持续Wnt信号通路激活促进胚胎干细胞源造血干细胞的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.010

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (6): 880-887.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.010

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持续Wnt信号通路激活促进胚胎干细胞源造血干细胞的增殖

林芳^1，2，金静君²，张韬²，纪斌峰¹，陈泳^2，3

¹福州大学生物科学与工程学院，福建省福州市 350108；²福建省医学科学研究院、福建省医学测试重点实验室，福建省福州市 350001；³福建师范大学生命科学学院，福建省福州市 350108

修回日期:2013-12-10 出版日期:2014-02-05 发布日期:2014-02-05
通讯作者: 金静君，研究员，硕士生导师，福建省医学科学研究院，福建省福州市 350001
作者简介:林芳，女，1987年生，福建省莆田市人，汉族，2011年福州大学毕业，主要从事胚胎干细胞诱导分化研究。
基金资助:
福建省自然科学基金(2012J01325)；福建省医学创新课题(2012-cx-13)；福建省省属公益类科研院所基本科研专项(2010R1034-1)

Proliferation of hematopoietic stem cells differentiated from embryonic stem cells via sustained Wnt pathway activation

Lin Fang^{1, 2}, Jin Jing-jun², Zhang Tao², Ji Bin-feng¹, Chen Yong^{2, 3}

¹School of Bioscience and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, Fujian Province, China; ²Fujian Academy of Medical Sciences, Fuzhou 350001, Fujian Province, China; ³School of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, Fujian Province, China

Revised:2013-12-10 Online:2014-02-05 Published:2014-02-05
Contact: Jin Jing-jun, Investigator, Master’s supervisor, Fujian Academy of Medical Sciences, Fuzhou 350001, Fujian Province, China
About author:Lin Fang, School of Bioscience and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, Fujian Province, China; Fujian Academy of Medical Sciences, Fuzhou 350001, Fujian Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Fujian Province, No. 2012J01325; the Medical Innovative Subject of Fujian Province, No. 2012-cx-13; Fundamental Scientific Research Activities at Non-Profit Research Institutions of Fujian Province, No. 2010R1034-1

摘要/Abstract

摘要：

背景：如何提高胚胎干细胞诱导效率、促进胚胎干细胞源造血干细胞体外增殖成为目前急需解决的课题。

目的：以外源性Wnt3a作为诱导剂，激活培养中的小鼠胚胎干细胞Wnt/β-catenin信号通路，观察该通路的激活是否促进胚胎干细胞向造血祖细胞的定向分化。

方法：用外源性wnt3a(100 µg/L)持续作用ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞21 d，通过细胞免疫荧光及蛋白免疫印迹检测细胞内β-catenin蛋白含量，QRT-PCR检测Wnt下游靶标基因的表达量来确定经典Wnt/β-catenin信号通路是否被激活，然后采用单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化，流式细胞仪检测造血发育相关表面标志CD34⁺/Sca-1⁺，同时以QRT-PCR法检测造血相关基因的表达情况。

结果与结论：ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞经wnt3a(100 µg/L)连续培养21 d后发现β-catenin蛋白在细胞内积累；Wnt信号通路的下游靶标基因Pitx2、Frizzled、Sox17、Oct4的表达量均出现不同程度的增加，可见经典Wnt/β-catenin信号通路有被激活；单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化的过程中检测到CD34⁺/Sca-1⁺细胞含量在14 d时占总细胞量高达20.2%，而对照组的仅占11.9%。造血相关基因骨形态发生蛋白4、FLK2及CD34的表达量均增加，而Smad5的表达则明显受到抑制。说明Wnt3a持续作用可激活Wnt/β-catenin信号通路，并促进ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的定向分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 胚胎干细胞, 造血干细胞, Wnt3a, Wnt/β-catenin信号通路, 福建省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND:A variety of embryonic stem cells induction and differentiation systems have been established so far, while the research that promotes embryonic stem cells to differentiate into hematopoietic stem cells is still at an initial stage, and the induction efficiency needs to be improved.

