LIM矿化蛋白1/低氧诱导因子1α慢病毒载体转染脂肪源性干细胞的成骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α作为胞内蛋白，可分别从诱导成骨分化及促进血管再生两个方面促进成骨，联合二者高效诱导脂肪源性干细胞成骨分化具有重要的意义。
目的：探讨慢病毒载体介导的LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α双基因转染的脂肪源性干细胞成骨分化的情况。
方法：应用反转录PCR技术克隆目的基因LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α片段，并分别克隆于慢病毒骨架质粒pLVX-EF1α-DsRed-Hyg和pLVX-EF1α-IRES2-AcGFP1中，构建慢病毒载体主体质粒pLVX-EF1α-DsRed-Hyg-RLMP-1和pLVX-EF1α-AcGFP-RHIF-1α，随即与辅助质粒和包装质粒共转染Lenti-X 293T 细胞，包装慢病毒载体；采用组织块加酶消化法分离培养大鼠脂肪源性干细胞，使用流式细胞仪对其进行鉴定。分别在慢病毒转染脂肪源性干细胞 3，7，14 d后，应用反转录PCR 方法检测脂肪源性干细胞中成骨基因骨形态发生蛋白2、Runx-2、碱性磷酸酶、骨钙蛋白表达水平的同时检测血管内皮生长因子的表达水平。
结果与结论：pLVX-EF1α-DsRed-Hyg-RLMP-1和pLVX-EF1α-AcGFP-RHIF-1α可有效地转染入大鼠脂肪源性干细胞；反转录PCR结果显示成骨基因骨形态发生蛋白2、Runx-2、碱性磷酸酶、骨钙蛋白在LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α双基因转染后第7天都开始明显过表达，并且可持续到14 d。说明LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α双基因转染脂肪源性干细胞可提高其成骨活性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 低氧诱导因子1α, 脂肪源性干细胞, 基因疗法, LIM矿化蛋白1, 慢病毒载体, 转染, 成骨分化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: LIM mineralization protein-1 (LMP-1) and hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) as intracellular proteins can induce osteogenic differentiation and promote angiogenesis, respectively. Therefore, their combination is of great significance for effectively inducing the osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells.
OBJECTIVE: To study the osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells transfected by lentivirus vector carrying LMP-1 and HIF-1α.
METHODS: Reverse transcription-PCR technology was employed to clone LMP-1 and HIF-1α genes, and the genes were cloned to lentivirus vectors pLVX-EF1α-DsRed-Hyg and pLVX-EF1α-IRES2-AcGFP1 to construct main lentiviral vectors pLVX-EF1α-DsRed-Hyg-RLMP-1 and pLVX-EF1α-IRES2-AcGFP1-RHIF-1α. Then, Lenti-X 293T cells were transfected with main vectors pLVX-EF1α-DsRed-Hyg-RLMP-1 and pLVX-EF1α-IRES2-AcGFP1-RHIF-1α, packaging plasmid and coated plasmid. After that, lentiviral vectors were packaged to transfect adipose-derived stem cells from rats that were obtained by tissue explants culture and enzyme digestion methods. At 3, 7, 14 days after transfection, reverse transcription-PCR technology was adopted to detect the expression of osteogeic genes, such as bone morphogenetic protein 2, Runx-2, alkaline phosphatase, osteocalcin as well as to detect the expression of vascular endothelial growth factor.
RESULTS AND CONCLUSION: Lentiviral vectors pLVX-EF1α-DsRed-Hyg-RLMP-1 and pLVX-EF1α-IRES2-AcGFP1-RHIF-1α were effectively transfected into adipose-derived stem cells. Reverse transcription-PCR results showed that from the 7th day to the 14th day after lentivirus transfection, bone morphogenetic protein 2, Runx-2, alkaline phosphatase and osteocalcin all over-expressed. These findings indicate that the combination of LMP-1 and HIF-1α can enhance the osteogenic activity of adipose-derived stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Transfection, Cell Differentiation, Viruses

