丁香酚胚胎毒性评价：应用胚胎干细胞的实验模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：丁香酚在医学及食品领域的应用越来越广泛，其药理学作用也不断被研究和发现。但是，对其毒性的研究尚未建立完整的数据库，特别是发育毒性及致畸性的安全性评价亟需完善。
目的：建立胚胎干细胞实验模型的基础上，应用胚胎干细胞实验模型初步评价丁香酚的胚胎毒性。
方法：体外培养小鼠成纤维细胞3T3和小鼠胚胎干细胞E14TG2a，MTT法检测阳性对照5-氟尿嘧啶、阴性对照青霉素G和受试物丁香酚对3T3细胞和E14TG2a细胞的细胞毒性，计算3种化合物对E14TG2a细胞和3T3细胞的半数生长抑制浓度值；采用悬滴-悬浮-贴壁法体外诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化，根据浓度-反应曲线计算3种化合物对E14TG2a细胞的半数分化抑制浓度值。利用胚胎毒性预测模型预测丁香酚的胚胎毒性。
结果与结论：丁香酚对3T3细胞和E14TG2a细胞的增殖均有抑制作用，其半数生长抑制浓度值分别为(3.613±0.192)和(1.799±0.131) mg/L。丁香酚对E14TG2a细胞的心肌分化亦有抑制作用，其半数分化抑制浓度值为(3.501±0.158) mg/L。根据胚胎干细胞实验模型预测模型计算得出丁香酚为强胚胎毒性化合物。这为进一步评价丁香酚的安全性提供了研究数据。

关键词: 干细胞, 胚胎干细胞, 丁香酚, 胚胎发育, 胚胎干细胞实验模型, 胚胎毒性, 毒理学, 心肌细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: As the pharmacological effect of eugenol constantly being discovered, its application in medical and food industry becomes wider. However, its toxicity studies have not established a complete database, especially in the improvement of safety assessment of developmental toxicity and teratogenicity.
OBJECTIVE: To establish a model of embryonic stem cell test to evaluate the embryotoxicity of eugenol.
METHODS: Mouse fibroblasts (3T3) and mouse embryonic stem cells (E14TG2a) were cultured in vitro, and MTT test was performed to detect the cytotoxicity of 3T3 cells and E14TG2a cells with positive control 5-fluorouracil, negative control penicillin G and tested compound eugenol. The concentration of the tested compounds that inhibiting 50% viability of embryonic stem cells (IC50 E14TG2a) and 3T3 fibroblasts (IC50 3T3) was calculated. The hanging-suspension-adherent culture systems were used to induce embryonic stem cells into cardiomyocytes, and the concentration of tested compounds that caused 50% inhibition of differentiation of E14TG2a cells into cardiomyocytes (ID50 E14TG2a) was calculated. The embryotoxic potential of eugenol was classified by prediction model of the embryonic stem cell test.
RESULTS AND CONCLUSION: The proliferations of E14TG2a and 3T3 cells were inhibited by eugenol, of which the IC50 3T3 and IC50 E14TG2a values were (3.613±0.192) and (1.799±0.131) mg/L. The differentiation of E14TG2a was also inhibited by eugenol, of which the ID50 E14TG2a was (3.501±0.158) mg/L. Eugenol was evaluated as a chemical compound with strong embryotoxicity by the model of embryonic stem cell test.

Key words: Eugenol, Toxicity Tests, Inhibitory Concentration 50, Embryonic Stem Cells

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

2.1 培养的小鼠成纤维细胞和胚胎干细胞的形态在常规培养基中的小鼠成纤维细胞3T3 贴壁生长，细胞呈长梭形，大小较为均一(图1A)。ES-E14TG2a细胞则呈克隆样生长，克隆为典型的鸟巢样隆起，形态为圆形或椭圆形，边界清晰，形态均一，与滋养层细胞有明显界限(图1B)。

2.2 胚胎干细胞向心肌细胞分化实验采用悬滴-悬浮-贴壁法体外诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化。悬滴3 d后，每个悬滴中形成一个拟胚体(图2A)。将拟胚体转移至细菌培养皿继续悬浮2 d后，拟胚体进一步增大，形成类似球形或椭圆形，细胞聚集紧密(图2B)。将拟胚体接种于包被明胶的24孔板，拟胚体外侧自发分化出多种细胞形态(图2C)，贴壁3 d后即可见自发节律性收缩，随着培养时间延长，心肌细胞团逐渐增大，收缩细胞逐渐增多，有的可见多个收缩区域(图2D)。

