灯盏花素联合骨髓间充质干细胞移植促进脑梗死大鼠神经功能恢复

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：灯盏花素治疗脑梗死疗效确切、不良反应少、远期疗效稳定、毒副作用少，能够改善脑梗死后中枢神经系统受损区的微环境。
目的：探讨灯盏花素注射液联合骨髓间充质干细胞移植对脑梗死神经功能恢复及生长相关蛋白43表达的影响。
方法：将60只大脑中动脉闭塞模型SD大鼠随机分为脑梗死组、骨髓间充质干细胞移植组和联合组。建模6 h后通过尾静脉注射1 mL PBS、1 mL骨髓间充质干细胞悬液(2.5×106)、1 mL骨髓间充质干细胞悬液(2.5× 106)+灯盏花素注射液75 mg/kg，连续注射5 d，1次/d。
结果与结论：移植后2周，免疫荧光法观察到BrdU阳性标记的骨髓间充质干细胞主要集中于梗死灶周围且联合组的BrdU阳性细胞数量多于骨髓间充质干细胞组及脑梗死组(P < 0.01)；移植后1，2，3周联合组的神经功能障碍评分明显低于骨髓间充质干细胞组及脑梗死组(P < 0.05)；移植后2周，与骨髓间充质干细胞组及脑梗死组比较，联合组的脑梗死面积明显减小，水肿程度明显减轻，生长相关蛋白43的表达明显增高(P < 0.05)。光镜下联合组脑梗死组织中胶质细胞明显增生，脑组织水肿有明显减轻。结果表明灯盏花素注射液联合骨髓间充质干细胞可明显减轻脑梗死面积及水肿程度，促进大鼠脑梗死后神经功能恢复及梗死灶生长相关蛋白43的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 灯盏花素注射液, 骨髓间充质干细胞, 生长相关蛋白43, 脑梗死, 大鼠, 神经功能

Abstract:

BACKGROUND: Breviscapine treatment of cerebral infarction has curative effects, few side effects, stable long-term efficacy and few side effects, which can improve the micro-environment of damaged central nervous system after cerebral infarction.

OBJECTIVE: To investigate the effects of breviscapine injection combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on neurological recovery and growth-associated protein 43 expression in rats after cerebral infarction.

METHODS: Sixty Sprague-Dawley rats undergoing middle cerebral artery occlusion were randomized into cerebral infarction group, cell transplantation group and combined group. At 6 hours after modeling, 1 mL PBS,
1 mL bone marrow mesenchymal stem cell suspension (2.5×106), and 1 mL bone marrow mesenchymal stem cell suspension (2.5×106)+75 mg/kg breviscapine injection were respectively injected via the tail vein in the three groups, once a day, continuously for 5 days.

RESULTS AND CONCLUSION: At 2 weeks after transplantation, BrdU-positive bone marrow mesenchymal stem cells were mainly gathered in the peri-infarction region, and the number of positive cells was higher in the combined group than the other two groups (P < 0.01). At 1, 2, 3 weeks after transplantation, the neurological deficit scores were significantly lower in the combined group than the other two groups (P < 0.05). At 2 weeks
after transplantation, the combined group had smaller infarct size, milder edema, and higher expression of growth-associated protein 43 as compared with the other two groups (P < 0.05). Under light microscope, glial cells proliferated dramatically and brain edema significantly reduced in the combined group. These findings indicate that breviscapine injection combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can significantly reduce infarct size and brain edema, promote neurological recovery and increase the expression of growth-associated protein 43 in rats with cerebral infarction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, GAP-43 Protein, Brain Infarction

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 4

2.1 骨髓间充质干细胞的形态原代细胞培养4 d首次换液可见细胞稀少，呈亮点状贴壁生长，散在分布于培养瓶底。培养5-8 d时可观察到细胞呈长梭形，有少量集落形成，胞体饱满，可见细胞核及核仁，形态渐趋于一致，贴壁细胞分布较均匀，当细胞融合时，呈平行或漩涡状生长。培养14至15 d时贴壁集落数目明显增多，分布均匀，与邻近集落融合成片，单个细胞呈长梭形、胞体饱满。经多次传代后的骨髓间充质干细胞呈漩涡状分布，均一性较好，形态基本一致，纯度达97%以上，见图1。 2.2 实验动物数量分析参加实验65只SD大鼠，细胞培养2只，造模63只，造模过程中失败和死亡3只，进入结果分析60只SD大鼠。

