胃癌干细胞对氟尿嘧啶敏感性及化疗药物耐受细胞的生物学机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：氟尿嘧啶是胃癌化疗的基础药物，临床上耐药现象较为常见。肿瘤干细胞对化疗药敏感性较低，可能是导致化疗后肿瘤复发进展的重要原因。
目的：探讨胃癌干细胞对氟尿嘧啶敏感性，从细胞生物学角度分析胃癌的化疗耐药机制。
方法：利用免疫组织化学染色法检测69例胃癌组织内干细胞标志物CD44和耐药蛋白胸苷酸合成酶表达情况；基于克隆形态的分选策略，从AGS胃癌细胞系内分离胃癌干细胞克隆，检测CD44和胸苷酸合成酶的表达和自我更新能力；利用CCK-8法检测不同AGS细胞克隆的5-氟尿嘧啶半数抑制浓度(IC50)。
结果与结论：69例胃癌组织标本中，胸苷酸合成酶和CD44的表达阳性率分别为57%(39/69)和61%(42/69)，CD44与胸苷酸合成酶的表达之间呈正相关关系(Kappa=0.41，χ²=11.59，P < 0.05)。AGS细胞系的克隆形成率为39%(29/69)，其中，副克隆、次克隆、全克隆所占比例分别为 17%(5/29)、69%(20/29)、14%(4/29)。二代克隆形成后，采用胰酶消化克隆并再次低密度接种传代，副克隆均无法传代，次克隆仅少数可连续传代，全克隆均可连续传代。不同浓度5-氟尿嘧啶作用之后，全克隆的生长抑制率均显著低于次克隆和AGS细胞，经比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。以上结果表明胃癌干细胞对5-氟尿嘧啶敏感性较低，其对化疗药物耐受，可能是临床胃癌化疗耐药的产生机制之一。

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 氟尿嘧啶, 胃癌, 敏感性, CD44, 胸苷酸合成酶, 克隆

Abstract:

BACKGROUND: Fluorouracil is a basic chemotherapy drug for gastric cancer, and its drug resistance is commonly seen in clinic. Cancer stem cells have low sensitivity to chemotherapy drugs, which may be an important cause of tumor recurrence and progression following chemotherpay.
OBJECTIVE: To explore the sensitivity of gastric cancer stem cells to 5-fluorouracil and related biology mechanism underlying multidrug resistance.
METHODS: Stem cell marker CD44 and multidrug resistance protein thymidylate synthase in 69 cases of gastric cancer tissues were tested by immunohistochemical staining. The selection strategy was based on the clonal morphology, and gastric cancer stem cells were isolated from human gastric cancer cell line AGS to detect the expression of CD44 and thymidylate synthase and the self renewing ability. Inhibitory concentration 50 (IC50) of 5-fluorouracil in different AGS cell clone was detected using cell counting kit-8.
RESULTS AND CONCLUSION: In 69 cases of gastric cancer tissues, the positive expression rates of thymidylate synthase and CD44 were 57% (39/69) and 61% (42/69), respectively, and there was a positive correlation between the expression of CD44 and thymidylate synthase (Kappa=0.41, χ²=11.59, P < 0.05). Cloning efficiency of the AGS cell line was 39% (29/69), wherein, vice cloning, secondary cloning, and full clone proportions were 17% (5/29), 69% (20/29), 14% (4/29), respectively. After sub-cloning, the clone was digested using trysin followed by low-density passage; vice clones were unable to passage, secondary clones could only
passage a few, and full clones could serially passage. After treatment with different concentrations of 5-fluorouracil, the full clone growth inhibition rate was significantly lower than that of secondary clones and AGS cells (P < 0.05). These findings show that gastric cancer stem cells are less sensitive to 5-fluorouracil, indicating the cells have a resistance to chemotherapy drugs, which may be one of the chemotherapy resistance mechanisms in the clinical treatment of gastric cancer.

