静脉及心肌注射骨髓间充质基质细胞未能改善慢性心肌梗死大鼠的心脏功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.010

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (10): 1528-1532.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.010

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静脉及心肌注射骨髓间充质基质细胞未能改善慢性心肌梗死大鼠的心脏功能

王炜¹，柳德斌¹，冯英²，张浩³，王石雄¹，高秉仁¹，张菁²，王玮璠¹

¹兰州大学第二医院心脏外一科，甘肃省兰州市 730030；²兰州大学第二医院CICU，甘肃省兰州市 730030；³中国医学科学院阜外心血管病医院，卫生部心血管疾病再生医学重点实验室，北京市 100037

出版日期:2015-03-05 发布日期:2015-03-05
通讯作者: 王炜，博士，主治医师，兰州大学第二医院心脏外一科，甘肃省兰州市 730030
作者简介:王炜，男，1981年生，河北省沙河县人，汉族，2010年兰州大学毕业，博士，主治医师，主要从事心外科基础与临床研究。
基金资助:
中央高校基本科研业务费专项资金自由探索-小额探索项目(lzujbky-2013-217)

Intravenous and intramyocardial administration of bone marrow mesenchymal stromal cells cannot improve heart function in a rat model of chronic myocardial infarction

Wang Wei¹, Liu De-bin¹, Feng Ying², Zhang Hao³, Wang Shi-xiong¹, Gao Bing-ren¹, Zhang Jing²,Wang Wei-fan¹

¹First Department of Cardiac Surgery, Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China; ²Department of CICU, Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China; ³Department of Surgery and Research Center for Cardiac Regenerative Medicine, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100037, China

Online:2015-03-05 Published:2015-03-05
Contact: Wang Wei, First Department of Cardiac Surgery, Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China
About author:Wang Wei, M.D., Attending physician, First Department of Cardiac Surgery, Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China
Supported by:
the Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. lzujbky-2013-217

摘要/Abstract

摘要：

背景：有多项研究证明，经静脉或经心肌表面注射移植间充质基质细胞促进了急性心肌梗死后心功能的改善。然而，目前尚缺乏有关经静脉联合经心肌注射移植间充质基质细胞对慢性心肌梗死心脏功能影响的研究。

目的：探讨静脉联合心肌注射骨髓间充质基质细胞对慢性心肌梗死模型大鼠心脏功能的影响及其机制。

方法：体外培养扩增Lewis大鼠的骨髓间充质基质细胞。将3×10⁶ BrdU标记过的骨髓间充质基质细胞分别经股静脉和经心肌表面注射移植于慢性心肌梗死模型大鼠，对照组注射等量PBS。4周后检测两组大鼠心功能的变化，并对大鼠心脏组织行免疫组化染色，观察细胞分化情况及毛细血管数量。

结果与结论：骨髓间充质基质细胞移植4周后，细胞移植组与对照组心功能无明显差别，免疫组化染色提示存留于心肌组织内的移植细胞未分化为心肌细胞，心梗瘢痕区血管密度在细胞移植组和对照组间没有明显差别。结果表明经静脉联合经心肌注射骨髓间充质基质细胞未能改善慢性心肌梗死模型大鼠的心脏功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质基质细胞, 大鼠, 慢性心肌梗死, 心脏功能

Abstract:

BACKGROUND: It has been demonstrated to be effective for the improvement of heart function after acute myocardial infarction with intravenous or intramyocardial administration of bone marrow mesenchymal stromal cells. However, little is known regarding the effect of the combination of intravenous and intramyocardial administration of mesenchymal stromal cells on the heart function of a chronic myocardial infarction model.

OBJECTIVE: To study the effect of intravenous and intramyocardial administration of bone marrow mesenchymal stromal cells on the heart function of a rat chronic myocardial infarction model and the relevant mechanism.

METHODS: Bone marrow mesenchymal stromal cells isolated from Lewis rats were expanded ex vivo. BrdU-labeled bone marrow mesenchymal stromal cells (3×10⁶) were administered via the femoral vein and the myocardial surface respectively into rat models of chronic myocardial infarction in cell transplantation group. The equal volume of PBS was injected into the same place in control group. Four weeks after injection, echocardiography was performed to evaluate the heart function, and then the heart tissues were harvested for immunohistochemistry examination. The total blood vessel density in the scar area was evaluated.