2.3 Longa行为学评分在移植后1，2，3周，联合组的神经功能障碍评分明显低于骨髓间充质干细胞组及脑梗死组(P < 0.05)，各组Longa评分见表1，图2。

2.4 各组脑梗死面积及脑水肿程度比较移植后2周，与骨髓间充质干细胞组及脑梗死组比较，联合组的脑梗死面积减小、脑组织含水量减少(P < 0.05)。各组梗死面积、脑组织含水量见表2。

2.5 RT-PCR检测生长相关蛋白43 mRNA的相对表达量将PCR产物条带进行扫描统计分析显示：联合组中的生长相关蛋白43 mRNA表达(1.72±0.09)明显高于骨髓间充质干细胞组及脑梗死组(0.96±0.08，0.58±0.06)，差异有显著性意义(P < 0.05)。 2.6 免疫荧光染色观察结果骨髓间充质干细胞移植后2周，联合组的梗死灶内可见大量大小不等BrdU阳性细胞，骨髓间充质干细胞主要分布于梗死灶周围区，高倍镜下，骨髓间充质干细胞呈椭圆形或圆形，胞体较大，胞核显见。联合组的BrdU阳性细胞数呈高表达，骨髓间充质干细胞组呈弱表达，脑梗死组无表达，见图3。2.7 光镜下大鼠脑组织病理变化移植后2周，脑梗死组切片可见皮质部较大的苍白球梗死灶，且梗死中心区域坏死较彻底，细胞核可见皱缩或消失，周围神经细胞数目有明显减少，脑组织水肿较为严重，见图4A；骨髓间充质干细胞组切片周边可见胶质细胞增生，脑组织水肿较脑梗死组有减轻，见图4B；联合组切片周边胶质细胞增生明显，脑组织水肿较脑梗死组及骨髓间充质干细胞组明显减轻，见图4C。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2014年1月至2015年2月在天津医科大学动物实验室完成。

材料：

灯盏花素联合骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死大鼠实验所用主要试剂、设备：
试剂、设备	来源
DMEM/F12	Sigma公司
0.25%胰蛋白酶	GibcoBRL公司
胎牛血清	Coulter(USA)公司
兔抗大鼠IgG SABC试剂盒	SANTA公司
辣根酶标记山羊抗兔IgG 抗体	Santa Cruz公司
BrdU抗体	上海浩然生物技术有限公司
mRNA提取试剂盒、PCR反应试剂盒	美国Hyclone公司
GAP-43、GDNF、β-actin引物	Gene bank基因公司合成
M-MLV反转录酶	英国RS Biotech公司
超净工作台	苏州安泰空气技术公司
二氧化碳培养箱	Thermo Forma公司
荧光倒置显微镜	日本Nikon公司

实验动物：清洁级1月龄雌性SD大鼠65只，体质量180-220 g，采购于中国医学科学院动物实验室(动物质量合格证号：SCXK20090028)，实验中对动物的处置方法符合动物伦理学要求。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离培养：取1月龄雌性SD大鼠2只，于100 g/L水合氯醛麻醉状态下处死，全身浸入体积分数为75%乙醇中，消毒约10 min。根据无菌操作原则取出双侧胫骨、股骨，剪除骨端，用10号注射器抽取1 mL DMEM完全培养基自一端冲洗，制成单细胞悬液，按3×10⁷ L^-¹细胞浓度接种于100 mL培养瓶中，放置于 37 ℃、体积分数为5% CO₂及饱和湿度孵育箱中，24 h后全量换液，以后每3 d换液1次。逐日观察细胞生长情况，待细胞达到80%-90%融合时，按1∶2比例进行下一次传代。经过多次传代扩增培养后，骨髓间充质干细胞逐渐得到纯化、扩增。选取生长良好的1，2，3代骨髓间充质干细胞，用0.25%胰酶消化5 min，以含胎牛血清的培养液终止消化，PBS清洗，1 000 r/min离心5 min，收集培养的大鼠骨髓间充质干细胞悬液，将终浓度调整为2.5×10⁹ L^-¹备用。