Key words: Stomach Neoplasms, Fluorouracil, Colony-Forming Units Assay

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 1

2.1 胃癌组织胸苷酸合成酶、CD44表达关系分析 69例胃癌组织标本中，胸苷酸合成酶和CD44的表达阳性率分别为57%(39/69)和61%(42/69)，二者均阴性表达的有20%(14/69)，均阳性表达的有43%(30/69)。CD44与胸苷酸合成酶的表达之间呈正相关关系(Kappa=0.41，χ²= 11.59，P < 0.05)。经显微镜下连续切片观察，可发现二者均阳性的30例胃癌组织，胸苷酸合成酶和CD44共同定位于同一区域内的胃癌细胞中，见图1。
2.2 AGS细胞系不同克隆类别分析 AGS细胞系的克隆形成率为39%(29/69)，其中，副克隆、次克隆、全克隆所占比例分别为17%(5/29)、69%(20/29)、14%(4/29)。副克隆仅微弱表达胸苷酸合成酶，次克隆胸苷酸合成酶呈弱表达，而全克隆胸苷酸合成酶表达呈强阳性；副克隆CD44表达呈阴性，次克隆弱表达CD44，全克隆表达CD44最强。
2.3 不同AGS克隆自我更新能力分析第2次克隆形成实验，副克隆细胞低密度接种后未形成二代克隆，次克隆细胞接种后形成少量二代克隆，并主要形成副克隆，全克隆细胞接种后可再次形成大量二代克隆。二代克隆形成后，采用胰酶消化克隆并再次低密度接种传代，副克隆均无法传代，次克隆仅少数可连续传代，全克隆均可连续传代。
2.4 不同AGS克隆对5-氟尿嘧啶的敏感性分析经生长抑制率计算，不同浓度5-氟尿嘧啶作用之后，全克隆的生长抑制率均显著低于次克隆和AGS细胞，经比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，3个全克隆的半数抑制浓度分别为(113.43±5.81)，(272.68±25.75)和(118.14±17.75) μmol/L，次克隆的半数抑制浓度(IC50)为(16.97±1.01) μmol/L，而AGS细胞系的半数抑制浓度(IC50)为(27.52±0.59) μmol/L，具体结果见图2。

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引言

材料方法

设计：单一样本观察性实验。
时间及地点：于2014年11至12月在南京明基医院完成。
材料：69例胃癌组织均为南京明基医院2012至2013年存档的蜡块，早期胃癌12例，进展期胃癌57例。其中男40例，女29例，年龄21-85岁。经组织病理类型统计，均为腺癌。AGS人胃癌细胞系购自上海生博生物医药科技有限公司。
实验方法：
AGS细胞克隆和形态分类：利用DMEM培养基，添加体积分数为10%胎牛血清后对AGS细胞进行培养，培养条件为37 ℃、体积分数为5%CO2。取对数期细胞，用含0.25%胰酶+0.02%EDTA消化液进行消化后予以反复吹打，获得单细胞悬液，进行细胞计数，并按照计数结果，对AGS细胞进行低密度接种，置于10 cm培养皿中进行培养，每皿接种500个细胞，并在皿底置盖玻片，予以6-10 d静置培养，形成克隆之后进行形态分类，分为副克隆和次克隆以及全克隆3种类型。分类标准：①副克隆：形态扁平，且呈不规则状态，细胞体积大。②次克隆：边缘不规则，中央细胞呈较为致密的排列状态，且细胞体积小，但靠近周边的细胞体积增大，且呈逐渐松散的排列状态。③全克隆：细胞呈规则形态，边缘光滑，内含较小体积的AGS细胞，并呈十分紧密的排列状态

AGS人胃癌细胞系说明：
项目	具体情况
组织来源	人胃；人胃癌
细胞简介	人胃腺癌细胞，来源于人胃或胃癌，中文名为人胃腺癌细胞，正常的细胞形态为上皮样，贴壁生长
培养基	90%F-12K，体积分数为10%胎牛血清
培养条件	37 ℃、体积分数为5%CO₂
消化条件	0.25% Trypsin-0.53 mmol/L EDTA溶液，消化5-10 min
传代比例	1︰3-1︰8
换液时间	两三天换液1次
冻存液比例	85%培养基，10%胎牛血清，5%二甲基亚砜
冻存密度	(1-3)×10⁶/管，液氮保存

