灯盏细辛联合骨髓间充质干细胞移植对脑梗死的保护作用机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：通过细胞移植重建损伤脑组织成为治疗脑梗死的新途径，骨髓间充质干细胞成为近年来细胞移植治疗领域的重要种子细胞之一。
目的：探讨灯盏细辛注射液联合骨髓间充质干细胞移植对急性脑梗死大鼠S100B蛋白及超氧化物歧化酶表达的影响。
方法：采用线栓法制作大鼠急性脑梗死模型，建模成功后将80只SD大鼠随机分为对照组、灯盏细辛组、骨髓间充质干细胞组及联合组。分别于治疗前后用酶联免疫法检测各组大鼠血清S100B蛋白水平，黄嘌呤氧化酶法检测各组大鼠血清超氧化物歧化酶的表达；通过NIHSS神经功能评分观察模型大鼠的神经行为学变化，通过TTC染色测定脑梗死体积。
结果与结论：在治疗后第3，7，14天，灯盏细辛组、骨髓间充质干细胞组的S100B蛋白水平明显低于对照组，但高于联合组，差异有显著性意义(P < 0.05)；灯盏细辛组、骨髓间充质干细胞的超氧化物歧化酶表达水平明显高于对照组，低于联合组，差异有显著性意义(P < 0.05)；治疗后第1，2，3周各组的NIHSS神经功能评分比较，联合组<灯盏细辛组及骨髓间充质干细胞组<对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；在治疗后2周联合组的脑梗死体积明显小于灯盏细辛组及骨髓间充质干细胞组，灯盏细辛组及骨髓间充质干细胞组又明显小于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。结果表明灯盏细辛注射液联合骨髓间充质干细胞移植能够抑制急性脑梗死大鼠S100B蛋白表达，提高超氧化物歧化酶活性，从而起到脑保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 灯盏细辛, 骨髓间充质干细胞, 急性脑梗死, S100B蛋白, 超氧化物歧化酶

Abstract:

BACKGROUND: Cell transplantation becomes a new approach for treatment of cerebral infarction. In recent years, bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) have become an important kind of seed cells in cell transplantation.
OBJECTIVE: To investigate the effect of fleabane injection combined with BMSC transplantation on S100B protein and superoxide dismutase expression in acute cerebral infarction rats.
METHODS: Animal models of acute cerebral infarction were made in Sprague-Dawley rats using suture method. After successful modeling, 80 model rats were randomly divided into control group, fleabane group, BMSC group and combined group (fleabane combined with BMSC transplantation). Changes of serum S100B protein and serum superoxide dismutase levels were detected using enzyme-linked immunosorbent assay and xanthine oxidase method, respectively, before and after treatment. NIHSS neurological function scores were measured to observe neurological behavior changes in model rats. The infarct volume was measured by TTC staining.
RESULTS AND CONCLUSION: At 36, 7, 14 days after treatment, S100B protein levels in the fleabane group and BMSC group were significantly lower than that in the control group, but higher than that in the combined group (P <
0.05); serum superoxide dismutase levels in the fleabane group and BMSC group were significantly higher than that in the control group, but lower than that in the combined group (P < 0.05). At 1, 2, 3 weeks after treatment, NIHSS neurological function scores were ranked as follows: combined group < fleabane group and BMSC group < control group, and there was a significant difference between groups (P < 0.05). At 2 weeks after treatment, the infarct volume in the fleabane group and BMSC group was higher than that in the combined group but lower than that in the control group (P < 0.05). These findings indicate that fleabane combined with BMSC transplantation can inhibit the expression of S100B protein in rats with acute cerebral infarction, and promote the activity of superoxide dismutase, thereby playing a neuroprotective role.

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 6

2.1 骨髓间充质干细胞的形态原代培养第3天细胞数量较少、散在分布，可见呈圆形的红细胞以及非贴壁的有核细胞；第5天后细胞铺满培养瓶底面，较多集落细胞形成，细胞细小呈长梭形；传代到第3代时的细胞胞体饱满、漩涡状生长，细胞呈多角形、不规则形，折光性强，长有两个或多个突起，有的突起相互连接，可见细胞核及核仁，见图1。

2.2 实验动物数量分析实验选用83只SD大鼠，做干细胞培养时处死1只，建模失败及死亡2只，最终进入结果分析80只SD大鼠。实验流程见图2。

2.3 各组大鼠治疗前后S100B蛋白水平变化在治疗后第3，7，14天，灯盏细辛组、骨髓间充质干细胞组的S100B蛋白水平明显低于对照组，但高于联合组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1，图3。

