碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植治疗肺动脉高压

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前正在兴起的干细胞治疗技术及基因修饰技术有可能在肺动脉高压治疗中获得独特疗效。
目的：探讨携带碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞移植对肺动脉高压大鼠血流动力学水平的影响。
方法：选择3周龄SD雄性大鼠，于体外进行骨髓间充质干细胞培养及纯化，在腺病毒介导下实施基因转染，使碱性成纤维细胞生长因子基因成功导入骨髓间充质干细胞。将60只SD大鼠给予野百合碱腹腔注射(50 mg/kg)进行肺动脉高压模型复制，随机分成3组，其中肺动脉高压组于颈内静脉移植1 mL的L-DMEM培养基，骨髓间充质干细胞组于颈内静脉移植1 mL空腺病毒载体转染的骨髓间充质干细胞悬液，碱性成纤维细胞生长因子组于颈内静脉移植1 mL腺病毒介导下碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞悬液。
结果与结论：经3周治疗后，各组大鼠动脉血压差异无显著性意义(P > 0.05)；其中碱性成纤维细胞生长因子组大鼠的肺动脉收缩期压力和平均肺动脉压明显低于肺动脉高压组、骨髓间充质干细胞组，差异有显著性意义(P < 0.05)；各组大鼠右心室的肥大指数比较差异无显著性意义(P > 0.05)；碱性成纤维细胞生长因子组大鼠血浆内皮素1水平明显低于肺动脉高压组、骨髓间充质干细胞组，差异有显著性意义(P < 0.05)。结果显示携带碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞移植，能够改善肺动脉高压大鼠肺血管的血流动力学水平，保护机体血管的内皮细胞，并拮抗血管的收缩。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 碱性成纤维细胞生长因子, 大鼠, 内皮素1, 血流动力学, 骨髓间充质干细胞, 肺动脉高压

Abstract:

BACKGROUND: Currently, emerging stem cell therapy and gene modification technology have the potential to get a unique effect in the treatment of pulmonary hypertension.
OBJECTIVE: To investigate the effects of transplantation of basic fibroblast growth factor-transfected bone marrow mesenchymal stem cells on the hemodynamic changes of pulmonary hypertension rats.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells from male Sprague-Dawley rats aged 3 weeks were cultured and purified in vitro, and then transfected with adenovirus-medicated basic fibroblast growth factor. Sixty Sprague-Dawley rats were enrolled to prepare pulmonary hypertension models through intraperitoneal injection
of 50 mg/kg monocrotaline and then randomly assigned into three groups: model group treated with transplantation of 1 mL L-DMEM via the jugular vein, cell transplantation group treated with transplantation of 1 mL untransfected bone marrow mesenchymal stem cell suspension, and transfection group treated with transplantation of 1 mL bone marrow mesenchymal stem cell suspension transfected with basic fibroblast growth factor.
RESULTS AND CONCLUSION: After 3 weeks of treatment, there were no differences in the arterial blood pressure of the three groups (P > 0.05); however, the systolic pressure of the pulmonary artery and mean pulmonary arterial pressure were significantly lower in the transfection group than the model group and cell transplantation group
(P < 0.05). Hypertrophy index of the right ventricle had no difference among the three groups (P > 0.05). The level of plasma endothelin 1 was significantly lower in the transfection group than the model group and cell transplantation group (P < 0.05). Experimental findings suggest that the transplantation of basic fibroblast growth factor-transfected bone marrow mesenchymal stem cells can improve the hemodynamic levels in pulmonary blood vessels of pulmonary hypertension rats to protect vascular endothelial cells and antagonize vascular contraction.

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Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Fibroblast Growth Factor 2, Hypertension, Pulmonary, Hemodynamics

中图分类号:

R394.2

宋燕峰，曹洁 . 碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植治疗肺动脉高压[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(6): 918-922.

Song Yan-feng, Cao Jie. Transplantation of basic fibroblast growth factor-transfected bone marrow mesenchymal stem cells in the treatment of pulmonary hypertension[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(6): 918-922.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞形态观察接种5 d后，首次换液可见细胞贴壁，散在分布于培养瓶底，呈菱形或三角形，胞体透亮，折光性好，细胞体变得细长，并有小丛形成。5-8 d后贴壁集落数目明显增多，随着细胞的不断扩增，细胞形态渐趋于一致，贴壁细胞分布均匀，以梭形为主，胞体饱满。第14，15天细胞集落逐渐与邻近集落融合成片，细胞形态未见明显变化(图1A)。传4代后细胞形态为三角形、多角形、梭形(图1B)。