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 4

2.1 脂肪源性干细胞的鉴定 2.1.1 脂肪源性干细胞的形态原代分离的脂肪源性干细胞接种5-7 h后，部分细胞开始贴壁，变为纺锤形或长梭形，24 h后细胞能完全贴壁，呈纤维样细胞生长。随着培养天数增加，细胞开始呈集落样生长(图1A)。传代的脂肪源性干细胞，细胞贴壁时间和增殖时间明显加快，2 h细胞均可贴壁，呈均一的成纤维样细胞形态(图1B)。 2.1.2 脂肪源性干细胞的表面标记物流式细胞仪检测结果表明，第3代脂肪源性干细胞表面标志物CD29和CD49d均成强阳性表达，阳性率分别为99.9%和98.3%，而CD45及CD31均呈现阴性表达，阳性率仅为1.1%和1.2%(图1C-F)。 2.2 慢病毒表达载体的构建构建的慢病毒载体pLVX-EF1α-DsRed-Hyg-RLMP-1和pLVX-EF1α-AcGFP- RHIF-1α经菌落PCR鉴定及载体测序证实表达序列和表达框均正确(图2)。

2.3 慢病毒对大鼠脂肪源性干细胞的最佳转染效率当pLVX-EF1α-DsRed-Hyg-RLMP-1及pLVX-EF1α-AcGFP- RHIF-1α的MOI值分别为60及50时，脂肪源性干细胞的阳性率高达90%，说明重组慢病毒转染效率高，外源基因可以有效地表达。因此共转染实验选择MOI值为60(图3)。

2.4 转染后细胞的生长曲线如图4所示，各组细胞生长曲线均呈S型。第1天，各组细胞生长无明显差异。第3天开始，各组细胞生长开始进入对数生长期，其中低氧诱导因子1α基因组及双基因组与空白对照组相比细胞生长最快(P < 0.01)，且2组细胞生长趋势较为一致，至第7天生长达到顶点，第7-9天进入平台生长阶段。而空白对照组、空载体组及LIM矿化蛋白1基因组细胞从第3天开始生长增殖明显低于低氧诱导因子1α基因组及双基因组，至第5天开始至第9天，LIM矿化蛋白1基因组细胞生长最慢(P < 0.01)。

2.5 目的基因检测反转录PCR结果显示，转染后，与对照组和空载体组相比，双基因组细胞的LIM矿化蛋白1和低氧诱导因子1α的mRNA均高效表达，在转染后第7天达到高峰，21 d仍维持在较高水平，且其表达水平与单基因组无明显差异(P > 0.05；图5A)。2.6 脂肪源性干细胞中成骨基因的表达反转录PCR检测结果显示：与空载体组相比，LIM矿化蛋白1基因组及双基因组各成骨因子表达水平均显著增高(P < 0.01)，且双基因组大鼠脂肪源性干细胞细胞中骨形态发生蛋白2、Runx-2、碱性磷酸酶、骨钙蛋白的表达水平均高于LIM矿化蛋白1基因组。而低氧诱导因子1α基因组各成骨因子表达水平与空载体组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，仅血管内皮生长因子的表达水平在转染后明显高于空载体组(P < 0.01)。但双基因组除成骨因子明显高于其他组别之外，血管内皮生长因子的表达水平在转染后也明显高于空载体组(P < 0.01)，但与低氧诱导因子1α基因组相比较无明显差异(P > 0.05；图5B-F)。

