对大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响。

方法：培养新生7 d SD大鼠海马神经干细胞并进行诱导分化，取传至第3代细胞，将其分为2组：异氟醚组通入2.8%异氟醚和体积分数为5%CO₂，体积分数为95%O₂的混合气体；对照组仅通入体积分数为5%CO₂，体积分数为95%O₂的混合气体。干预6 h后，再常规培养2 h。抗BrdU单克隆抗体进行免疫荧光染色检测细胞增殖情况，Western blot法测定神经元标志物β3-微管蛋白和胶质细胞标志物GFAP蛋白的表达。

结果与结论：与对照组相比，异氟醚组BrdU阳性细胞数目明显减少，说明异氟烷抑制了神经干细胞增殖；与对照组相比，异氟醚组GFAP表达水平上调，β3-微管蛋白表达水平无明显改变，说明异氟烷可促进神经干细胞更多地向星形胶质细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0001-8738-9327(闵娜)

关键词: 干细胞, 培养, 异氟醚, 吸入麻醉, 大鼠, 新生, 海马, 神经干细胞, 细胞增殖, 神经元分化

Abstract:

BACKGROUND: Isoflurane is an anesthesia drug that has a certain effect on the nervous system. It possibly causes neurologic disorders through impacting nerve stem cell function or morphology.
OBJECTIVE: To investigate the effects of isoflurane on the proliferation and differentiation of neural stem cells in the hippocampus of rats.
METHODS: Neural stem cells from the hippocampus of neonatal Sprague-Dawley rats, aged 7 days, were induced and differentiated. Passage 3 cells were obtained and divided into two groups: isoflurane group (a mixture gas of 2.8% isoflurane, 5% CO2 and 95% O2) and control group (a mixture of 5% CO2 and 95% O2). After intervention of 6 hours followed by 2 hours of routine culture, anti-BrdU monoclonal antibody immunofluorescent staining was used to detect cell proliferation, and western blot assay to detect the expression of β3-tubulin and glial fibrillary acidic protein.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the number of BrdU positive cells in the isoflurane group reduced significantly, indicating that isoflurane inhibits the proliferation of neural stem cells. Compared with the control group, the expression of glial fibrillary acidic protein in the isoflurane group up-regulated, but the expression of β3-tubulin had no changes, indicating isoflurane promotes the differentiation of neural stem cells into astrocytes.

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年3至4月在郑州大学第五附属医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物健康7 d龄雄性SD大鼠20只，体质量15-20 g，购自郑州大学实验动物中心。

1.3.2 试剂与仪器异氟醚(百灵威科技有限公司)；DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司)；碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27(Peprotech公司)；巢蛋白、BrdU单克隆抗体(美国Sigma 公司)；抗β3-微管蛋白、神经胶质纤维酸性蛋白抗体(Invitrogen公司)；抗β-actin抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；CCK-8试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；气体监测仪(济南德耐电子有限公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 神经干细胞的分离培养取出生后第7天SD大鼠，无菌条件下分离出海马组织，PBS漂洗，用眼科剪剪碎成糊状，放入胰蛋白酶中消化，根据消化情况加入含体积分数为10%胎牛血清的PBS中止消化，吸管机械吹打后， 1 200 r/min离心5 min弃上清，沉淀加入无血清DMEM/F12培养液(含2%B27，20 ng/L表皮生长因子和20 ng/L碱性成纤维细胞生长因子)混悬，200目筛网过滤后进行细胞计数，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱进行培养，每隔两三天换液1次。原代培养7 d左右进行传代，传代后每3 d换液1次，大约7 d细胞克隆球传代1次，利用神经干细胞标志蛋白Nestin对神经干细胞进行鉴定，选择第3代细胞进行后续实验。

1.4.2 神经干细胞的诱导分化将神经干细胞接种至多聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被的培养板，加入含体积分数为1%胎牛血清、1%青链霉素、2%B27的DMEM/F12培养基进行诱导培养7-9 d。

1.4.3 实验分组与处理实验分为2组：对照组和异氟醚组。将6孔培养板细胞置于实验箱，异氟醚组通入2.8%异氟醚和体积分数为5%CO₂，体积分数为95%O₂的混合气体^[10]；对照组仅通入体积分数为5%CO₂，体积分数为95%O₂的混合气体。干预6 h后，取出6孔培养板再放入37 ℃细胞培养箱中继续培养2 h。

1.4.4 免疫荧光染色和CCK-8检测细胞增殖情况利用抗BrdU单克隆抗体进行免疫荧光染色检测细胞增殖情况。收集第3代对数生长期的神经干细胞，轻轻吹打为单细胞悬液，接种至含盖玻片的24孔板中，于异氟醚干预前30 min，各组细胞培养液中掺入10 μmol/L BrdU。待异氟醚干预完成后，立即更换新鲜培养液，在37 ℃，体积分数为5%CO₂条件继续培养3 d后进行免疫荧光细胞化学染色检测：①滴加0.01 mol/L pH 7.4的PBS于盖玻片，10 min后弃去，使标本保持一定温度。②滴加一抗BrdU(1︰100)，37 ℃保温30 min。③用0.01 mol/L pH 7.4的PBS洗涤浸泡3次。④加入FITC标记的二抗，37 ℃保温30 min，用0.01 mol/L pH 7.4的PBS洗涤浸泡3次。⑤用滤纸吸去多余水分，滴加缓冲甘油封固。⑥荧光显微镜下每组随机选择5个视野，计数BrdU阳性细胞数和细胞总数，以BrdU阳性细胞数/细胞总数比值反映神经干细胞增殖能力。