动物模型的建立：应用线栓法建立大脑中动脉阻塞模型，用2.5%氯胺酮20 mg/kg于大鼠腹腔注射麻醉，取俯卧位，在颈正中做一切口，游离右侧颈总、颈内和颈外动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉，在颈总动脉分叉下方剪一切口，明胶处理过的1.8号鱼线经切口插入右颈内动脉，进线深度为17.0-18.0 mm，结扎颈内动脉，以完全阻断血供。阻断120 min后抽出尼龙线，恢复再灌注。建模成功的标志：大鼠即刻出现右侧Horner征。

实验分组和干预：将建模成功的60只大鼠(建模过程中失败和死亡共3只大鼠)随机分为脑梗死组、骨髓间充质干细胞移植组和联合组，每组20只。建模6 h后脑梗死组经尾静脉分别注入1 mL PBS，骨髓间充质干细胞组注射1 mL骨髓间充质干细胞悬液(2.5×10⁶)；联合组联合注射灯盏花素注射液75 mg/kg和骨髓间充质干细胞悬液1 mL(2.5×　10⁶)，均连续注射5 d，1次/d。

Longa神经功能评分：采用Longa标准法进行大鼠神经功能评分。每组大鼠在移植前(模型制作后24 h)及移植后1，2，3周分别参考Longa法进行神经功能缺损评分。Longa评分标准：0分，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分：向外侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。

脑梗死面积和脑水肿程度：采用面积百分比计算脑梗死面积。移植后2周，每组取5只大鼠，行断头取脑，小脑去除后，在冠状面将大脑以平均厚度切片均分为5片，置入TTC溶液中，在37 ℃下孵育15 min，大鼠脑组织梗死区域无着色，正常脑组织染成红色，经生理盐水清洗后拍照，利用透明坐标纸在照片上测量梗死面积。应用干湿质量法检测脑水肿程度^[16]，求出脑组织含水量。脑组织含水量(%)=(脑湿质量-脑干质量)/脑湿质量×100%。

RT-PCR检测脑组织生长相关蛋白43的表达：移植后2周取大鼠脑梗死区组织制备匀浆，用Trizol提取RNA，以紫外分光光度仪测定RNA的含量，根据MMLV试剂盒中步骤将RNA反转录成cDNA再将cDNA进行RT-PCR分析。按照Trizol说明书介绍的方法提取组织总RNA，以总RNA为模板，通过RT-PCR两步法试剂盒将mRNA反转录成cDNA，反应条件：30 ℃，10 min→2 ℃，30 min→99 ℃，5 min→5 ℃，5 min。将cDNA于-20 ℃保存。将反转录所得cDNA为模板进行扩增，扩增参数：93 ℃，2 min→(95 ℃，30 s→55 ℃，30s→72 ℃，30 s)×35个循环→72 ℃， 5 min。取5 mL的PCR产物通过琼脂糖进行电泳，以β-actin作为内参照，电泳后置GDSS000凝胶自动成像仪上拍照提取图像，Image-Pro Plus8.0软件分析生长相关蛋白43条带与β-actin条带的灰度相对比值，进行mRNA半定量分析。

各基因引物序列：
基因	引物序列	产物长度(bp)	温度 (℃)
生长相关蛋白43	上游5’-GCA GGA CGA GGG TAA AGA-3’ 下游5’-CAC GCA CCA GAT CAA ATA A-3’	374	55
β-actin	上游5’-CCA TCA TGA AGT GTG ACG TTG-3’ 下游5’-ACA GAG TAC TTG CGC TCA GGA-3’	175	55

免疫荧光染色观察骨髓间充质干细胞存活情况并计数：移植后2周取各组梗死脑组织，制备切片各10张，加入一抗兔抗鼠BrdU多克隆抗体，二氨基联苯胺(DAB)显色后观察，荧光显微镜于100倍放大条件下观察，胞核着棕黄色的细胞判定为阳性。镜下观察，在每个盖玻片的中心和四周随机选择5个视野，进行细胞计数并镜下拍照记录，计算BrdU阳性细胞数的平均值。