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引言

研究表明，联合应用信号传导路径重叠或会聚数型的骨形态发生蛋白，可获得最大的成骨协同效应^[1]。LIM矿化蛋白1作为一种具有高效成骨特性的胞内蛋白，可通过瀑布效应和级联反应，诱导包括数型骨形态发生蛋白等多种成骨因子的产生，调控干细胞向成骨细胞分化，为骨再生提供一个良好的生长环境^[2-3]。而血管生成和血供重建是新骨生成的关键环节，低氧诱导因子1α是骨折后由于局部血流的下降造就损伤组织处于低氧环境所诱导产生的转录因子，可促进血管内皮生长因子、诱导型一氧化氮合酶、人血红素氧合酶1、血小板衍化生长因子、血管生成素2等表达，协调多个生长因子促进类似生理状态的血管再生，从而高活性诱导骨折部位血管形成，改善局部血运，更好地促进骨再生^[4-5]。近年研究发现，采用基因转染的方式可保证基因产物的局部靶向释放，最大限度地增加局部治疗效果，减少全身不良反应，而且多种基因可分别转导，并分别调控，其内源性合成的蛋白质比外源性重组蛋白具有更强的生物活性，并有实验证实通过这种方式可使促进骨愈合的生长因子在脂肪源性干细胞中稳定表达，更有效促进其定向分化^[6-7]。因此如若联合将LIM矿化蛋白1基因和低氧诱导因子1α基因经基因转移技术导入脂肪源性干细胞内，通过2种胞内上游因子的调控，促进相关多个生长因子的表达，可促进类似生理状态的骨折修复的过程，不仅可能会加速骨诱导、骨形成过程，而且可实现骨与血供的联合重建，从而加快骨愈合速度。作者拟应用慢病毒载体将LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α转染入大鼠脂肪源性干细胞，观察其对脂肪源性干细胞成骨分化的诱导作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

设计：体外实验。

时间及地点：实验于2014年2月至2015年1月在西安体育学院实验中心室及第四军医大学全军骨科研究所完成。

材料：

动物：5周龄雄性SD大鼠14只，体质量120-140 g，由第四军医大学动物实验动物中心提供，动物质量合格证号：SYXK(军)2014-0025。相关实验经西安体育学院动物伦理委员会批准。

脂肪源性干细胞成骨分化诱导实验使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
质粒pLVX-EF1α-IRES2-AcGFP1、pLVX-EF1α-DsRed-Hyg、Lenti-X™ HTX Packaging System、Lenti-X 293T细胞、无四环素胎牛血清	美国Clontech 公司
大肠杆菌菌株TOP10	陕西东奥生物科技有限公司
限制性内切酶 EcoⅠ、BamHⅠ和BstBⅠ、PrimeScriptII 1^st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimerSTAR DNA Polymerase、DNA Ligation Kit、RNAiso Plus、Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver3R	日本Takara公司
dNTP、Plasmid Mini KitⅠ	美国Omega 公司
PureYield™ Plasmid Midiprep System	美国Promega 公司
胎牛血清、高糖DMEM 培养基	美国Gibco 公司
MTT	美国Sigma公司
染色缓冲液	杭州联科生物技术股份有限公司
流式细胞仪	美国Beckman Coulter公司
恒温细胞培养箱	德国Heraus公司
倒置荧光显微镜	日本Olympus公司
酶联免疫监测仪	芬兰Labsystems公司

方法：

大鼠脂肪源性干细胞原代分离、培养及纯化：①SD大鼠引颈法处死，无菌条件下取出双侧腹股沟脂肪垫。②应用眼科剪将脂肪组织反复剪碎成大约1 mm³细小组织块后，加入2 mLⅠ型胶原酶消化液(1 g/L)，37 ℃恒温摇床振荡消化30 min后，加入等体积含血清培养基中止消化，离心、弃去上清液及悬浮脂肪组织，加入细胞培养基重悬，接种于培养皿中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱内培养。③48 h后首次换液，以后每2 d换液1次。④当细胞生长融合达80%以上，以0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后按1∶2的比例传入25 cm²培养瓶中。用上述方法传2次，获得第3代脂肪源性干细胞备用^[8]。