OBJECTIVE: To active the Wnt/β-catenin signal pathway in mouse embryonic stem cells with exogenous win3a as an inducer, and then to observe whether the activation of this pathway will promote the directional differentiation of embryonic stem cells into hematopoietic progenitor cells.

METHODS:The ES-E14TG2a mouse stem cells were cultured with the exogenous wnt3a (100 µg/L) for 21 days, the content of β-catenin was tested by cell immunofluorescence and western blot, and expression of Wnt downstream target gene was detected by quantitative reverse transcription PCR to determine the activation of Wnt/β-catenin signal pathway. Single-layer adherent culture method was used to induce the directional differentiate of above-mentioned cells into hematopoietic stem cells, and detection of hematopoietic development associated surface marker CD34⁺/Sca-1⁺ was achieved by flow cytometry;

meanwhile, the expression of hematopoietic associated gene was measured by quantitative reverse transcription PCR.

RESULTS AND CONCLUSION: We found that β-catenin accumulated in ES-E14TG2a mouse stem cells after cultured with wnt3a (100 µg/L) for 21 days; the expressions of Wnt downstream target genes such as Pitx2, Frizzled, Sox17 and Oct4 showed the different degrees in increase, meaning the activation of Wnt/β-catenin signal pathway. Furthermore, during the time that we used single-layer adherent culture method to induce hematopoietic stem cells, the CD34⁺/Sca-1⁺ cells accounted for 20.2% of total cells at day 14, and control cells only accounted for 11.9%. Again, expression quantity of hematopoietic associated gene BMP4, FLK2 and CD34 increased while Smad5 was suppressed significantly. Our data suggest that sustaining action by wnt3a will active Wnt/β-catenin signal pathway, and also promote the directional differentiation of ES-E14TG2a mouse stem cells into hematopoietic progenitor cells.

全文链接：

Key words: stem cells, embryonic stem cells, hematopoietic stem cells, cell differentiation, cell proliferation

中图分类号:

R394.2

林芳，金静君，张韬，纪斌峰，陈泳. 持续Wnt信号通路激活促进胚胎干细胞源造血干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(6): 880-887.

Lin Fang, Jin Jing-jun, Zhang Tao, Ji Bin-feng, Chen Yong. Proliferation of hematopoietic stem cells differentiated from embryonic stem cells via sustained Wnt pathway activation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(6): 880-887.

图/表（结果） 5

2.1 显微镜下观察生长在小鼠胚胎成纤维细胞上的ES-E14TG2a细胞的形态 复苏的ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞上培养3 d时，可以看出该ES-E14TG2a细胞呈鸟巢状，细胞排列紧密，克隆边缘清楚，基本保持未分化的状态(图1A)。

2.2 AP染色 阴性对照为经丝裂霉素处理的P3代的小鼠胚胎成纤维细胞染色结果为无色即阴性结果表明该细胞已分化(图1B)，实验组为P5代的ES-E14TG2a胚胎干细胞经碱性磷酸酶染色后细胞呈蓝紫色，阳性结果说明该细胞保持未分化的状态(图1C)。

2.3 ES-E14TG2a细胞的细胞周期 ES-E14TG2a细胞处于细胞周期S期的占38.6%，处于S期和G₂期的占58.7%，S期和G₂期均是DNA合成期，且S早期合成的DNA是调节细胞增殖和表达的DNA，其所占比例较大说明该细胞处于增殖活跃状态(图1D)。

2.4 显微镜下观察ES-E14TG2a细胞经Wnt3a诱导后细胞集落的变化 将P5代的ES-E14TG2a细胞从小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上分离后接种于经0.1%明胶包被的60mm培养皿上细胞形态不再呈鸟巢状，而是单层贴壁生长(图2A)。加入Wnt3a(100 µg/L)培养24 h后细胞又出现成团生长，连续培养21 d中细胞均为成团生长(图2B)。

2.5 β-catenin蛋白免疫荧光 对照组中的荧光强度较弱(图3A，B)，而ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞经Wnt3a连续培养21 d后β-catenin蛋白的细胞荧光明显较强(图3C，D)，说明ES-E14TG2a细胞经Wnt3a连续培养21 d后细胞内β-catenin蛋白没有被降解而是在胞内大量积累。