RESULTS AND CONCLUSION: At 4 weeks after cell implantation, the left ventricular function was not improved in the two groups. The immunohistochemistry staining showed that (1) the mesenchymal stromal cells in the myocardium did not differentiate to myocardial cells; (2) there was no significant difference in the total blood vessel density in the scar area between the cell transplantation and control groups. Taken together, the combined intravenous and intramyocardial administration of bone marrow mesenchymal stromal cells cannot improve heart function in a rat chronic myocardial infarction model.

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Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Myocardial Infarction, Heart Function Tests

中图分类号:

R394.2

王炜，柳德斌，冯英，张浩，王石雄，高秉仁，张菁，王玮璠. 静脉及心肌注射骨髓间充质基质细胞未能改善慢性心肌梗死大鼠的心脏功能[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(10): 1528-1532.

Wang Wei, Liu De-bin, Feng Ying, Zhang Hao, Wang Shi-xiong, Gao Bing-ren, Zhang Jing,Wang Wei-fan. Intravenous and intramyocardial administration of bone marrow mesenchymal stromal cells cannot improve heart function in a rat model of chronic myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(10): 1528-1532.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

心肌属于最终分化细胞，一旦损伤则很难再生，而只能由瘢痕组织代替。心肌梗死后存活心肌细胞数量的大量下降而导致的心功能不全已成为心力衰竭的主要原因之一。细胞移植疗法主要是向心肌梗死区提供和补充富有活性的细胞，从而达到促进血管新生、推动心肌再生的目的。在最近10年，细胞移植研究逐步从实验走向临床，成为国内外心血管疾病领域研究的热点之一。虽然细胞移植已经进入临床研究阶段，但仍有诸多问题在困扰着这项技术的进一步发展，其中包括细胞源选择、移植途径优化、细胞分化受到质疑等等。

骨髓来源的细胞可以自体采集，具有一定的分化潜能和局部旁分泌作用，经过体外扩增的间充质基质细胞已经成为目前细胞移植的主流细胞源之一^[1]，同时也具有最多的实验室和临床证据。

经静脉移植是目前最具吸引力的移植途径之一，这种移植方法创伤最小。最新的临床研究亦表明，经静脉移植间充质基质细胞后可促进急性心肌梗死患者心功能的改善^[2]，实验研究表明经静脉移植骨髓间充质基质细胞于急性心肌梗死模型中可改善受损的心脏功能，而且移植的细胞可存活于梗死心肌组织中并分化为心肌样细胞^[3]。经静脉移植细胞还具有可反复操作的优点，但该方式也存在移植靶向性差的缺点。

经心外膜心肌注射移植细胞是一种具备很多优点的移植方式，该方式可以允许一次移植大量细胞于心肌靶区域，即使像间充质基质细胞这样体积较大的细胞经该方式大量移植也不必担心造成冠脉梗阻。外科医师直视下进行该操作还可保证移植区域的精确性，并可以避免损伤冠状动脉^[4]。已有实验研究表明经心外膜心肌移植骨髓间充质基质细胞于急性及慢性心肌梗死模型中可改善受损的心脏功能^[5-6]，而且移植的细胞可存活于梗死心肌组织中并分化为心肌样细胞及血管内皮细胞^[7-8]。但该移植方式创伤大，技术要求高，不可反复进行。

经静脉联合经心肌注射(两种途径联合)为主要移植途径移植骨髓间充质基质细胞治疗心肌梗死可以最大限度的综合发挥上述两种移植方式的优点，而且存在独特的临床应用优势：开胸手术同时采集骨髓血培养纯化骨髓间充质基质细胞作为后期经静脉移植的细胞源，避免了多次有创操作获取移植细胞的缺点，最大限度的减少患者痛苦，提高治疗效率。