流式细胞仪检测脂肪源性干细胞表面标志：①取第3代生长良好的脂肪源性干细胞，培养至对数生长期后，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗涤后，300目筛网滤过，染色缓冲液重悬细胞为1×10¹⁰ L^-¹。②取50 μL细胞悬液，加于流式上样管，分别加入FITC-CD29、PE-CD45及APC-CD49d抗体，避光室温孵育35 min，孵育完毕后Staining Buffer洗涤细胞2次，1 000 r/min离心5 min。重置细胞于400 μL 染色缓冲液中，上机进行流式细胞检测，使用Beckman Coulter软件(美国Beckman Coulter公司)采集数据。

慢病毒载体pLVX-EF1α-DsRed-Hyg-RLMP-1和pLVX-EF1α-AcGFP-RHIF-1α的构建：以大鼠cDNA为模板(陕西东奥公司提供)，分别用RLMP-1-F/R及RHIf-1α-F/R引物扩增。引物信息见表1。随后进行胶回收、酶切后应用DNA Ligation Kit将上述酶切产物连接到慢病毒载体pLVX- EF1α-DsRed-Hyg和pLVX-EF1α-AcGFP并转入TOP10感受态细胞，继而取已转化的感受态细胞100 µL加入到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上，用无菌刮铲轻轻将细胞均匀涂开，直至液体被吸收，倒置平板，37 ℃恒温培养箱过夜。第2天挑取阳性克隆接种于5 mL含抗生素的LB培养基中，37 ℃ 300 r/min振荡培养16-18 h，抽取质粒后进行凝胶电泳鉴定。

慢病毒的包装：①取对数生长期且细胞状态良好的Lenti-X 293T细胞接种到10 cm培养皿中，37 ℃、体积分数5%CO₂的恒温细胞培养箱中培养。②2个EP管中分别配制质粒准备液和Xfect Polymer准备液各600 μL。其中质粒准备液中含有557 μL 反应缓冲液、36 μL Lenti-X HTX Paclaging Mix及7 μL Lenti-X Vector DNA(1 μg/μL)；Xfect Polymer准备液中含有592.5 μL Reaction Buffer和7.5 μL Xfect Polymer。③将Xfect Polymer准备液加入质粒准备液中形成转染工作液，涡旋混匀。④转染工作液在室温下孵育10 min，使其形成纳米颗粒后，将1 200 μL转染工作液逐滴加入准备好的Lenti-X 293T细胞中，摇动培养皿，使转染工作液均匀分布在整个培养皿中，在37 ℃，体积分数5%CO₂恒温培养箱中培养过夜。⑤弃培养基，PBS洗2次，加入新鲜培养基10 mL，继续在37 ℃，体积分数5% CO₂中培养。⑥每12 h收集病毒上清液，收集3次后进行病毒浓缩。⑦收集的病毒上清液以离心方式去除细胞碎片后加入病毒浓缩柱中，超滤离心，吸取收集柱上层液体，即浓缩后病毒液，液氮速冻后-80 ℃保存。

脂肪源性干细胞最佳转染复数(multiplicity of infection，MOI)的确定：将2×10⁵-4×10⁵个脂肪源性干细胞接种到3.5 cm细胞培养皿中，细胞培养基为含体积分数10%胎牛血清的α-MEM完全培养基。分别以不同MOI值向脂肪源性干细胞中加入不同量的浓缩病毒液，随后置于37 ℃，体积分数5%CO₂条件下培养48 h。倒置荧光显微镜下观察分别表达DsRed或AcGFP荧光蛋白的脂肪源性干细胞，确定最佳MOI值。

MTT法检测细胞转染后生长状况：MTT定量检测转染后2，4，6，8，10，14 d活细胞数量的变化情况。将不同组别及不同时间点细胞PBS冲洗后加入MTT溶液(0.5 g/L)，37 ℃置放4 h，去除上清液，每孔加入1 mL二甲基亚砜，振荡10 min后，取100 μL各溶解液加入96孔板，选择492 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定吸光度值。细胞活力以吸光度值表示。