2.3 胚胎干细胞实验模型建立与验证
2.3.1 5-氟尿嘧啶的胚胎毒性评价如图3A浓度-反应曲线所示，5-氟尿嘧啶对3T3细胞的增殖和E14TG2a细胞的增殖及分化均有较强的抑制作用，随着5-氟尿嘧啶浓度增加，细胞存活率逐渐下降，并呈一定剂量依赖关系。经计算其IC50 3T3为(0.267±0.050 3) mg/L，IC50 ES为(0.064±0.003 9) mg/L，ID50 ES为(0.051±0.004 3) mg/L。根据胚胎干细胞实验模型的3个线性判别函数，得到Ⅲ>Ⅰ且Ⅲ>Ⅱ，由模型预测可得5-氟尿嘧啶为强胚胎毒性化合物。
2.3.2 青霉素G的胚胎毒性评价如图3B浓度-反应曲线所示，根据胚胎干细胞实验模型得出青霉素G的IC50 3T3为(4 039±107.70)mg/L，IC50 ES为(2 481±142.40) mg/L，ID50 ES为(879.2±29.21) mg/L，再将3个反应终点代入预测模型的线性判别函数，得出Ⅰ>Ⅱ且Ⅰ>Ⅲ，根据胚胎干细胞实验模型的分类标准，青霉素G为无胚胎毒性化合物。
由于5-氟尿嘧啶和青霉素G两种化合物的预测结果都与欧洲替代实验验证中心的预测结果一致，证明本实验建立的胚胎干细胞实验模型模型可以准确预测受试物的胚胎毒性，因此可以用其来评价丁香酚的胚胎毒性。
2.4 丁香酚的胚胎毒性评价应用胚胎干细胞实验模型评价丁香酚的胚胎毒性，结果如图3C浓度-反应曲线所示，随着丁香酚浓度增加，3T3细胞及ES细胞增殖能力逐渐下降，说明丁香酚对ES细胞和3T3细胞增殖均有一定程度的抑制作用。随着丁香酚浓度增加，ES细胞定向分化为心肌细胞的能力亦逐渐下降，可见丁香酚对ES细胞分化也有一定程度的抑制作用。
根据浓度-反应曲线计算丁香酚的IC50 3T3为(3.613± 0.192) mg/L，IC50 ES为(1.799±0.131) mg/L，ID50 ES为(3.501±0.158) mg/L，将IC50 3T3、IC50 ES、ID50 ES值代入线性判别函数，得出Ⅲ>Ⅰ且Ⅲ>Ⅰ，按照胚胎干细胞实验模型的分类标准，丁香酚为强胚胎毒性化合物。

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引言

材料方法

设计：细胞毒性实验，细胞分化抑制实验。
时间及地点：实验于2013年3月至2014年3月在教育部重点实验室中山大学干细胞与组织工程研究中心完成。
材料：
动物：SPF级孕12.5 d昆明小鼠，鼠龄8-10周，饲养环境(温度18-26 ℃；相对湿度40%-70%)由中山大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(粤)2012- 0081。

丁香酚的胚胎毒性实验使用的主要试剂与仪器：
试剂及仪器	来源
H-DMEM培养基，胎牛血清	Hyclone公司
5-氟尿嘧啶，青霉素G	Sigma公司
丁香酚	Alfa公司
小鼠白血病抑制因子	Chemicon公司
细胞培养板、培养皿、培养瓶	Corning公司
二氧化碳恒温培养箱	美国Thermo公司
酶标仪	Tecan公司
倒置显微镜，相差显微镜	日本Olympus公司
直线加速器(γ射线)	荷兰PHILIPS公司 SL-18

