钼对食管癌细胞ECA-109化疗增敏及食管癌干细胞p75NTR的抑制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：食管癌化疗过程中很容易出现耐受性，无法达到令人满意的治疗效果，通过使用适当的敏感剂可以有效抑制肿瘤细胞以及肿瘤干细胞的增殖。
目的：探讨钼对食管癌细胞ECA-109化疗敏感性的影响及对食管癌干细胞p75NTR的抑制作用。
方法：取对数期食管癌细胞ECA-109 随机分为空白组、单纯顺铂组、单纯加钼组、顺铂加钼组，后3组采用不同的质量浓度进行实验。利用MTT法检测各组食管癌细胞ECA-109生长增殖情况，流式细胞仪检测各组食管癌干细胞p75NTR比例。
结果与结论：不同质量浓度顺铂对食管癌细胞ECA-109增殖有一定的抑制作用，且对食管癌干细胞具有较强的杀伤作用，随着给药质量浓度和时间的增加均呈增强趋势；单纯钼对食管癌细胞ECA-109的增殖抑制作用和对食管癌干细胞的杀伤作用均不明显；顺铂和钼联用对食管癌细胞ECA-109的抑制作用和对食管癌干细胞的杀伤作用增强，与单纯同质量浓度顺铂组及空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，且呈一定的浓度、时间依赖性。结果表明，钼可以提高顺铂的化疗敏感性，促进顺铂对食管癌细胞ECA-109以及食管癌干细胞p75NTR抑制作用的增强，可以作为一种重要的化疗增敏剂。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 钼, 食管癌, ECA-109细胞, 顺铂, 化疗, 敏感性, 化疗增敏, p75神经营养因子受体

Abstract:

BACKGROUND: In esophageal cancer chemotherapy, inhibiting proliferation of tumor cells and tumor stem cells can be effectively improved by using appropriate sensitive agents.
OBJECTIVE: To explore the effect of molybdenum on ECA-109 cell chemosensitivity and p75NTR cell inhibition in esophageal carcinoma cells.
METHODS: ECA-109 cells at logarithmic phase were selected and randomly divided into blank control group, cisplatin group, molybdenum group and molybdenum+cisplatin group (combination group). Molybdenum and cisplatin at different concentrations were used in the three groups. MTT assay was used to detect ECA-109 cell proliferation and growth; flow cytometry was used to detect the proportion of P75NTR cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Cisplatin at different concentrations showed a certain inhibitory role in ECA-109 cells, which had an increasing killing effect on esophageal carcinoma stem cells at dose- and time-dependent manner. Molybdenum alone had no remarkable killing effects on inhibiting ECA-109 proliferation and esophageal carcinoma stem cells. Combination of molybdenum and cisplatin was found to have an enhanced effect to inhibit ECA-109 cells and to kill esophageal carcinoma stem cells in a dose- and time-dependent manner, which was significantly different from the cisplatin group and blank control group (P < 0.05). These findings indicate that
molybdenum can promote and enhance the inhibitory effect of cisplatin on ECA-109 and p75NTR cells, which can be used as a chemosensitizer.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 6

2.1 食管癌细胞ECA-109培养结果对食管癌细胞ECA-109进行培养，可以发现细胞大多为椭圆形，细胞核大且圆，见图1。

2.2 食管癌细胞ECA-109生长曲线食管癌细胞ECA-109生长曲线呈现出“S”形，在传代培养后的1 d，细胞数未出现明显变化，培养2 d出现短暂的停滞，之后进入对数生长期，细胞数显著上升，曲线趋于陡峭，见图2。

2.3 顺铂对食管癌细胞ECA-109增殖抑制作用不同质量浓度顺铂对食管癌细胞ECA-109有一定程度的抑制作用，随着时间的推移和质量浓度的增加，其抑制作用不断增强，见表3，图3。

2.4 顺铂对食管癌干细胞p75NTR抑制作用不同质量浓度顺铂对食管癌干细胞p75NTR有抑制作用，给予5 mg/L顺铂后，食管癌干细胞p75NTR百分比为6.45%，给予 10 mg/L顺铂后，食管癌干细胞p75NTR百分比最高，之后出现显著下降趋势，说明顺铂质量浓度>10 mg/L时，对食管癌干细胞产生较强的杀伤作用，见表4，图4。