目前的研究多关注细胞移植对急性心肌梗死的治疗作用，对慢性心肌梗死则相对缺乏足够丰富的研究。以往的研究中曾显示经静脉注射对慢性心肌梗死模型的左心功能无明显改善^[9]，经心肌注射移植细胞后患者左室射血分数较单纯搭桥手术未有明显差别^[10]。目前国内外尚无静脉联合心肌注射为主要途径移植骨髓间充质基质细胞对慢性心肌梗死心功能影响的研究报道。因此，本研究将以骨髓来源间充质基质细胞为细胞源，以经静脉联合经心肌注射为主要移植途径，对移植细胞心内滞留量、心功能改善情况以及移植细胞促进再血管化程度进行深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年6月至2014年3月在兰州大学医学院动物实验室及兰州大学第二医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：SPF级8周龄雌性Lewis大鼠60只，体质量200-250 g；4周龄雄性Lewis大鼠8只，体质量60 g，均来源于兰州大学第二医院SPF动物饲养中心，实验获得兰州大学第二医院实验动物委员会批准。

实验方法：

细胞培养及标记：依文献报道的常规方法采集、培养及标记间充质基质细胞^[11]。选取4周龄体质量60 g的雄性Lewis大鼠提取培养间充质基质细胞。无菌条件下，用适量DMEM培养液冲出大鼠股骨及胫骨骨髓，加入体积分数为10%胎牛血清，以适当密度置于37 ℃，体积分数为5% CO₂饱和湿度的孵箱内培养24 h更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每隔48 h换液1次。细胞长到80%融合时用0.25%胰酶消化传代，以2×10⁶/瓶的密度接种于传代培养瓶中进行扩增培养。通过及时、反复传代对细胞进行纯化。第3代细胞加入50 μL含有0.4%的5-溴脱氧尿苷(BrdU)孵育48 h标记移植细胞备用。

大鼠心肌梗死模型建立：应用常规心肌梗死大鼠模型制作方法^[11]，将Lewis大鼠按3 mg/g剂量腹腔内注射水合氯醛，待麻醉满意后经口气管插管，小动物呼吸机辅助呼吸，于左侧乳头下切口进胸，显露心脏，用prolene线在肺动脉主干和左心耳交界下方沿冠状动脉的左前降支走向在近端结扎，结扎有效后可见到结扎远端左室前壁心肌变为苍白且收缩幅度降低。

以心肌梗死后3周和细胞移植后4周为时间节点，二维心脏超声(Philips SONOS 5500)评价大鼠心功能情况，记录左室舒张末容积(LVEDV)，左室收缩末容积(LVESV)，计算左室射血分数(LVEF)和左室缩短分数(LVFS)。心肌梗死模型录用标准为左室射血分数< 60%，左室缩短分数< 30%，并以上述超声测量指标比较细胞移植后4周心功能的改善情况^[9]。

间充质基质细胞移植：经BrdU标记的第3代间充质基质细胞消化收集备用，以倒置相差显微镜行细胞计数。将模型大鼠以前述方法麻醉后，细胞移植组开胸后于心肌梗死边缘区移植3×10⁶个间充质基质细胞，分离暴露股静脉，以胰岛素注射针抽取含有3×10⁶个间充质基质细胞的PBS悬混液50 μL，将其缓慢注入股静脉；对照组开胸后于心梗边缘区移植同等体积的PBS，同期股静脉注射同体积的PBS。移植4周后，细胞移植组和对照组分别存活16只和15只大鼠。

心肌梗死区血管密度测定：移植4周后，细胞移植组和对照组随机选取3只大鼠，分别检测心肌梗死瘢痕区vWF染色阳性的血管数量。每个心肌梗死标本随机连续选取8张切片，每张切片随机选取5个梗死区视野计数染色阳性的血管数量。先于放大100倍视野下确认梗死区，再于放大400倍视野下计数毛细血管数量，毛细血管密度以血管数目/400倍视野来表示^[12]。