细胞：小鼠胚胎干细胞E14TG2a及小鼠3T3细胞系购自美国ATCC公司。
方法：
小鼠成纤维细胞3T3的培养：从液氮中取出冻存的小鼠成纤维细胞3T3复苏，接种于25 cm²的培养瓶中，采用常规培养基[H-DMEM基础培养基，体积分数10%胎牛血清、1%双抗(50×10³ U/L青霉素、50 mg/L链霉素)]培养。细胞增殖达95%融合时进行传代。
饲养层细胞的制备[16]：处死孕12.5 d的昆明小鼠，无菌条件下取出小鼠胚胎，去除头、尾、内脏和四肢等，保留躯干部，用眼科剪刀剪成小块碎片，然后用0.25%胰蛋白酶消化10-15 min，终止消化，收集细胞悬液，1 500 r/min× 4 min离心，常规培养基洗涤沉淀，离心除上清，重悬细胞，将细胞接种于75 cm²的培养瓶中培养、扩增至第3代，经50 Gy的γ射线照射，冻存于液氮中。用前复苏至六孔板备用。
小鼠胚胎干细胞的培养：从液氮中取出小鼠胚胎干细胞E14TG2a复苏，接种于已铺好饲养层细胞的六孔板中，采用胚胎干细胞常规培养基[H-DMEM基础培养基，体积分数10%胎牛血清、1%双抗(50×103 U/L青霉素、50 mg/L链霉素)、2 mmol/L谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、0.1 mmol/L疏基乙醇和1.0×106 U/L 小鼠白血病抑制因子)进行培养。两三天后，小鼠胚胎干细胞克隆达60%-70%融合时传代。
建立胚胎干细胞实验模型：
胚胎干细胞实验模型的预测公式：胚胎干细胞实验模型的预测模型是利用胚胎干细胞实验模型3个反应终点[IC50 3T3、IC50 ES(培养干细胞的半数生长抑制浓度值)、ID50]对检测物质的胚胎毒性进行判断。通过比较3个线性判别函数的大小，对胚胎毒性进行分类。3个线性判别函数如下：
Ⅰ：5.916lg(IC50 3T3)+3.500lg(IC50 ES)-5.307[(IC50 3T3- ID50)/IC50 3T3]-15.27
Ⅱ：3.651lg(IC50 3T3)+2.394lg(IC50 ES)-2.033[(IC50 3T3- ID50)/IC50 3T3]-6.85
Ⅲ：-0.125lg(IC50 3T3)-1.917lg(IC50 ES)+1.500[(IC50 3T3- ID50)/IC50 3T3]-2.67
受试物胚胎毒性分类标准：1类：无胚胎毒性，即Ⅰ>Ⅱ且Ⅰ>Ⅲ；2类：弱胚胎毒性，即Ⅱ>Ⅰ且Ⅱ>Ⅲ；3类：强胚胎毒性，即Ⅲ>Ⅰ且Ⅲ>Ⅱ。
细胞毒性实验：将3T3细胞和ES细胞按细胞浓度1×107 L-1接种于96孔板，每孔50 µL；在体积分数5% CO₂和37 ℃孵育2 h，细胞贴壁后，加入150 µL含检测化合物(阳性对照5-氟尿嘧啶、阴性对照青霉素G和受试物丁香酚) 7个浓度梯度的检测培养基。于第3和5天换液，每孔 200 µL；第10天，相差显微镜下观察细胞形态，MTT法检测细胞活性，具体如下：加20 µL MTT(5 g/L)于培养板上所有孔中，37 ℃孵育2 h；去除MTT液，将板翻转于吸水纸1 min；每孔再加130 µL、37 ℃温育的MTT解吸液；在微孔板摇床上摇动微孔15 min以溶解蓝色偶氮，直到溶液清亮。采用酶标仪检测550-570 nm处吸光度值，绘制浓度-反应曲线，计算出受试物对ES细胞和3T3细胞的半数生长抑制浓度值(50% inhibitory concentration，IC50)。每种受试物各重复实验3次，取平均值。
小鼠胚胎干细胞的分化抑制实验：将受试物溶于胚胎干细胞分化培养基[H-DMEM培养基、体积分数20%胎牛血清、1%双抗(50×103 U/L青霉素、50 mg/L链霉素)、2 mmol/L谷氨酰胺、1%非必需氨基酸和0.1 mmol/L疏基乙醇]，制备成7个浓度梯度的检测培养基，其浓度设置与细胞毒性相同。胰酶消化ES细胞，采用含不同浓度检测化合物(阳性对照5-氟尿嘧啶、阴性对照青霉素G和受试物丁香酚)的检测培养基重悬ES细胞，制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为3.75×10⁷ L-1。将单细胞悬液以每滴20 µL(约750个细胞)滴置于100 mm×20 mm组织培养皿内盖上，加5-10 mL PBS于培养皿中，置于体积分数5% CO2饱和湿度培养箱，37 ℃，悬滴培养3 d。3 d后，倒置显微镜观察，每个悬滴中一个拟胚体。倾斜培养盖约45°将拟胚体冲到底部，转移至60 mm细菌培养皿，放入体积分数5% CO₂饱和湿度培养箱，37 ℃，悬浮培养2 d。吸取1 mL含不同浓度受试物的检测培养基于明胶包被的24孔板内，将拟胚体移至24孔板，每孔加入一个拟胚体，置于体积分数5% CO2饱和湿度培养箱，37 ℃，培养5 d。倒置显微镜下观察并计数每个培养板含心肌细胞搏动的孔数。溶剂对照组(丁香酚为无水乙醇溶解，因此溶剂对照组添加相应剂量的无水乙醇) 24孔板中含心肌细胞搏动的孔数设为100%，各浓度组搏动孔数与溶剂对照组相比得出各浓度组的百分率，绘制浓度-反应曲线。根据浓度-反应曲线计算对照与受试化合物半数分化抑制浓度值(ID50)。每种受试物各重复实验3次，取平均值。
验证胚胎干细胞实验模型：选择已通过欧洲替代实验验证中心验证的化合物5-氟尿嘧啶(强胚胎毒性)作为阳性对照、青霉素G(无胚胎毒性)作为阴性对照来验证胚胎干细胞实验模型的有效性。5-氟尿嘧啶从1 000 mg/L开始，依次按1∶10进行倍比稀释，共设7个检测浓度(1 000，100，10，1，0.1，0.01和0.001 mg/L)；青霉素G从10 000 mg/L开始，依次按1∶10进行倍比稀释，同样设7个检测浓度(10 000， 1 000，100，10，1，0.1和0.01 mg/L)，分别进行细胞毒性和分化抑制试验，获得各个试验的检测终点，再按照预测模型评价其胚胎毒性。
应用胚胎干细胞实验模型评价丁香酚的胚胎毒性：将丁香酚从1 000 mg/L开始，依次按1∶10进行倍比稀释，同样设7个检测浓度(1 000，100，10，1，0.1，0.01和0.001 mg/L)，分别进行细胞毒性和分化抑制试验，获得各个试验的检测终点，再按照预测模型评价其胚胎毒性。
主要观察指标：①小鼠成纤维细胞和胚胎干细胞的培养结果。②胚胎干细胞向心肌细胞诱导分化结果。③受试物细胞毒性及分化抑制实验结果。
统计学分析：采用SPSS 17.0进行数据分析，结果用 x±s表示。采用t 检验进行两组均数间比较。