2.6 钼对食管癌干细胞p75NTR的抑制作用空白组p75NTR的百分率为2.1%-3.0%，钼处理组p75NTR的百分率为2.5%-2.9%，经比较差异无显著性意义(P > 0.05)，说明单独使用钼不会对食管癌干细胞产生明显的影响。
2.7 顺铂加钼对食管癌细胞ECA-109的增殖抑制利用30 mg/L顺铂与不同质量浓度钼对食管癌细胞ECA-109进行干预，结果可见细胞增殖抑制程度明显增强，与空白组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，且有一定的浓度、时间依赖性，见表5。

2.8 顺铂加钼对食管癌干细胞p75NTR的抑制作用30 mg/L顺铂与不同质量浓度钼共同作用后食管癌干细胞p75NTR比例减少更明显，随着质量浓度的上升，p75NTR百分比有不断下降趋势，说明顺铂加钼对食管癌干细胞产生较强的杀伤作用，对食管癌干细胞p75NTR产生较强的抑制，见表6。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞观察性实验。
1.2 时间及地点实验于2015年5至7月在南阳医学高等专科学校完成。
1.3 材料人食管癌细胞株ECA-109由南阳医学高等专科学校实验室提供，使用10%二甲基亚砜冻存液冷冻，低温冰箱保存。顺铂购自澳大利亚 Hospira Australia Pty Ltd，注册证号：H20090521，药品特性：化学药品， 50 mL∶50 mg。
1.4 实验方法
1.4.1 食管癌细胞ECA-109复苏与培养从低温冰箱中取出食管癌细胞ECA-109，置于恒温水浴箱进行溶解，在超净工作台上将细胞悬液转移到无菌离心管中，添加含胎牛血清的RPMI 1640培养液，充分混合均匀，置于室温条件下进行离心，去掉上清，仅保留白色沉淀物质，添加含胎牛血清的RPMI 1640培养液，用吸管反复吹打，然后转移到培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中进行孵育。观察细胞生长情况，待细胞贴壁，培养基呈现出浅黄色，更换培养液，之后每一两天更换1次。
1.4.2 食管癌细胞ECA-109传代培养待细胞爬满瓶底 80%时，去掉培养液，PBS洗涤，胰蛋白酶消化，镜下观察到细胞出现回缩、细胞间隙明显增大时终止消化，去除胰蛋白酶，添加含胎牛血清的RPMI 1640培养液。用吸管反复吹打贴壁细胞，获得单细胞悬液，充分混匀之后转移到新的培养瓶中，再次添加培养液，置于二氧化碳培养箱中进行培养。倒置显微镜下观察食管癌细胞ECA-109生长情况，取生长状态良好的细胞，消化后制成细胞悬液，以每孔4 000个接种于96孔培养板内，每天取3孔计数，计算均值，剩余细胞每3 d换液1次，连续观察9 d。以培养时间(d)为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线。

1.4.3 MTT法检测钼对食管癌细胞ECA-109增殖抑制作用取对数期食管癌细胞ECA-109接种在96孔板中，并随机分为4组，分组情况见表1。各组每浓度每个时间点均设置6个复孔，置于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中进行培养。于培养后24，48，72 h吸去上清液，PBS洗涤，添加 RPMI 1640培养液，并将10 μL MTT溶液加入培养孔，继续在37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中内孵育4 h，弃掉上清液，每孔添加100 μL二甲基亚砜，置于摇床中振荡10 min充分溶解结晶物。利用酶标仪检测590 nm波长处各孔吸光度(A)值，计算细胞生长抑制率。

1.4.4 流式细胞仪检测食管癌干细胞p75NTR比例取对数期细胞，随机分为3组，分组情况见表2。在培养24 h后取出用PBS洗涤，添加胰蛋白酶消化，常规离心弃上清，再加入PBS洗涤，再次离心，然后加入p75NTR直标抗体，避光静置25 min之后添加鞘液，滤膜过滤，流式细胞仪检测各组食管癌干细胞p75NTR比例。

1.5 主要观察指标 ①食管癌细胞ECA-109培养结果，描绘其生长曲线。②单独使用顺铂对食管癌细胞ECA-109和食管癌干细胞p75NTR的抑制作用。③单独使用钼对食管癌细胞ECA-109和食管癌干细胞p75NTR的抑制作用。④联合使用顺铂与钼对食管癌细胞ECA-109和食管癌干细胞p75NTR的抑制作用。
1.6 统计学分析实验数据利用SPSS 18.0软件进行分析，计量资料进行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。
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讨论

