异氟醚麻醉抑制海马齿状回神经干细胞的增殖及分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：异氟醚由于起效快、苏醒迅速、无积蓄等优点在儿科手术也逐渐被推广使用，然而其安全性还需要进一步观察。
目的：观察异氟醚麻醉对新生大鼠海马齿状回神经干细胞增殖及神经元分化的影响。
方法：将大鼠随机分为异氟醚组和对照组，分别予以异氟醚吸入麻醉和仅吸入空气。分别在给药前及停止给约后对动物予以5-溴脱氧球苷(BrdU)腹腔注射，第2次注射后24 h处死大鼠，获得脑组织，检测BrdU+和脑内神经源性分化因子表达情况。
结果与结论：停止麻醉处理之后进行血糖以及动脉血气检测，发现异氟醚组大鼠PaCO₂出现轻度上升，pH值出现轻微下降，而PaO₂、BE、SaO₂以及血糖水平则均未出现改变。与对照组相比，异氟醚组经异氟醚麻醉之后，未出现明显的缺氧表现，包括紫绀和呼吸抑制等。大鼠海马齿状回神经干细胞大多分布在门区，异氟醚组的BrdU阳性细胞数少于对照组(P < 0.05)。两组大鼠海马齿状回存在大量新生细胞表达NeuroD，门区NeuroD+/BrdU+阳性细胞数明显高于颗粒细胞下区，且异氟醚组显著高于对照组(P < 0.05)。结果证实，异氟醚麻醉会对新生大鼠海马齿状回神经干细胞增殖及神经元分化产生一定的影响，抑制其增殖，并促进其神经元分化。

关键词: 干细胞, 神经干细胞, 异氟醚, 齿状回, 吸入麻醉, 大鼠, 新生, 细胞增殖, 神经元分化, 5-溴脱氧球苷, 脑内神经源性分化因子

Abstract:

BACKGROUND: Isoflurane is gradually popularized in pediatric surgery due to its rapid onset, rapid recovery, and no savings, but its security needs to be further studied.
OBJECTIVE: To explore the effect of isoflurane anesthesia on the proliferation and neuronal differentiation of neural stem cells in the dentate gyrus of neonatal rats.
METHODS: Rats were randomly divided into isoflurane group and control group, respectively treated with isoflurane inhalation and air inhalation. 5-Bromodeoxyuridine ball glycosides (BrdU) was intraperitoneally injected before drug administration and after drug withdrawal, and 24 hours after secondary injection, the rats were executed to take brain tissues for detection of BrdU expression and brain neurogenic differentiation factor expression.
RESULTS AND CONCLUSION: After cessation of anaesthesia processing for the detection of blood glucose and arterial blood gas, a mild rise in PaCO2 was found in the isoflurane group and pH showed a slight drop, but PaO2, BE, SaO2 and blood glucose levels were not changed. Compared with the control group, the isoflurane group did not appear with obvious hypoxia performances after isoflurane anesthesia, including cyanosis and respiratory depression. Rat neural stem cells of the dentate gyrus were mostly distributed in the gate area, and compared with the control group, the number of BrdU-positive cells was less in the isoflurane group (P < 0.05). A large number of new cells in the dentate gyrus expressed NeuroD, and the number of NeuroD+/BrdU+ cells in the gate area was significantly higher than that in the lower region of granule cells. Moreover, the number of
NeuroD+/BrdU+ cells in the isoflurane group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). These findings suggest that isoflurane anesthesia can influence the proliferation and neuronal differentiation of neural stem cells in the dentate gyrus of neonatal rats, which inhibits cell proliferation and promotes neuronal differentiation.

Key words: Isoflurane, Dentate Gyrus, Behavior, Animal, Therapeutic Uses, Anesthesia

中图分类号:

R394.2

卢成康. 异氟醚麻醉抑制海马齿状回神经干细胞的增殖及分化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(19): 3049-3053.

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2014年1月至2015年2月在甘孜州人民医院麻醉科完成。
材料：
实验动物：健康7日龄SD雄性大鼠10只，由济南市金丰实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK(鲁)：2014-0006，体质量16-20 g。
本次实验相关内容和方法均经本院伦理部门审核并批准，实验设计方案、使用动物品种品系规格、处死动物的方法、项目进行中涉及动物福利和伦理问题等均符合要求。

异氟醚麻醉对新生大鼠海马齿状回神经干细胞增殖及神经元分化的影响实验所使用的试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
荧光显微镜	上海蔡康光学仪器有限公司
气体监测仪	江苏奥凯医疗设备有限公司
5-溴脱氧尿苷	上海士锋生物科技有限公司
磷酸盐缓冲液	上海佳和生物科技有限公司
枸橼酸缓冲液	北京索莱宝科技有限公司
驴血清	广州蕊特生物科技有限公司
山羊抗神经源性分化蛋白抗体	上海钰博生物科技有限公司
荧光二抗	上海天承生物科技有限公司
正常羊血清	香港龙达生物科技有限公司
大鼠溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)抗体	上海研谨生物科技有限公司
山羊抗大鼠Dylight594抗体	上海百研生物科技有限公司
DAPl抗体	上海士锋生物科技有限公司
异氟醚	扬子江药业集团有限公司

实验方法：
实验分组：将10只SD大鼠随机分为2组，设为异氟醚组和对照组，每组5只，分别予以异氟醚吸入麻醉和仅吸入空气。
异氟醚吸入麻醉：将异氟醚组大鼠置于实验箱中进行异氟醚吸入，利用气体监测仪对异氟醚、O₂、CO₂体积分数进行检测和控制，吸入体积分数2.5%异氟醚3 min，然后将浓度降为1.5%维持4 h，异氟醚以混合空气输送，气体流量 1.5 L/min；对照组仅吸入空气。观察大鼠皮肤颜色和自主呼吸情况，停止麻醉处理之后进行血糖以及动脉血气检测。
5-溴脱氧尿苷处理：在对大鼠进行麻醉前以及吸入麻醉结束之后分别进行1次BrdU注射，并于第2次给药之后 24 h，处死大鼠，获得脑组织，制备切片。
免疫荧光染色和观察：对切片进行免疫荧光染色，利用枸橼酸缓冲液对切片进行微波修复，利用盐酸进行处理，使DNA发生变性。然后用驴血清对非特异性抗原予以封闭。利用山羊抗神经源性分化蛋白抗体进行孵育，置于4 ℃温度下，过夜。第2日弃去一抗，利用磷酸盐缓冲液进行漂洗。于室温、避光条件下利用荧光二抗进行1 h 的孵育，孵育结束弃去二抗，利用磷酸盐缓冲液进行漂洗。利用正常羊血清重新封闭，并加入大鼠抗BrdU抗体，置于4 ℃条件下进行孵育。孵育过夜后弃去一抗，利用磷酸盐缓冲液进行漂洗，并加入山羊抗大鼠Dylight594抗体，置于室温条件下进行1 h的孵育。孵育结束后利用磷酸盐缓冲液进行漂洗。DAPl复染，利用荧光显微镜进行观察，进行BrdU细胞计数。
NeuroD和BrdU双重荧光染色的鉴定：挑选相似平面切片3张，在街状回随机选取200个BrdU+细胞，进行NeuroD+细胞(发绿光)计数，计算NeuroD+细胞计数与BrdU+细胞计数的比值(NeuroD+/BrdU+)，以反映神经干细胞向神经元分化情况。
主要观察指标：①动物齿状回神经干细胞增殖情况。②动物齿状回神经干细胞向神经元分化情况。
统计学分析：对研究所得数据利用SPSS 16.0软件进行处理，其中组间计量资料比较均行成组t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。