移植细胞在心肌组织中的分化情况：心脏标本的石蜡切片行免疫组化染色，以α-肌动蛋白和结蛋白免疫组化染色显示心肌细胞(鼠单克隆抗体，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz，CA，USA)，vWF免疫组化染色显示血管内皮细胞(鼠单克隆抗体，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)。应用免疫双染试剂盒(Zymed，San Francisco，CA，USA)鉴别既表达BrdU同时上述抗体呈阳性的细胞。石蜡组织切片脱蜡入水后入柠檬酸钠抗原修复液中，加大鼠BrdU单克隆抗体(稀释度1︰200)4 ℃过夜孵育，PBS冲洗，按照说明书加DAB显色液，室温显色5 min，随后切片再次入柠檬酸钠抗原修复液中修复抗原，接着分别加大鼠α-肌动蛋白、结蛋白、vWF一抗(稀释度1︰500)4 ℃过夜孵育，PBS冲洗，按照说明书加AEC显色液，显色10 min，缓冲甘油封固。

主要观察指标：①细胞移植后4周进行超声心动图检测大鼠心脏左室功能。②移植细胞在心肌组织中的分化情况。③细胞移植后4周心肌梗死区血管密度。

统计学分析：所有数据用x(_)±s表示，组内比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，均数间的两两比较采用Bonferroni检验，两组间参数比较应用Student’s t 检验。应用SPSS 13.0软件包进行统计学分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

细胞移植已经成为最具吸引力的心肌再生治疗手段。经心肌注射间充质基质细胞已被证明是安全而且最为精确有效的细胞移植途径。然而，经心肌注射必须在开胸手术或是经皮冠状动脉介入治疗术中完成。局部注射这种移植方式增加了诸如出血和组织损伤的风险和不良反应。直接动脉内注射移植细胞又可能导致梗死或栓塞^[13-14]。静脉注射间充质基质细胞提供了另外一种非侵袭性的细胞移植途径，特别对是那些无法耐受侵袭性手术的患者而言。该方法是一种简单的，已被接受的移植方法，而且移植细胞可以分布至整个受损伤的心脏。

尽管采取了经心肌直接注射和经静脉注射两种方式相联合的手段，但大多数移植细胞并未如预期的向受损伤的心肌迁移并停留于损伤心肌，而且存留于心脏组织的移植细胞也主要分布于非梗死心肌组织。作者分析造成以上结果的原因可能是因为慢性梗死心肌已失去血供来源形成纤维瘢痕，经静脉移植细胞无法经血液循环到达该区域，经心肌注射的移植细胞也因无代谢所需能量支持而逐渐死亡。结果未发现移植细胞刺激毛细血管再生或心肌再生。因此，干细胞研究应越来越重视通过基因修饰等其他途径增加移植细胞向靶区域迁移、存活、扩增及促进其向靶细胞分化的研究^[15-17]。

有文献报道，培养到第3代至第8代的细胞适宜用于细胞移植治疗，原因是第3代之前的早期细胞不具备足够的均质性，而第8代以后的培养细胞又可能改变其表型和/或基因型^[18]。尽管经过培养扩增的间充质细胞越来越多的于实际临床治疗中应用，但本研究的阴性结果提示应该考虑选取一种更具分化潜能的细胞用作慢性心肌梗死的移植细胞源。研究表明移植细胞可能通过旁分泌机制改善细胞周围生长环境，促进组织修复。但本实验未深入研究移植细胞的旁分泌机制，因此，改善细胞旁分泌作用及移植微环境可能成为今后细胞移植治疗的方向之一。

理想的用于慢性心肌梗死治疗的细胞源应具备以下特点：没有伦理学的问题，无致癌性，可以体外培养扩增，可以分化为目标细胞。而且，为了便于细胞输送，移植细胞体积不能过大，以便通过肺屏障。但遗憾的是，到目前为止，没有发现哪一种细胞完全达到上述所有标准。

诱导多能干细胞就是一种被普遍看好的颇具前景的细胞源，但目前距离其投入临床实践仍有很长的路要走^[19-21]。由于肺脏截留了很大部分的移植细胞，导致最终到达心肌并存留下来的细胞非常有限，难以满足治疗的需要。因此，未来的研究应致力于设法使更多的移植细胞通过肺屏障并归巢于梗死心肌区域。

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