胃癌干细胞对氟尿嘧啶敏感性及化疗药物耐受细胞生物学机制分析研究所用试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
磷酸缓冲盐溶液	南京森贝伽生物科技有限公司
高真空硅脂	深圳市鼎峰泰科技有限公司
克隆环	美国Sigma公司
5-氟尿嘧啶	西安海欣制药有限公司
Cell Counting Kit-8(CCK8试剂盒)、 Supervision二抗	武汉博士德生物工程有限公司
鼠抗人单克隆抗体	北京科昕生物科技有限公司

分离单个克隆，检测自我更新能力：按照形态分类结果，选择需要进行分离的目标克隆。分离前于相差显微镜下对克隆所含细胞数予以统计，并对目标克隆在培养皿外底部予以标记。将培养皿内培养基吸除，并利用PBS进行2次漂洗。将克隆环蘸取高真空硅脂，按照标记位置，套在目标克隆位置。向克隆环内滴加100 μL消化液，待反应 3-5 min后予以反复轻柔吹打，以促进目标克隆的分离，获得单细胞悬液。从上述单细胞悬液中按照目标克隆细胞数吸取一定体积的悬液，并将其接种在6孔板内，每孔50个细胞。接种完毕再次予以克隆形成实验，对不同克隆细胞的自我更新能力进行检测。
检测不同类型克隆的5-氟尿嘧啶半数抑制浓度(IC50)：对分离目标克隆予以培养扩增，8-10 d后接种于96孔板上，每孔5 000个细胞。接种完毕培养12 h，然后分别加入浓度为2.5，5.0，10，20，40，80，160 μmol/L 的5-氟尿嘧啶，每个浓度均设置3个复孔，作用72 h之后，将各孔内培养基吸除。向每孔中加入100 μL稀释后的CCK8试剂，于 37 ℃条件下进行2 h孵育。对470 nm处各孔的吸光度进行检测，并进行3次重复检测，计算不同浓度下的生长抑制率，计算方法为：生长抑制率=(A_对照组-A_实验组/A_对照组-A_空白组)× 100%；并利用Bliss法对不同克隆的5-氟尿嘧啶半数抑制浓度(IC50)进行计算。以不加药的细胞为对照组，无细胞培养为空白组。
免疫组化染色：胸苷酸合成酶抗体定位于胞质和胞核，稀释度1︰50，CD44抗体定位于胞膜和胞质，稀释度分别为1︰100，均为鼠抗人单克隆抗体。进行Envision二步染色，常规脱蜡、水化后进行修复，滴加一抗孵育过夜，经PBS浸洗后滴加Supervision二抗孵育，DAB显色。病例阳性判定标准为：组织内所有癌细胞中，阳性细胞所占比例达到10%以上。仍采用Envision二步法对不同克隆胸苷酸合成酶和CD44的表达进行检测，对长有克隆的盖玻片进行固定，PBS漂洗后滴加一抗孵育过夜，PBS浸洗后滴加Supervision二抗，孵育后DAB显色。
主要观察指标：①胃癌组织胸苷酸合成酶与CD44表达的相关性。②AGS细胞系克隆类别及CD44和胸苷酸合成酶的表达情况。③不同AGS克隆的自我更新能力。④不同AGS克隆对5-氟尿嘧啶的敏感性。
统计学分析：对研究所得数据利用SPSS 18.0软件进行处理，其中相关性检验行χ2检验，多样本均数比较予以单因素方差分析，一致性检验采用Kappa统计。检测P 值，如果经检测P < 0.05，则提示经比较两组数据间差异有显著性意义。