讨论

本课题采用经欧洲替代实验验证中心推荐的胚胎干细胞实验模型进行胚胎发育毒性的评价^[17-21]。胚胎干细胞实验模型利用2种小鼠细胞系(成纤维细胞3T3和胚胎干细胞)进行细胞毒性实验及胚胎干细胞的分化抑制实验。细胞毒性实验采取MTT法得到反应终点(IC50 3T3、IC50 ES)，胚胎干细胞分化抑制实验通过ES细胞悬滴-悬浮-贴壁法获得反应终点(ID50)。预测模型(预测模型)建立了含有3个反应终点的3个线性判别函数，通过比较3个公式值的大小，将化合物的胚胎毒性分为无胚胎毒性、弱胚胎毒性和强胚胎毒性^[14]。欧洲替代实验验证中心采用胚胎干细胞实验模型对30种有明确体内胚胎发育毒性的化合物进行胚胎发育毒性检测，结果显示与体内结论的符合率达到82%，其中强胚胎毒性的符合率更达到100%^[22]。
丁香酚作为一种天然的植物提取物，有数千年的使用历史。近年来，随着其药理作用不断被发现，在医学中的应用越来越广泛。丁香酚通过鼻腔吸收能够兴奋中枢神经系统功能、影响情绪、改善脑组织代谢[23]。也有研究表明，丁香酚对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、变形杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌及18种真菌等有明显的抗菌作用[24]。此外，丁香酚具有较好的镇痛麻醉效果，使其在口腔药物领域得到广泛应用。尽管丁香酚毒副作用小，已有文献报道其安全无毒无刺激[1]。但是对其毒性的研究尚未建立完整的数据库，特别是发育毒性及致畸性的安全性评价亟需完善。
实验选取经欧洲替代实验验证中心验证的已知强胚胎毒性化合物5-氟尿嘧啶和无胚胎毒性化合物青霉素G作为对照[22]，来验证本实验建立的胚胎干细胞实验模型结果的有效性。经验证5-氟尿嘧啶和青霉素G的发育毒性与欧洲替代实验验证中心的结论具有一致性，证明本实验室建立的胚胎干细胞实验模型可以准确评价化合物的发育毒性。最后应用此模型得到丁香酚的3个检测终点，代入线性判别函数，得出Ⅲ>Ⅰ且Ⅲ>Ⅱ，推断其为强胚胎毒性化合物，为进一步评价丁香酚的安全性提供了研究数据，具有良好的社会经济效益。