2.6 蛋白免疫印迹(Western Blot) B条带比A条带明显较粗说明ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞经Wnt3a连续培养 21 d后细胞内β-catenin蛋白水平增加(图2C)。

2.7 Wnt/β-Catenin信号通路下游靶标基因的表达 Pitx2、Frizzled、Sox17、Oct4是Wnt信号下游靶标基因，从ES-E14TG2a细胞经Wnt3a培养7 d后Wnt信号下游靶标基因的表达量均有所上升，且继续培养到14，21 d，Pitx2、Frizzled、Sox17的表达量持续增加，而连续培养21 d后Oct4基因的表达量有所下降(图4)。

2.8 造血干细胞表面标记物检测 CD34和Sca-1是造血干细胞的两个重要表面标志^[13-14]，利用流式细胞仪检测发现直接将ES-E14TG2a细胞用拟胚体法诱导其向造血干细胞分化在3，5，7，10，14 d其双阳性的比率分别为1.2%，5.8%，6.2%，8.5%，11.9%；而先用Wnt3a连续培养21 d后的ES-E14TG2a细胞再通过单层贴壁培养法诱导其造血分化在3，5，7，10，14 d的双阳性比率为3.8%，6.8%，11.3%，15.9%，20.2%。可见经Wnt3a连续培养21 d后的胚胎干细胞的造血分化效果较好，Wnt3a可以促进胚胎干细胞向造血干细胞分化(图5)。2.9 与造血相关的基因的表达 胚胎干细胞经Wnt3a连续培养21 d后，再进行单层贴壁培养诱导其造血分化过程中BMP4、FLK2及CD34基因的表达量均较未经Wnt3a处理的高，而Smad5基因受抑制更明显，可见实验组的细胞向中胚胎层发育和造血分化均较对照组强(图6)。

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引言

材料方法

设计：细胞形态学观察。

时间及地点：于2013年4月在福建省医学科学研究院免疫室完成。

材料：

实验动物：健康清洁级C57BL/6鼠用于胚胎成纤维细胞的制备，其中雌鼠12只，雄鼠6只，体质量20-25 g，以雌雄比例为2∶1进行交配，购买自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)：2007-0005。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

细胞株：小鼠ES-E14TG2a由中国科学院干细胞库提供，建株自129/Ola雄性小鼠。

方法：

小鼠胚胎成纤维细胞的制备：具体操作过程见参考文献[12]。

胚胎干细胞培养：先将小鼠胚胎成纤维细胞以1×10⁵/孔的密度接种于经0.1%明胶包被的T25培养瓶中，隔天复苏P3代ES-E14TG2a细胞，用干细胞完全培养液重悬为1×10⁹ L^-¹的浓度，接种于小鼠胚胎成纤维细胞滋养层细胞上，置于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养。ES-E14TG2a细胞完全培养液成分为：DMEM高糖培养基、体积分数15%FBS、1 mmol/L NEAA、1 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L 2-巯基乙醇、1 000 U/mL的白血病抑制因子。细胞每天换液，每隔两三天以0.25%胰酶消化传代，待细胞生长稳定且状况良好时用于实验。

生物学特性鉴定：

碱性磷酸酶(AP)染色：ES-E14TG2a细胞接种于铺有小鼠胚胎成纤维细胞细胞的六孔板中，待细胞密度为80%左右，吸出细胞培养液，用PBS润洗两三次，用固定液PFA固定1.0-2.0 min；吸出固定液用PBS洗2次；吸出PBS再用TBST润洗2次；准备碱性磷酸酶溶液：溶液A∶溶液B∶溶液C=50 µL∶12.5 µL∶437.5 µL；吸弃TBST溶液；加入足量的染色试剂使染色液能够覆盖孔底，室温避光放置15-20 min；吸出染色液用PBS润洗1次，最后存于PBS中，显微镜下观察染色结果。