讨论

据全国肿瘤防治办2014年公布的《中国肿瘤统计年报》显示，中国每年新发癌症病例为350万，因癌症死亡的人数有250万之多。氟尿嘧啶是一种常用抗肿瘤药物，多用于各种肿瘤患者手术后的辅助化疗等，是胃癌化疗的基础药物^[7]。肿瘤干细胞学说认为，肿瘤产生的根本原因是肿瘤干细胞的产生，只有消灭了肿瘤干细胞才能真正治愈肿瘤^[8-13]。但现实情况却是：传统的手术、放化疗并不能完全消灭肿瘤干细胞。在肿瘤放疗和化疗中，普通的肿瘤细胞对治疗是敏感的，容易被消灭，但肿瘤干细胞却具有很强耐受力，不容易被摧毁^[14-17]。目前肿瘤化疗药物主要是针对处于分裂周期的细胞，而肿瘤干细胞多处于静息期休眠状态，对化疗药物的敏感性差^[18-20]，这就是肿瘤化疗后缩小，而停药后仍可能原位复发的原因。
耐药蛋白胸苷酸合成酶的表达反映肿瘤对5-氟尿嘧啶的耐药性，胸苷酸合成酶蛋白的表达越强，则提示肿瘤对5-氟尿嘧啶的耐受程度越高^[21-27]。本次研究结果显示，CD44与耐药蛋白胸苷酸合成酶的表达之间呈正相关关系，且经显微镜下连续切片观察，可发现二者均阳性的胃癌组织，可见胸苷酸合成酶和CD44共同定位于同一区域内的胃癌细胞中。结果表明，胃癌干细胞可能对5-氟尿嘧啶的敏感性较低，这一结果也为胃癌化疗临床耐受提供了一定的参考。胃癌干细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性和相关化疗耐受情况予以进一步分析的过程中，需要对胃癌干细胞进行体外实验和检测^[28]。但是，受到胃癌干细胞特异的表面标志物较少以及常规对胃癌干细胞进行分选操作复杂、耗时且易污染等因素的影响，在胃癌干细胞的具体获得方法方面，目前仍然存在一定的难度^[29]。为此，本次研究过程中，采用了基于克隆形态的分选方式。研究过程中，通过对胃癌肿瘤细胞的克隆和全克隆的分离，对肿瘤干细胞予以有效的富集^[30]。研究结果还显示，副克隆仅微弱表达胸苷酸合成酶，次克隆胸苷酸合成酶呈弱表达，而全克隆胸苷酸合成酶表达呈强阳性；副克隆CD44表达呈阴性，次克隆弱表达CD44，全克隆表达CD44最强。结果表明少数AGS细胞可形成特征性的全克隆，且CD44表达较强，具备较强的自我更新能力，可形成长期传代的细胞系。经进一步检测不同类型克隆的5-氟尿嘧啶半数抑制浓度(IC50)发现，全克隆的生长抑制率均显著低于次克隆和AGS细胞。这一结果也提示，胃癌干细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性更低。另外，本次研究还发现，AGS细胞系的克隆形成率为39% (29/69)，其中，副克隆、次克隆、全克隆所占比例分别为17%(5/29)、69%(20/29)、14%(4/29)。由上述数据进行计算，可得出形成AGS细胞系内的胃癌干细胞的比率，即39.13%× 13.79%=5.40%，与肿瘤干细胞学说相符，表明在肿瘤细胞中，肿瘤干细胞只占极小部分^[31-32]。但是，胃癌干细胞的5-氟尿嘧啶敏感性较低，其对化疗药物的耐受，可以为临床胃癌化疗等提供一定的参考。因此，可以从细胞生物学角度为胃癌的化疗耐药机制研究提供了新的实验证据。
综上所述，肿瘤干细胞是一类具有无限自我更新潜能，并能形成与原发灶相似的异质性肿瘤细胞。它在肿瘤中只占极少的部分，却是肿瘤复发和转移的根源。而胃癌干细胞的5-氟尿嘧啶敏感性较低，其对化疗药物的耐受，可以为临床胃癌化疗治疗等提供一定的参考。