慢病毒转染：将传至第3代的脂肪源性干细胞2×10⁶-3×10⁶个接种至3.5 cm培养皿中，待细胞贴壁且融合度达70%时以最佳MOI值加入病毒量进行脂肪源性干细胞慢病毒转染。实验分为5组：不进行处理的脂肪源性干细胞为空白对照组、用不含目的基因的慢病毒载体转染的脂肪源性干细胞作为空载体组、分别携带LIM矿化蛋白1基因(LIM矿化蛋白1基因组)、低氧诱导因子1α基因(低氧诱导因子1α基因组)及LIM矿化蛋白1-低氧诱导因子1α双基因(双基因组)的慢病毒转染的脂肪源性干细胞作为实验组。

反转录PCR法检测成骨基因mRNA的表达：分别于转染后3，7，14 d用Trizol法提取各组脂肪源性干细胞的总RNA，反转录为cDNA，设计引物(表2)，用反转录PCR法检测成骨基因骨形态发生蛋白2、Runx-2、碱性磷酸酶、骨钙蛋白表达水平，同时检测血管内皮生长因子的表达水平。以β-actin作为内参，扩增条件为：94 ℃ 8 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 35 s，共40个循环。

主要观察指标：转染后不同时间点细胞的骨形态发生蛋白2、Runx-2、碱性磷酸酶、骨钙蛋白和血管内皮生长因子的表达水平。

统计学分析：采用 SPSS 15.0统计软件进行统计分析，数据表示为x(_)±s。采用方差分析比较不同时间点及组间差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