细胞周期检测：收集ES-E14TG2a细胞；用PBS洗涤细胞1次(离心2 000 r/min，5 min)收集并调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，取1 mL单细胞悬液；制备的单细胞悬液离心后，去除上清，在细胞中加入体积分数为70%冷乙醇500 µL固定(2 h至过夜)，4 ℃保存，染色前用PBS洗去固定液；加入100 µL RNase A 37 ℃水浴30 min；再加入400 µL PI染色混匀，4 ℃避光30 min；上机检测，记录激发波长488 nm出红色荧光。

Wnt信号通路的激活：ES-E14TG2a细胞在经0.1%明胶包被的60 mm培养皿上密度达到70%-80%，加入含有wnt3a(100 µg/L)的干细胞完全培养液连续培养21 d，隔天换液，每两三天传代。

细胞免疫荧光：将Wnt3a连续培养21 d与空白培养21 d的ES-E14TG2a细胞做细胞爬片，用40 g/L的甲醛固定20-30 min，PBS洗1次；0.5%Triton X-100 in PBS 室温 5 min，PBS洗1次；1% BSA室温孵育30 min，PBS洗2次；1∶250稀释的Anti-beta catenin antibody 37 ℃孵育1 h，PBS冲洗3次；1∶100稀释的Anti-Ribbit IgG(whole molecule)-FITC 37 ℃避光孵育30 min，PBS冲洗2次；DAPI避光染色作用3-5 min，PBS洗2次；用抗淬灭的封片剂封固；荧光显微镜下观察。

蛋白免疫印迹：收集Wnt3a连续培养21 d与空白培养21 d的ES-E14TG2a细胞；用RIPA强裂解液提取细胞总蛋白；10%SDS-PAGE进行蛋白电泳；SDS-PAGE电泳后，将胶转移到PVDF膜上；采用湿转把蛋白转到PVDF膜上；把载有蛋白的PVDF膜迅速的投入装有封闭缓冲液(含5%BSA)中，4 ℃过夜；用含5%BSA缓冲液1∶1 000稀释Anti-beta catenin antibody，将膜置于一抗溶液中，并4 ℃过夜；去掉一抗溶液，用TBS-T缓冲液洗膜3次，每次10 min；用5% BSA缓冲液1∶5 000稀释Goat Anti-Ribbit-HRP，然后将膜置于二抗中，37 ℃摇床孵育1 h；去掉二抗溶液，用TBS-T缓冲液洗膜5次，每次10 min；曝光、显影、定影。

Real-time PCR检测Wnt信号下游靶标基因表达情况：Wnt信号通路激活过程中分别收集0，7，14，21 d的细胞做Real-time PCR，检测Wnt下游靶标基因的表达情况。细胞总RNA的提取及反转录分别按Invitrogen公司和TAKARA公司提供的试剂盒说明书操作，相对定量按Thermo公司试剂盒说明书操作，使用的仪器为ABI7500荧光定量PCR扩增仪，使用primer5.0设计引物如下：

SOX17：5’-GAT GCG GGA TAC GCC AGT G-3’ (sense)，5’-CCA CCA CCT CGC CTT TCA C-3’' (antisense)；

Pitx2：5’-ACC CCG GCT ATT CGT ACA AC-3’ (sense)，5’-GGA CAG GGG ATT GAC GTT CAT-3’ antisense)；

Frizzled7：5’-TCT GTC CCT CAC TTG GTT CC-3’ (sense)，5’-AAG TAG CAG GCC AAC ACG AT-3’ (antisense)；

OCT4：5’-CGG AAG AGA AAG CGA ACT AGC (sense)，5’-ATT GGC GAT GTG AGT GAT CTG-3’ (antisense)

小鼠胚胎干细胞向造血干细胞诱导分化：Wnt3a连续培养21 d与空白培养21 d的ES-E14TG2a细胞在经0.1%明胶包被的培养皿上生长密度达到70%-80%，去掉培养液中白血病抑制因子，将DMEM更换为IMDM。传两三代使克隆生长处于良好状态。EB培养分化的培养液成分为：IMDM培养基、体积分数15%FBS、1 mmol/L NEAA、1 mmol/L L-谷氨酰胺、干细胞因子(40 µg/L)、血管内皮生长因子 (20 µg/L)、白细胞介素3(30 µg/L)、白细胞介素6(30 µg/L)、促红细胞生成素(10 µg/L)。细胞每天进行换液，每两三天进行传代。

