脂肪干细胞的三维球形培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.009

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (6): 872-879.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.009

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脂肪干细胞的三维球形培养

王婵¹，戴应¹，郭永龙¹，杨艳²，刘庆²，陈建苏^1，2

¹暨南大学再生医学教育部重点实验室，广东省广州市 510632；²暨南大学医学院眼科研究所，广东省广州市 510632

修回日期:2013-12-16 出版日期:2014-02-05 发布日期:2014-02-05
通讯作者: 陈建苏，眼科研究所主任，教授，硕士生、博士生导师，暨南大学再生医学教育部重点实验室，暨南大学医学院眼科研究所，广东省广州市 510632
作者简介:王婵，女，1989年生，湖北省荆门市人，汉族，暨南大学在读硕士，主要从事脂肪来源干细胞的球形培养以及生物反应器的相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目“微重力介导角膜基质细胞的iPS诱导及其角膜内皮细胞分化(30973244)”

Three-dimensional spherical culture of adipose-derived stem cells

Wang Chan¹, Dai Ying¹, Guo Yong-long¹, Yang Yan², Liu Qing², Chen Jian-su^{1, 2}

¹Key Laboratory for Regenerative Medicine of Ministry of Education, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; ²Institute of Ophthalmology, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China

Revised:2013-12-16 Online:2014-02-05 Published:2014-02-05
Contact: Chen Jian-su, Professor, Master and doctoral supervisor, Key Laboratory for Regenerative Medicine of Ministry of Education, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China
About author:Wang Chan, Studying for master’s degree, Key Laboratory for Regenerative Medicine of Ministry of Education, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30973244

摘要/Abstract

摘要：

背景：大多哺乳类细胞在正常生理状态下多以三维结构存在，为还原细胞本身在体内的自然状态，很多研究者开始尝试在体外对细胞进行三维培养，球形培养是一种常见的三维培养模式。

目的：尝试用3种不同的方法在体外对人脂肪干细胞进行球形培养，并观察其生物学特征。

方法：对提取的脂肪来源细胞进行表面Marker流式检测以及成脂成骨诱导鉴定后，证实为脂肪干细胞。先后用低黏附培养法、hanging-drop培养法和Eppendorf管培养法3种方法在体外对脂肪干细胞进行球形培养，对3种方法形成球形的特点进行比较分析，并通过Imagej软件计算出3组多细胞球体的平均面积，利用Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live & Dead Cells试剂盒对3组多细胞球体进行活力检测。

结果与结论：①通过流式细胞术鉴定细胞表型标志物，其中CD29，CD44，CD59完全阳性，同时成脂成骨诱导也为阳性，证实提取的细胞为脂肪干细胞。3代以内脂肪干细胞多呈长梭形，并克隆状生长。②低黏附培养法、hanging-drop培养法、Eppendorf管培养法均可使脂肪干细胞聚集成球形生长，但所成多细胞球形有所差异。低黏附培养法所形成的细胞球形大小不一，不易控制；而hanging-drop培养法和Eppendorf管培养法均可使脂肪干细胞形成大小均一的球形，但在大小和形成时间上有所不同。③3种不同方法所形成的球形细胞均保持较好的细胞活力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 诱导分化, 球形培养, 活力, 低黏附培养, hanging-drop培养, Eppendorf管培养, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND:Many types of mammalian cells aggregate and display three-dimensional multicellular spheroids when they are in normal physiological conditions. In order to observe and explore cellular natural states, many researchers try to use spherical cell culture in vitro, a common three-dimensional culture pattern.

OBJECTIVE:To use three different methods for spherical culture in vitro of adipose-derived stem cells and to observe their biological features.

METHODS: Adipose-derived stem cells were confirmed by the analysis of the markers for cell phenotypes as well as adipogenic and osteogenic differentiation potential assays. Three different methods of sphere cultures were used as follows: (1) ultra low attachment culture; (2) hanging-drop culture and (3) Eppendorf tube culture. The sphere formation was compared among above three methods. We used Imagej to calculate mean areas of these spheres. And we used Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live & Dead Cells to detect their vitality.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Adipose-derived stem cells were confirmed by the analysis of the markers for cell phenotypes, CD29, CD44, CD59 were positive, as well as adipogenic and osteogenic differentiation potential assays were positive. The conventional monolayer cultures of adipose-derived stem cells showed spindle and cloning growth within three passages. (2) Ultra low attachment culture, hanging-drop culture, Eppendorf tube culture all could elicit adipose-derived stem cells spherical growth. However, spherical size, shape and uniformity differed depending on cell numbers, culture time and spherical culture methods. The ultra low attachment culture was comparatively difficult to control spherical shape and uniformity of adipose-derived stem cells. But hanging-drop culture and Eppendorf tube culture were able to form even cell spheres. (3) Spherical formation of adipose-derived stem cells using our three methods displayed good cell vitality.