LIM矿化蛋白1是近年证实的具有较高成骨活性的胞内蛋白，其在成骨细胞的分化、成熟中均具有重要作用^[9]。研究发现将LIM矿化蛋白1转入成骨前体细胞、骨髓基质干细胞等具有多分化潜能的细胞后均可在体内外诱导成骨^[10-11]。前期实验中作者也发现了LIM矿化蛋白1转入骨髓基质干细胞后碱性磷酸酶活性及体外矿化结节的形成均被提高^[12]。关于LIM矿化蛋白1作为胞内蛋白促进细胞成骨分化的机制尽管尚未清晰，但研究显示LIM矿化蛋白1转染入细胞后的不同时间点骨形态发生蛋白2，4，6，7及转化生长因子β1蛋白的表达均可上调^[13]，因而研究者认为其是通过招募多种骨生长因子参与成骨细胞分化，促进骨的形成。在众多招募的骨生长因子中，有研究发现，LIM矿化蛋白1基因转入细胞后，在成骨细胞分化成熟过程中起重要作用的细胞外蛋白骨形态发生蛋白2以及成骨细胞分化的关键调控转录因子核心结合因子(Runx-2/Cbfα1)基因的表达可明显上调，蛋白合成也明显增加^[14]。李雪峰等^[15]通过慢病毒载体将LIM矿化蛋白1基因转入脂肪源性干细胞后同样也发现上调骨形态发生蛋白2的表达。而本实验中，与空载体组相比，单独LIM矿化蛋白1基因在转染入大鼠脂肪源性干细胞后的3，7，14 d可明显上调骨形态发生蛋白2及Runx-2的表达，进一步说明LIM矿化蛋白1在促进脂肪源性干细胞的成骨分化过程的机制上可能类似于其他干细胞。然而，骨缺损的修复与再生是多因素、多种生长因子共同参与的结果，其中最重要的是成骨和血管化的过程^[16-17]。因此，骨组织工程技术应用的大多研究通过将促成骨分化及促血管再生的2种基因共转染种子细胞实现骨与血供的联合重建^[18-19]。最新的研究表明，血管内皮生长因子是促进血管生长最重要的生长因子，其联合LIM矿化蛋白1应用可较骨形态发生蛋白与血管内皮生长因子更有效促进成骨前体细胞的分化和异位骨的形成。但与此同时，该研究发现血管内皮生长因子联合LIM矿化蛋白1尽管可上调成骨分化特定因子—Runx-2的表达，但相关基质蛋白骨钙蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达却无明显上调。作者提出仅血管内皮生长因子的应用可能影响成骨细胞后期基质蛋白的生成^[20]。血管的形成已被证实是受多因子影响的，研究显示单独应用血管内皮生长因子促进形成的新生血管较为细小，而且仅应用血管内皮生长因子不能帮助获得成熟和稳定的血管网^[21]。因而作者推测LIM矿化蛋白1与血管内皮生长因子联合应用虽然不影响细胞的前期成骨分化潜能，但后期由于血管内皮生长因子对血管形成的影响可导致相关基质蛋白合成不足，而这将导致新生骨薄弱，不足以应对正常应力所需。缺氧诱导因子1α是目前发现的最重要的缺氧感受因子与缺氧诱导的转录因子，可调控多种基因的转录活性，主要涉及血管的再生^[22]。作为促进血管再生的上游基因，除血管内皮生长因子是低氧诱导因子1α的主要下游靶基因外。再者，大多实验结果表明，血管生成与骨形成耦合的过程中，低氧诱导因子1α是必需的关键因子^[23]。在低氧诱导因子1α高表达的小鼠成骨过程中血管内皮生长因子浓度升高，血管化明显，Wang等^[24]认为骨发育过程中低氧诱导因子1α途径与血管化密切相关。而Wan等^[25]在小鼠骨修复模型成骨阶段发现低氧诱导因子1α不仅是血管生成必不可少的调控因子，并且可以加速骨组织再生。为了克服低氧诱导因子1α在体内自然表达的局限性，有实验将低氧诱导因子1α基因转入组织工程骨的种子细胞—骨髓基质干细胞中，发现在常氧状态下修饰后的骨髓基质干细胞可高表达成血管和成骨相关因子，高效修复骨缺损^[26]。因此，本实验中选取了低氧诱导因子1α与LIM矿化蛋白1联合促进脂肪源性干细胞的成骨分化，如实验初期所预测的，研究结果显示双基因组较单基因LIM矿化蛋白1基因组可明显促进脂肪源性干细胞的成骨分化。成骨细胞典型标志物，早期阶段的碱性磷酸酶及后期基质合成阶段的骨钙蛋白的表达均较单基因LIM矿化蛋白1基因组明显增加。关于低氧诱导因子1α诱导骨形成的作用机制，学者们认为一方面是通过其下游基因血管内皮生长因子的介导作用，另一方面低氧诱导因子1α可直接诱导相关成骨因子的表达^[27-28]。