流式细胞仪检测结果显示骨髓间充质干细胞均一性好，纯度达98%以上。

2.2 RT-PCR产物电泳鉴定结果经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染24 h后，碱性成纤维细胞生长因子组检测到碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达，对照组、空载病毒组未检测到碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达，表明碱性成纤维细胞生长因子基因已稳定整合入骨髓间充质干细胞的基因组中，见图2。

2.3 各组大鼠血流动力学水平变化经3周治疗后，各组动脉血压差异无显著性意义(P > 0.05)；其中碱性成纤维细胞生长因子组大鼠肺动脉收缩期压力为(36.338± 5.493) mm Hg，平均肺动脉压为(26.783±1.557) mm Hg，与肺动脉高压组以及骨髓间充质干细胞组相较，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.4 各组右室肥大指数比较在碱性成纤维细胞生长因子组大鼠中，右心室的肥大指数为43.311 1±8.171 68，与肺动脉高压组(47.969 1±8.352 72)及骨髓间充质干细胞组(47.861 1±11.531 25)比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 各组大鼠血浆内皮素1水平比较碱性成纤维细胞生长因子组大鼠血浆内皮素1水平为(24.974±7.538) ng/L，与肺动脉高压组(29.483±4.514) ng/L及骨髓间充质干细胞组(32.958±7.658 4) ng/L比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年1月至2014年7月在天津医科大学内分泌研究所实验室完成。

材料：

实验动物：清洁级成年雄性SD大鼠63只，体质量250-290 g，购于天津医科大学动物实验室，许可证号SCXK(津)20070001。

实验方法：

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定：3周龄SD雄性大鼠3只处死，全身浸入体积分数为75%乙醇中消毒，约 10 min。无菌条件下取出双侧胫骨和股骨，剪除骨端，10号注射器抽取1 mL DMEM完全培养基自一端冲洗，制成单细胞悬液，以3×10⁷ L^-¹细胞浓度接种至100 mL培养瓶中，

骨髓间充质干细胞移植联合碱性成纤维细胞生长因子基因治疗肺动脉高压大鼠实验所用试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
野百合碱	上海宝曼生物科技有限公司
L-DMEM培养基、0.25%胰酶	Sigma
胎牛血清	HYCLONE
空腺病毒的载体、携带碱性成纤维细胞生长因子基因腺病毒载体	中国医学科学院
ELISA试剂盒	上海宝曼生物科技有限公司
二氧化碳培养箱	Thermo

置于37 ℃、体积分数为5% CO₂及饱和湿度孵育箱中， 24 h后全量换液，以后每3 d换液1次，1周后按1∶2比例传代。逐日观察细胞的生长情况，待细胞融合达到80%-90%时，进行下一次传代，再次传代时按1∶3比例进行。经多次传代扩增培养，使大鼠骨髓间充质干细胞逐渐得到纯化和扩增。应用流式细胞仪检测大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原表达进行鉴定。

在腺病毒(Ad)介导下实施基因转染：骨髓间充质干细胞经体外进行培养及纯化后，使其传代为第4代，细胞融合达到80%后弃去上清，并置无血清培养基中培养24 h，之后按感染倍数(multiple infection，MOI)为10⁵加入携带碱性成纤维细胞生长因子基因腺病毒载体(Ad-bFGF) 200 μL，使其彻底覆盖细胞培养面积，在37 ℃恒温下孵育2 h，之后分别加入适量胎牛血清和L-DMEM培养基，按常规贴壁细胞继续培育1周后进行下列实验，检测前3 d勿更换细胞培养液。在同等条件下进行空载病毒转染(空载病毒组)，同等培养条件的正常骨髓间充质干细胞为对照组。

RT-PCR：采用Trizol(Takara公司)试剂说明书介绍的方法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA含量，取5 μL总RNA，在M-MLV反转录酶作用下合成cDNA；再取 5 μL反转录产物进行PCR扩增反应。

碱性成纤维细胞生长因子上游引物为5’-AGC CGG GAG CAT CAC CA-3’，下游引物为5’-CCC AGT TCG TTT CAG TGC C-3’，产物大小388 bp；β-actin上游引物为5’-AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC-3’，下游引物为5’-ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC-3’，产物大小 224 bp；PCR反应条件：94 ℃变性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，32个循环，最后72 ℃延伸7 min。每一PCR反应重复3次。

PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外透射反射仪观察扩增产物的大小及亮度并摄影。使用凝胶分析系统对扩增条带进行分析，以平均灰度值代表相应基因的表达量，并除以β-actin灰度值，所得数值作为各扩增产物mRNA的相对表达量。

野百合碱诱导肺动脉高压模型制备：成年雄性SD大鼠通过一次性腹腔注射野百合碱50 mg/kg进行造模，21 d后观察大鼠的食欲、行为等生活习性，并通过右心导管测定肺动脉压力，以平均肺动脉压>35 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)为造模成功。