流式细胞仪检测：分别收集经IMDM培养液诱导0，3，5，7，10，14 d的ES-E14TG2a细胞，调整浓度为5×10⁵ L^-¹，各加入5 µLPE Rat anti-mouse CD34抗体及Anti-Mouse Ly-6A/E(Sca-1)PE-Cy5抗体室温避光孵育30 min；用PBS清洗并重悬；上机检测。

Real-time PCR检测造血分化相关基因表达情况：EB的培养分化过程中分别收集0，3，5，7，10，14 d的细胞做Real-time PCR，检测造血分化相关的基因表达量，细胞总RNA的提取及反转录分别按Invitrogen公司和TAKARA公司提供的试剂盒说明书操作，相对定量按Thermo公司试剂盒说明书操作，使用的仪器为ABI7500荧光定量PCR扩增仪，使用primer5.0设计引物如下：

CD34：5’-GGT AAG CTC TCT GCC TGA TGA G-3’ (sense)， 5’-TGG TAGG AAC TGA TGG GGA TAT T-3’ (antisense)；

Flk2：5’-GAG CGA CTC CAG CTA CGT C-3’ (sense)，5’-ACC CAG TGA AAA TAT CTC CCA GA-3’ (antisense)；

BMP4：5’-TTC CTG GTA ACC GAA TGC TGA-3’ (sense)，5’-CCT GAA TCT CGG CGA CTT TTT-3’ (antisense)；

Smad5：5’-TTG TTC AGA GTA GGA ACT GCA AC-3’ (sense)，5’-GAA GCT GAG CAA ACT CCT GAT-3’ (antisense)；

β-actin：5’-GGC TGT ATT CCC CTC CAT CG-3’ (sense)，5’-CCA GTT GGT AAC AAT GCC ATG T-3’ (antisense)。

主要观察指标：①细胞免疫荧光和WB检测β-catenin蛋白是否在细胞质内积累。②荧光定量PCR检测Wnt信号通路下游靶标基因表达水平。③流式细胞术检测造血干细胞表面标记物。④荧光定量PCR检测造血相关基因表达情况。

统计学分析：实验数据由第一作者采用SPSS 13.0软件进行处理，数据以x(_)±s表示，两组数间比较采用t 检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

造血干细胞是目前应用于细胞疗法最多的一类细胞，可用于治疗白血病、再生障碍性贫血、重症免疫缺陷症、实体瘤或淋巴瘤等造血及免疫系统功能障碍性疾病^[15-16]。用于移植的造血干细胞主要有3种来源：骨髓、外周血和脐带血，由于这些组织中造血干细胞含量稀少以及存在移植排斥等问题，从而导致2/3的潜在患者缺乏适合配型的造血干细胞，另外体内来源的造血干细胞在体外培养一段时间后，其治疗功效也会降低^[17]。而胚胎干细胞来源的造血干细胞，经体外实验和动物模型实验，已充分证明具有进一步分化为红系、髓系以及淋巴系细胞的潜能，是治疗免疫系统功能障碍性疾病前景看好的细胞来源^[18]。但目前急需解决的关键问题是如何诱导胚胎干细胞高效分化为造血干细胞，以缓解在临床应用中移植供体紧缺的难题。