2.4 各组大鼠治疗前后超氧化物歧化酶活性变化灯盏细辛组、骨髓间充质干细胞组的超氧化物歧化酶表达水平明显高于对照组，低于联合组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2，图4。

2.5 各组大鼠NIHSS神经功能评分比较治疗后1，2，3周的NIHSS神经功能评分比较：联合组明显低于灯盏细辛组及骨髓间充质干细胞组，灯盏细辛组及骨髓间充质干细胞组又明显低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3，图5。

2.6 各组大鼠脑梗死体积在治疗后2周联合组的脑梗死体积明显小于灯盏细辛组及骨髓间充质干细胞组，灯盏细辛组及骨髓间充质干细胞组又明显小于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2013年8月至2015年4月在河南医科大学动物实验室完成。
1.3 实验动物和材料 SD大鼠83只，清洁级，1月龄，雌雄不限，体质量为210-235 g, 采购于河南医科大学动物实验室，动物质量合格证号：DK0504(豫)0001，饲养于常温环境下，让其自由进食和饮水。实验中对动物的处置方法符合动物伦理学要求。

1.4 实验方法
1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离培养随机取1只SD大鼠，给予水合氯醛麻醉后处死，将全身浸入体积分数为75%乙醇中消毒约10 min。在无菌环境下分离出双侧的胫骨、股骨，剔除骨端, 选用10号注射器吸取1 mL DMEM完全培养基自一端开始冲洗，制成细胞悬液，调整细胞浓度为3×107 L-1，接种于100 mL培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5% CO2及饱和湿度的孵育箱中孵育，24 h后首次全量换液，之后每3 d换液1次。倒置显微镜下观察细胞生长状况，待细胞出现80%融合时，按照1︰2的比例开始行下一次传代。经过多次传代扩增后，细胞逐渐得到纯化。选择生长良好的第1，2，3代骨髓间充质干细胞，加入0.25%胰酶消化5 min，用含胎牛血清的培养液终止消化，PBS冲洗后以1 000 r/min离心5 min，收集骨髓间充质干细胞悬液，调整细胞终浓度为2.5×109 L-1以待备用。
1.4.2 大鼠急性脑梗死模型的建立采用线栓法制作大鼠急性脑梗死模型，给予水合氯醛腹腔注射麻醉，将大鼠以俯卧位固定于无菌操作台上，做一颈正中切口，游离右侧颈总、颈内和颈外动脉，用准备好的尼龙线结扎颈总动脉、颈外动脉，在颈总动脉分叉下方剪一切口，采用明胶处理过的1.8号鱼线自切口处插入右颈内动脉，鱼线进入深度达17.0-18.0 mm处结扎颈内动脉，使血供完全阻断，阻断120 min后抽出尼龙线，恢复再灌注。急性脑梗死模型建立成功的标志为大鼠即刻出现右侧Horner征。
1.4.3 实验分组及干预建模成功的80只SD大鼠随机分为对照组、灯盏细辛组、骨髓间充质干细胞组及联合组，每组20只。造模后2周，对照组腹腔注射生理盐水45 mg/kg、灯盏细辛组腹腔注射灯盏细辛注射液45 mg/kg(连续注射 5 d，1次/d)、骨髓间充质干细胞组腹腔注射骨髓间充质干细胞悬液1 mL(细胞浓度为2.5×109 L-1，连续注射5 d，1次/d)，联合组腹腔注射骨髓间充质干细胞悬液1 mL(细胞浓度为2.5×109 L-1)的同时联合注射灯盏细辛注射液45 mg/kg (均连续注射5 d，1次/d)。
1.4.4 酶联免疫吸附法(ELISA法)检测各组大鼠血清S100B蛋白水平于治疗前及治疗后第3，7，14天，采用