实验分组及移植：60只SD大鼠随机分成肺动脉高压组、骨髓间充质干细胞组、碱性成纤维细胞生长因子组，每组20只，其中肺动脉高压组进行肺动脉高压模型复制后30 min，于颈内静脉移植1 mL L-DMEM培养基；骨髓间充质干细胞组进行肺动脉高压模型复制后30 min，于颈内静脉移植1 mL空腺病毒载体转染的骨髓间充质干细胞悬液(1.5×10¹⁰ L^-¹)；碱性成纤维细胞生长因子组进行肺动脉高压模型复制后30 min，于颈内静脉移植1 mL(1.5×10¹⁰L^-¹)腺病毒介导下碱性成纤维细胞生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞悬液。

主要观察指标：治疗3周后检测各组大鼠血流动力学水平，血浆内皮素1水平以及右心室的肥大指数[即右心室/(左心室+室间隔)比值]。

统计学分析：选择SPSS 19.0软件对数据予以统计处理，其中计量资料以x(_)±s表示，其计量资料对比选择t 检验，计数资料对比选择χ²检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

肺动脉高压主要以机体肺血管阻力呈持续增高为表现的一种综合征，可逐渐演变呈右心衰竭。患者静息状态平均肺动脉压达到25 mm Hg以上，即可确诊为肺动脉压高压^[17-19]。但最终表现为：机体肺血管的内皮细胞受损以及肺小动脉的重构，机体肺血管床的数量减少，引发肺循环的阻力呈持续升高，机体右心室肥厚出现等^[20-22]。所以，保护机体肺血管的内皮细胞，并阻止以及逆转机体肺血管床的重构，使肺血管床的面积扩大，为降低机体肺循环压力、预防肺动脉高压病变的重要环节^[23-25]。

骨髓间充质干细胞能够分化为内皮细胞，修复病变位置的血管内皮，从而抑制机体肺血管的重构^[26-28]；同时还能够发育为新生的血管网，并使循环血管床增多从而对肺动脉高压进行治疗，改善机体血流动力学的紊乱状态^[29-31]。据文献研究报道：应用骨髓间充质干细胞对肺动脉高压进行治疗，能够改善机体血流动力学异常状态^[32-35]。本研究中骨髓间充质干细胞移植组大鼠肺动脉收缩期压力和平均肺动脉压与肺动脉高压组大鼠比较，呈下降趋势，但差异无显著性意义。这可能是由于骨髓间充质干细胞单独应用的治疗效果不显著。

碱性成纤维细胞生长因子是成纤维细胞生长因子蛋白家族中的一员，具有广泛的生物学作用，能够对机体多种血管的内皮细胞表现出保护效果^[36]，与血管内皮的生长因子联用，能够发挥更为强大的细胞促生长功效，同时对血管的平滑肌细胞合成DNA不产生影响。据文献报道，在野百合碱的诱导下，大鼠实验模型肺动脉高压发生后，其肺血管内皮的细胞受损后，血管内皮生长因子表达呈显著降低^[37-39]。本研究中，在腺病毒介导下碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞组大鼠的肺动脉收缩期压力和平均肺动脉压均呈显著降低，同时右心室肥大指数有下调趋势，但3组之间右心室肥大指数相比较，差异无显著性意义。由此可见，应用碱性成纤维细胞生长因子与骨髓间充质干细胞移植进行联合治疗^[40-41]，能够表达显著的疗效，同时也减缓逆转机体右心室肥大的趋势，使右心功能及时得到改善，而且该法优于骨髓间充质干细胞移植单独应用。在本研究中，各组动脉血压差异无显著性意义，也说明该治疗手段的安全性较好。

内皮素1为内皮细胞所合成的调节肽，能够使缩血管作用更为强烈持久，而且内皮素1与机体肺血管平滑肌上ET-A相结合，更能够刺激机体成纤维细胞以及肺血管平滑肌的增生，引发肺动脉高压继续出现并发展。在正常的健康人群中，其血浆内皮素1始终为低水平表现，内皮素1升高能够加速机体肺动脉转为高压的进程。本实验骨髓间充质干细胞携带碱性成纤维细胞生长因子基因治疗，能够有效减少机体内皮素1的产生，同时血浆内皮素1水平也呈显著下降趋势(P < 0.05)，可见具有显著保护机体肺血管结构以及功能的效果，这说明联合应用更具有优势。

综上所述，携带碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞移植治疗能够在不影响大鼠机体血流动力学的基础上，使肺动脉收缩期压力和平均肺动脉压显著降低，能够改善大鼠机体肺血管中血流动力学指标，同时降低血浆中的内皮素1水平，能够保护机体血管的内皮细胞，并拮抗血管的收缩。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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