已有文献报道胚胎干细胞经Wnt3a连续培养21 d后Wnt信号可保持长期激活的状态，且可以促进胚胎干细胞向中/内胚层发育，外胚层的发育将受到抑制^[18]，而造血干细胞由中胚层发育而来。因此是用含Wnt3a(100 µg/L)的干细胞培养液连续培养ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞21 d，然后再通过单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化。经典的Wnt/β-catenin信号通路在整个进化过程中有高度的保守性。在没有Wnt信号时, 胞浆内的β-catenin蛋白大部分与细胞膜上的钙黏蛋白(E-cadherin)结合，少部分与轴蛋白(Axin)、腺瘤性结肠息肉病基因蛋白(APC)、糖原合成激酶3β(GSK-3β)形成巨大复合物，CK1和GSK-3β可对β-catenin蛋白进行磷酸化，被磷酸化标记的β-catenin蛋白被泛素连接酶蛋白识别进而被泛肽化，最终导致β-catenin蛋白被降解，因而胞浆内游离β-catenin蛋白水平极低^[19-22]。实验用细胞荧光及蛋白免疫印迹检测经Wnt3a连续培养21d后ES-E14TG2a细胞中β-catenin蛋白的含量，发现与未经Wnt3a处理的ES-E14TG2a细胞相比β-catenin蛋白在细胞内的含量明显增加，说明ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞经Wnt3a连续培养21 d后经典的Wnt/β-catenin信号通路可能被激活，通过Wnt3a蛋白与跨膜受体Frizzled结合，将胞外信号传递给胞内散乱蛋白，激活的散乱蛋白能促进GSK-3β等物质磷酸化，使β-catenin蛋白从轴蛋白上脱落，破坏了蛋白降解复合体，使得β-catenin蛋白不能被降解，从而大量游离的β-catenin蛋白在胞质中聚集。细胞内积累的β-catenin蛋白会进入细胞核启动下游基因的表达，通过相对定量发现Pitx2、Frizzled、Sox17、Oct4这些Wnt信号的下游靶标基因在ES-E14TG2a细胞经Wnt3a连续培养21 d的过程中表达量均有不同程度的增加，进一步说明Wnt信号在诱导的过程中处于被激活的状态，其中Pitx2、Sox17为中胚层标志基因^[18]，其表达量的增加说明Wnt信号通路的激活可以促进胚胎干细胞向中胚层发育，Oct4基因对胚胎干细胞自我更新和全能性的维持具有核心的调控作用，Oct4的高表达对克隆的形成具有促进作用^[23-24]，这与加入Wnt3a后细胞即出现成团生长的现象相符，由于21 d时检测到的Oct4基因的表达量有所降低，说明该细胞的未分化潜能有所下降，因此不考虑更长时间的诱导。

实验第2阶段探究Wnt信号的激活是否可以促进胚胎干细胞向造血干细胞分化，流式细胞仪检测结果表明经Wnt3a连续培养21 d的ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞通过单层贴壁培养法诱导其造血分化的过程中CD34和Sca-1双阳性标记的细胞含量明显较对照组高，且在第14天的时候可达20.2%，而对照组仅为11.9%。骨形态发生蛋白4基因在调控胚胎腹侧中胚层与造血、内皮前体细胞形成中有重要作用^[25-27]，FLK2基因表达于小鼠胚胎发育早期的中胚层细胞上，是造血和血管发育的重要调节因子^[28-29]。相对定量结果表明骨形态发生蛋白4和FLK2在胚胎干细胞向造血干细胞分化的过程中先下降后又逐渐上升的趋势，且在第10天时达到最高值说明此时中胚层的发育比较活跃。Smad5基因为抑制造血分化的基因^[30-31]，虽然在诱导其造血干细胞分化的过程中Smad5的表达量没有一个明显的趋势，但是从造血分化一开始Smad5基因的表达就始终处于被抑制的状态，可见该诱导过程有利于胚胎干细胞的造血分化^[32-33]。CD34基因与造血相关^[34]，在7-10 d其表达量逐渐上升，说明此时细胞造血过程活跃。可见通过相对定量的方法检测与造血相关的基因骨形态发生蛋白4、FLK2、CD34和Smad5的表达量与流式结果相符合，细胞的CD34和Sca-1双阳性也是在7-10 d出现较高的增长率且实验组均较对照组双阳性比例高。流式结果及QRT-PCR结果均说明诱导分化第7-10天是中胚层发育和造血过程较活跃的阶段。

综上，实验为Wnt信号通路活化促进小鼠胚胎干细胞向中胚层干/祖细胞增殖这一理论提供了证据，为细胞替代疗法打开了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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持续Wnt信号通路激活促进胚胎干细胞源造血干细胞的增殖

Proliferation of hematopoietic stem cells differentiated from embryonic stem cells via sustained Wnt pathway activation

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