ELISA法检测各组大鼠血清S100B蛋白水平。空腹抽取SD大鼠尾静脉血3 mL，于室温下放置2 h后，以3 000 r/min的离心速度离心15 min，分离血清，储存于-80 ℃冰箱中进行冰冻。严格按照S100B ELISA试剂盒操作说明进行操作。利用ST-360酶标仪在450 nm波长处检测各孔的吸光度值，绘制标准曲线，计算相应样品浓度。
1.4.5 黄嘌呤氧化酶法检测各组超氧化物歧化酶的表达治疗前及治疗后第3，7，14天，采用黄嘌呤氧化酶法检测各组超氧化物歧化酶的活性。腹主动脉取血后，室温下静置20 min，以2 500 r/min的离心速度离心15 min后取血清，放置于-20 ℃冰箱中冰冻储存。操作时严格按照试剂盒说明书标准进行操作，依次加入相关试剂，采用分光光度计于波长550 nm处检测其吸光度值。超氧化物歧化酶的活性=(对照管吸光度-测试管吸光度)/(对照管吸光度× 50%)×166 U/mL。
1.4.6 通过NIHSS神经功能评分观察模型大鼠的神经行为学变化各组大鼠治疗前及治疗后1，2，3周，依据美国国立卫生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS)进行神经功能评分，NIHSS评分标准：总分为45分，0-15分为轻度神经功能损伤，16-30分为中度神经功能损伤，31-45分为重度神经功能损伤。评分越高表示神经功能缺损程度越严重。
1.4.7 TTC染色法计算脑梗死体积治疗后2周，采用3.5%水合氯醛过量麻醉SD大鼠，迅速断头取脑组织，置入-20 ℃冰箱冰冻后，做片厚为2 mm的冠状位切片。用2%的TTC在37 ℃下暗光染色30 min，正常脑组织染成红色，梗死灶为白色，采用40 g/L多聚甲醛固定24 h后摄像。利用计算机图像分析系统计算大鼠的梗死灶体积和体积百分比。梗死体积=梗死面积×切片厚度，全脑体积=全脑面积×切片厚度，梗死体积百分比=梗死灶体积/全脑体积，梗死体积的大小代表脑组织损伤的程度。
1.5 主要观察指标 ①各组大鼠血清S100B蛋白水平。②各组大鼠血清超氧化物歧化酶的表达。③各组大鼠NIHSS神经功能评分。④各组大鼠脑梗死体积。
1.6 统计学分析采用SPSS 13.0软件包进行处理。所有实验数据以x(_)±s表示，两组间连续变量比较用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

灯盏细辛注射液是从菊科植物灯盏花中提取、精制而成的纯中药制剂，味辛、微温，主要成分为灯盏花素总黄酮，具有较强的活血化瘀功效，研究发现灯盏细辛具有调节血管内皮功能、改善血液流变学、抑制血小板聚集、调节免疫及减轻炎症反应、抗自由基损伤、保护神经元与防治细胞毒性、缓解脑血管痉挛、改善微循环等功能^[10-12]，临床上多用于急性脑梗死的治疗^[13-18]。
S100B蛋白是星形胶质细胞增生的标志物，位于中枢神经系统胶质细胞和神经膜细胞中，在脑梗死发生后，S100B释放到脑脊液中，通过血脑屏障进入血液，使血清中S100B蛋白表达增高，且其浓度会随着病情进展和时间的变化而变化^[19-23]。研究发现S100B亦是脑损伤的早期生化指标，S100B蛋白的表达变化亦可反映脑胶质细胞损伤的严重程度，对神经系统等多种疾病的诊断、进展及预后起到辅助作用^[24-29]。超氧化物歧化酶是体内最重要的自由基清除酶，能够间接反映机体脑细胞损害的程度。
本实验通过ELISA法及黄嘌呤氧化酶法对S100B蛋白及超氧化物歧化酶表达进行检测，结果显示，治疗后第3，7，14天，联合组S100B蛋白水平低于灯盏细辛组、骨髓间充质干细胞组；超氧化物歧化酶的表达水平明显高于灯盏细辛组、骨髓间充质干细胞组，均提示了灯盏细辛和骨髓间充质干细胞可以抑制S100B的表达而促进超氧化物歧化酶的表达，但是二者的联合效率要高于单独使用。通过NIHSS神经功能缺损评分以及TTC染色检测脑梗死体积结果显示，联合组的NIHSS评分明显高于灯盏细辛组及骨髓间充质干细胞组，且联合组的脑梗死体积明显小于灯盏细辛组及骨髓间充质干细胞组，表明灯盏细辛和骨髓间充质干细胞联合应用对神经功能恢复程度有较好作用。
目前的研究表明，S100B蛋白水平表达的下降也就降低了S100B蛋白对脑组织的神经毒性，减轻其对细胞生长抑制及凋亡的损伤性影响，而增强超氧化物歧化酶的活性，目的是为加强脑梗死后自由基的清除率，减轻自由基对脑组织的损害。
综上所述，灯盏细辛注射液及骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑梗死的保护作用有可能通过下调S100B蛋白的表达并增强超氧化物歧化酶的活性来实现的。灯盏细辛注射液及骨髓间充质干细胞移植二者联合应用后还可以促进脑梗死后神经功能的恢复，对减轻脑梗死体积及改善预后均发挥了较好疗效。灯盏细辛注射液及骨髓间充质干细胞移植还可能通过其他机制发挥脑保护作用，因研究资料有限，其余作用机制还尚待进一步研究探讨。