本实验结果显示单独低氧诱导因子1α基因组在转入脂肪源性干细胞后的不同时间点仅有血管内皮生长因子的表达明显高于空载体组及LIM矿化蛋白1基因组，而骨形态发生蛋白2及Runx-2的表达明显低于LIM矿化蛋白1基因组，与空载体组相比无明显差异。提示在双基因诱导脂肪源性干细胞成骨分化的过程中，低氧诱导因子1α可能主要是通过血管内皮生长因子的介导。以往研究中发现与低氧诱导因子1α转入骨髓基质干细胞不同的是，低氧诱导因子1α对于脂肪源性干细胞的成骨分化无明显促进作用^[29-30]。即使在成骨诱导液中培养的且高表达低氧诱导因子1α的脂肪源性干细胞也仅有促血管生成因子，例如血管内皮生长因子表达的增高，相关成骨基因的表达及成骨分化结果与并未出现提高^[31-32]。本实验同样发现，在高表达低氧诱导因子1α的脂肪源性干细胞组中，仅有血管内皮生长因子表达上调，而相关诱导成骨因子骨形态发生蛋白2和Runx-2表达未有明显增加，而且成骨细胞标志性基因碱性磷酸酶、骨钙蛋白的表达也未见明显上调。但是，本实验结果却显示低氧诱导因子1α与LIM矿化蛋白1联合双基因转染的脂肪源性干细胞成骨基因碱性磷酸酶及骨钙蛋白的表达较两单基因转染组明显提高的同时血管内皮生长因子的表达却较低氧诱导因子1α单基因组未明显上调，提示双基因的联合应用可明显促进脂肪源性干细胞的成骨分化。分析可能主要是由于以下原因：①LIM矿化蛋白1可上调骨形态发生蛋白2以及Runx-2的表达促进脂肪源性干细胞的成骨分化，而之前有研究提示低氧诱导因子1α促进骨的形成和发生，主要是通过血管内皮生长因子介导的Runx-2水平提高来实现的。Runx-2作为一种成骨细胞特异性转录因子和成骨细胞分化的调节因子，能够激活和启动间充质干细胞向成骨细胞系分化并调节成骨细胞的成熟，且Runx-2基因有可能是骨发生、骨形成过程中成骨细胞分化的特异性标志基因。有实验证明缺乏Runx-2基因和蛋白表达的间充质干细胞完全缺乏分化为成骨细胞的能力^[33]。结合以上资料，不难推测Runx-2是间充质干细胞成骨分化的关键分子。因而低氧诱导因子1α与LIM矿化蛋白1的联合应用可能进一步促进成骨诱导因子Runx-2表达，从而扩大了LIM矿化蛋白1对于脂肪源性干细胞的促成骨分化作用。②研究证明LIM矿化蛋白1的一小段序列可与Smurf1的ww2结构域作用，阻止Smurf1与Smad1/5结合，抑制Smads的泛素化降解，最终增强细胞对骨形态发生蛋白的反应性，尤其是骨形态发生蛋白2的反应性，从而促进成骨。而有研究发现低氧诱导因子1α可显著增强Smad1/5/8磷酸化过程^[34]，因而二者的联合应用可能进一步促进了脂肪源性干细胞对骨形态发生蛋白2的反应性，从而促进了成骨的分化。本实验中发现低氧诱导因子1α基因组和双基因组的增殖均明显高于空载体组及LIM矿化蛋白1基因组，提示低氧诱导因子1α可促进脂肪源性干细胞的生长。有学者提出，胰岛素样生长因子2和转化生长因子作为低氧诱导因子1α的主要靶基因，能激活低氧诱导因子1α表达的信号通路，促进细胞的增殖^[35]。因而通过促进细胞的增值，增加了脂肪源性干细胞分化形成的成骨细胞数量，间接促进了成骨。因此，双基因的联合对脂肪源性干细胞的成骨分化促进作用是相互增进的，一方面低氧诱导因子1α可通过对LIM矿化蛋白1成骨作用的进一步增强以及促进细胞增殖来扩大LIM矿化蛋白1对脂肪源性干细胞成骨分化；另一方面LIM矿化蛋白1则弥补了低氧诱导因子1α对脂肪源性干细胞成骨分化诱导的不足。有研究者在体外比较了腺病毒、反转录病毒和慢病毒载体对脂肪源性干细胞的转染率并对其分化后的基因表达进行了比较分析。发现3种载体中，慢病毒载体可获得较高的转染效率(>90%)^[36]。因此本实验采用了慢病毒系统作为LIM矿化蛋白1和低氧诱导因子1α基因递送载体。构建后的荧光表达率结果及反转录PCR结果均支持慢病毒载体作为转导载体，尤其是针对脂肪源性干细胞是有效的。综上所述，本实验采用慢病毒载体介导的LIM矿化蛋白1/低氧诱导因子1α双基因转染脂肪源性干细胞可明显提高其成骨分化能力，这为今后脂肪源性干细胞应用于运动性骨损伤修复奠定了确实的实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工