另外随机取6孔细胞，以酶标法使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力，酶标仪测定450 nm波长处吸光度值。

1.4.5 Western blot法测定神经元标志物β3-微管蛋白和胶质细胞标志物GFAP蛋白的表达异氟醚干预后，弃去培养液，用冷PBS洗涤细胞3次，加入适量的RIPA全细胞裂解液裂解5-10 min，12 000 r/min离心15 min，收集上清，BCA法测定蛋白浓度，提取细胞总蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳，电转法将蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入β3-微管蛋白、GFAP一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗室温孵育2 h，化学发光法ECL显影，采用Image Pro Plus 6.0软件分析β3-微管蛋白和GFAP蛋白相对于内参β-actin的表达水平。

1.5 主要观察指标 ①神经干细胞培养形态。②免疫荧光化学染色检测BrdU阳性表达情况。③CCK-8法检测吸光度值。④Western blot法测定神经元标志物β3-微管蛋白和胶质细胞标志物GFAP蛋白表达。

1.6 统计学分析计算结果利用x(_)±s表示，组间比较行t 检验，数据处理采用SPSS 19.0软件，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

在动物大脑海马区存在神经干细胞，可以发生增殖分化，形成神经元^[10-13]。对于新生动物而言，神经干细胞处于生长高峰期，且取材方便^[14-16]。实验取新生7 d龄大鼠海马培养神经干细胞，使用无血清DMEM/F12培养液(含2%B27，20 ng/L表皮生长因子和20 ng/L碱性成纤维细胞生长因子)进行培养，其中添加的细胞生长因子、B27起促进神经干细胞分裂增殖，抑制细胞分化的作用。通过以上技术，可以培养出特征性神经球干细胞。

麻醉药物会对神经系统产生一定的影响，研究表明其可能是通过影响神经干细胞功能或形态而引起认知功能障碍和行为改变。依据Culley等^[17]和Sall等^[18]实验采用2.8%异氟醚作用6 h干预神经干细胞，以了解吸入麻醉药异氟醚对神经干细胞增殖以及分化的影响。

实验采用BrdU标记的方式观察神经干细胞的增殖情况^[19]。利用BrdU对细胞进行标记之后，随着细胞的分裂和增殖，BrdU可以继续存在于细胞中^[20-23]，还可以随着细胞分裂传递到子细胞^[24-27]。因此，用BrdU对神经干细胞进行标记，免疫荧光化学染色检测BrdU的表达情况，可以较为直观的了解神经干细胞的增殖情况^[28-32]。实验结果显示，异氟醚组BrdU标记的神经干细胞数目明显少于对照组(P < 0.05)，表明异氟醚可有效抑制神经干细胞的增殖能力。同样，采用CCK-8法也得到了相同的结果，异氟醚组的吸光度值显著低于对照组，即细胞数减少。另外，Jevtovic- Todorovic等^[33]还通过研究指出，新生大鼠进行异氟醚吸入麻醉之后，会导致大鼠脑组织神经元凋亡，相应的效应与异氟醚浓度以及时间之间呈现出一定的依赖性。但是，此次实验受到时间限制，并没有研究不同异氟醚浓度对新生大鼠齿状回神经干细胞增殖的影响，相关问题，还有待今后予以进一步分析。

β3-微管蛋白是一种微管蛋白，其作为神经元特有标志物，被广泛应用于神经生物学研究^[34-35]。GFAP是一种中间丝蛋白，其主要存在于星形胶质细胞内，可以作为胶质细胞的标志物^[36-37]。实验采用Western blot法测定神经元标志物β3-微管蛋白和胶质细胞标志物GFAP蛋白的表达，与对照组相比，异氟醚组GFAP表达升高(P < 0.05)，β3-微管蛋白表达无明显改变(P > 0.05)，说明异氟醚可促进神经干细胞更多地向星形胶质细胞分化，产生一定的促进作用。Sail等^[38]也通过研究发现，新生大鼠吸入异氟醚麻醉之后，海马区神经干细胞增殖会受到一定的抑制，但吸入麻醉可以促进神经干细胞向早期神经发生分化。Zhu等^[39]采用反复吸入方式对新生大鼠进行异氟醚吸入麻醉，并检测体内神经干细胞的增殖情况。结果发现，在接受异氟醚吸入麻醉处理之后，大鼠齿状回神经干细胞增殖受到显著抑制。Stratmann等^[40]通过研究指出，异氟醚吸入麻醉处理之后，新生大鼠齿状回神经干细胞增殖出现抑制现象，上述学者的研究结果均与此次实验结果一致，表明了异氟醚可通过诱导发育期海马神经干细胞增殖能力减弱和分化增加，最终导致海马神经干细胞数量减少。但是，Stratmann等^[40]实验没有观察到异氟醚吸入麻醉显著影响神经干细胞向神经元分化，与此次实验结果存在较大的差异，还有待进一步研究。

综上所述，新生大鼠海马齿状回神经干细胞经过异氟醚干预之后，其增殖以及分化能力均受到影响。其中，异氟醚会明显抑制神经干细胞的增殖能力，但会促进神经干细胞向星形胶质细胞方向分化。