食道癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，顺铂化疗是一种常用的临床治疗方法[5]，但常规化疗有时无法获得理想的临床效果，为了提高治疗效果，可以使用一定的化疗增敏剂^[6] 。
微量元素与肿瘤之间存在一定的联系，钼是一种微量元素，存在于人体中，具有一定的生物活性^[4]。钼还是醛氧化酶的有效组成成分，醛氧化酶参与细胞内的电子传递活动和体内醛的氧化，使醛氧化为羧酸，消除醛类物质对机体的危害。另外，钼还与食管癌之间存在十分密切的联系。以往有学者通过调查发现，在食管癌发病率较高的地区，普遍存在饮水与作物缺钼的情况^[7]。为此，在对食管癌患者进行化疗的过程中，可以尝试使用钼作为增敏剂^[8]。
另外，肿瘤干细胞理论认为，肿瘤的复发和转移以及耐药等都与肿瘤中存在的肿瘤干细胞之间存在紧密的联系^[9-14]。p75NTR阳性细胞具有无限增殖、自我更新和多向分化能力等肿瘤干细胞特性，是一种特殊的蛋白受体，可作为食管癌干细胞的重要标志物^[15-19]。孙志刚等^[20]利用磁珠分选法分选p75NTR阳性细胞与阴性细胞，经生物学特性分析发现p75NTR阳性细胞具有一定的自我分化和更新以及增殖的能力，可以对化疗药物产生较强的耐受作用^[21-28]。
本实验单独使用钼以及与顺铂联合使用干预食管癌细胞，探讨钼的化疗增敏效果。实验结果显示，不同质量浓度顺铂对食管癌细胞ECA-109有一定程度的抑制作用，随着时间的推移和质量浓度的增加，细胞增殖抑制作用不断增强，不同质量浓度钼对食管癌细胞ECA-109增殖无明显抑制作用，仅仅在高质量浓度情况下观察到明显的增殖抑制效果，但分析出现这一结果的原因，可能与单纯化学反应有关，而临床治疗并不会使用高浓度钼^[29-33]。因此，单独使用常规剂量的钼，并不能具备化疗增敏效应^[34-37]。钼联合顺铂对食管癌细胞ECA-109的增殖有明显抑制作用，与顺铂组和空白组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，且呈一定的时间、浓度依赖性，说明钼与化疗药物联用可以达到很好的增敏效果。由此可以推测，钼本身并不能单纯用来进行化疗增敏，而需要与其他一些化疗药物予以联合使用，以获得理想的化疗增敏效果。单独使用钼也不会对食管癌干细胞产生明显的影响，顺铂加钼联用可以对食管癌干细胞p75NTR产生较强的抑制作用^[38-39] 。
流式细胞仪检测食管癌干细胞p75NTR的比例，结果显示不同质量浓度顺铂对食管癌干细胞p75NTR有抑制作用，顺铂质量浓度>10 mg/L时，对食管癌干细胞产生较强的杀伤作用。另外，研究结果还显示，在质量浓度较高的情况下，p75NTR细胞的比例会随着化疗剂量上升而出现逐渐下降的情况。这一结果也提示，顺铂在高质量浓度条件下，使用化疗药物可以常规杀死普通的食管癌细胞，同时也可以杀死部分肿瘤干细胞。但顺铂质量浓度较低的时候，p75NTR的比例会逐渐上升，即表明低质量浓度条件下，顺铂杀死的大多为普通食管癌细胞，而不会对食管癌干细胞产生较大的影响。总之，钼可以提高顺铂的化疗敏感性，促进顺铂对食管癌干细胞p75NTR抑制作用的增强，可以发挥出重要的化疗增敏作用。
综上，通过本次研究发现，钼可以提高顺铂的化疗敏感性，促进顺铂对食管癌细胞ECA-109以及食管癌干细胞p75NTR抑制作用的增强，可以作为一种重要的化疗增敏剂，具有一定的临床应用前景。但是，目前关于化疗过程中钼对顺铂化疗增敏的具体作用机制，尚缺乏明确的定论，还有待在今后予以进一步分析。

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