苏木精-伊红染色光镜下观察脑梗死组织的病理学变化：移植后2周，各组大鼠腹腔注射2.5%氯胺酮(20 mg/kg)进行麻醉，断头后迅速取脑，用多聚甲醛水溶液浸泡24 h后，经脱水、透明、浸蜡、包埋，连续冠状切片(片厚10 μm)，每隔100 μm连续取5张，苏木精-伊红染色、中性树胶封固，光镜下观察。

主要观察指标：①神经功能缺损评分。②脑梗死面积和脑水肿程度。③脑梗死灶周边区移植细胞的存活情况。④脑组织中生长相关蛋白43的表达。⑤脑梗死组织的病理学变化。

统计学分析：采用SPSS 13.0软件包进行处理。所有实验数据以x(_)±s表示，两组间连续变量比较用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脑梗死后脑供血相继中断，导致脑组织局部发生缺血、缺氧，进而导致脑组织能量代谢障碍，与此同时血流对脑组织又存在着再灌注的损害，所以脑梗死后神经元的损害机制是一个会产生级联反应的复杂的生理、病理过程^[16-20]，具体机制还需进一步探讨，目前研究表明其可能的机制有兴奋性氨基酸毒性、能量代谢障碍、钙离子超载、炎症反应的损害、自由基过度增加的损害等^[21-24]，它们之间彼此重叠又相互关联。因此，早期用药逆转这些不可逆损伤是非常重要的^[25]。多项研究表明灯盏花素具有显著的脑保护作用，其可以扩张血管，改善微循环，提高心、脑血流量^[26-28]，减轻脑水肿和减少脑梗死范围，抑制血小板聚集、降低血黏度、改善血液流变学，清除自由基、抗脂质过氧化及缺血再灌注损伤等^[29-30]。在临床上，灯盏花素单味药的研究应用较为多见，其亦可运用于其他系统，但灯盏花素与骨髓间充质干细胞联合应用治疗脑梗死的实验及临床研究甚少^[31-32]，本实验将灯盏花素与骨髓间充质干细胞移植结合，观察二者联合应用后生长相关蛋白43的表达、神经功能缺损评分、脑梗死面积及脑组织病理变化，探讨其对脑神经保护作用机制。研究结果显示，移植后2周联合组的BrdU阳性数量多于骨髓间充质干细胞组及脑梗死组，提示了二者联合应用可以增加脑梗死灶BrdU阳性细胞的表达，可促进干细胞发挥其再生功能。通过Longa行为学评分结果观察到，在移植后的1，2，3周联合组的神经功能障碍评分明显低于骨髓间充质干细胞组及脑梗死组，表明二者联合应用可以促进梗死后的神经功能恢复。通过面积百分比法结果得出联合组的脑梗死面积明显小于骨髓间充质干细胞组及脑梗死组。应用干湿质量法检测到脑水肿程度联合组明显见轻于骨髓间充质干细胞组及脑梗死组，证明了灯盏花素具有减轻脑水肿和减小脑梗死范围的作用，此结果与吕曙华等^[33]的研究结果一致。生长相关蛋白43是构建中枢神经系统可塑性的基本物质，是研究神经生长及损伤修复的首选分子标记物^[34-41]。本研究通过RT-PCR检测生长相关蛋白43的表达，结果显示联合组的生长相关蛋白43表达明显高于骨髓间充质干细胞组及脑梗死组，光镜下观察到联合组冠状切片中的胶质细胞明显增生，脑组织水肿明显减轻，表明将灯盏花素与骨髓间充质干细胞移植联合应用可以促进脑梗死后神经功能的恢复及生长相关蛋白43的表达。综上所述，灯盏花素联合骨髓间充质干细胞移植可明显改善脑神经细胞的损伤、死亡，减小梗死面积和减轻脑水肿。灯盏花素对脑梗死治疗由来已久，其疗效明确，且其对脑缺血的保护作用已在临床应用中得到证实，但将其与骨髓间充质干细胞移植联合应用所发挥的作用机制尚待进一步研究明确。

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