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Key words: stem cells, adipose tissue, cell culture techniques, spheroids, cellular

中图分类号:

R394.2

王婵，戴应，郭永龙，杨艳，刘庆，陈建苏. 脂肪干细胞的三维球形培养[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(6): 872-879.

Wang Chan, Dai Ying, Guo Yong-long, Yang Yan, Liu Qing, Chen Jian-su. Three-dimensional spherical culture of adipose-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(6): 872-879.

图/表（结果） 6

2.1 脂肪干细胞原代及传代培养 倒置显微镜下观察，接种后3 d，细胞已基本贴壁，呈梭形或多角形，大小不一(图1A)。培养7 d后，细胞几乎全呈长梭形，并且达到60%-70%融合，开始进入对数生长期(图1B)。12 d时，细胞基本达到100%融合，并出现明显的克隆聚集状(图1C)。原代细胞进行传代培养后，3代内细胞仍呈长梭形。

2.2 脂肪干细胞表型标志物的表达 流式细胞仪检测的结果显示，原代脂肪干细胞CD29，CD44，CD59完全阳性，说明分离的细胞是间充质干细胞特征的细胞；CD45，HLA-DR完全阴性，说明分离的细胞不是血源细胞；CD34，CD105不全为阴性(图2)。
2.3 脂肪干细胞成脂诱导结果 第3代脂肪干细胞进行成脂诱导1周后发现细胞出现单独存在的小脂滴，部分细胞含有多个小脂滴。诱导2周后脂滴明显变大，脂滴间相互融合变成大的脂滴，折光性很强。油红O染色后可见脂滴被染成红色(图3A)，而对照组只有细胞核被苏木精染上浅蓝色(图3B)。 2.4 脂肪干细胞成骨诱导结果 第3代脂肪干细胞进行成骨诱导1周后发现细胞出现钙化节，部分细胞含有钙化现象类似细胞凋亡出现的碎片。诱导2周后钙化现象明显，钙化节间相互融合，沙粒样的物质增多。茜素红染色后可见钙化结构被染成红色(图3C)，而对照组细胞没有染上颜色(图3D)。

2.5 低黏附培养脂肪干细胞形成细胞球形 第2代人脂肪干细胞以1×10⁷ L^-¹，1×10⁸ L^-¹，1×10⁹ L^-¹ 3个细浓度接种于低黏附的6孔板中，0 h时，细胞均为单个细胞，之间没有任何连接。12 h时，3个浓度的细胞均开始聚集，可以明显发现，随着浓度增大，细胞聚集越明显。24 h时，1×10⁷ L^-¹浓度下细胞没有继续聚集变大；1×10⁸ L^-¹浓度下细胞开始聚集呈规则的，大小均一的球形；1×10⁹ L^-¹浓度下细胞大量聚集在一起形成片状。上述观察为低黏附培养法形成的脂肪干细胞聚集生长情况(图4)，重复3次此实验过程均具有类似的结果。

2.6 hanging-drop法培养脂肪干细胞成团 通过正置显微镜观察发现，24 h时，细胞开始出现聚集现象，呈现出不规则状态(图5A)。48 h时，细胞聚集成较圆，较规则的球形(图5B)。

2.7 Eppendorf管法培养脂肪干细胞成团 脂肪干细胞在Eppendorf管中培养2 d后，吸出进行观察，细胞已聚集成不规整的团状(图5C)。继续在低黏附培养板上悬浮培养 3 d后(第5天)，细胞聚缩成形态规则、边缘整齐且紧实的细胞球(图5D)。上述观察为Eppendorf管培养法形成的脂肪干细胞聚集生长情况，重复20次上述实验过程均具有类似的结果。

2.8 球形细胞大小比较 3种不同方法在同一细胞浓度1×108 L-1下对脂肪干细胞进行球形培养48 h后，形成相应的球形细胞，发现：3种方法所形成的球体在大小以及形态上均有较大的差异，低黏附组形成的球形相较hanging-drop组，Eppendorf管组大小不统一，形态不规则(图6)。
用Imagej软件对细胞球形平均面积进行计算以及相对比较，发现：低黏附组，hanging-drop组，合。管组所形成的多细胞球形面积呈依次增大趋势(图7)。
2.9 球形细胞活力比较 3种不同方法对脂肪干细胞进行球形培养48 h后，形成相应的球形细胞。染色后用荧光显微镜进行拍照观察，其中活细胞呈绿色而死细胞呈红色。结果发现3种方法所形成的球形细胞均保持较好的细胞活力，只有局部死细胞被染上红色，以绿色的活细胞为主(图8)。

2.10 球形细胞贴壁生长 3种不同方法对脂肪干细胞进行球形培养48 h后，形成相应的球形细胞。对其进行常规贴壁培养，1 d时，低黏附组小团块迅速爬出细胞；hanging-drop组中团块开始均匀爬出细胞；Eppendorf管组大团块此时出现极性生长特性(单侧先出现细胞贴壁生长的趋势)(图9A-C)。继续培养3 d后，低黏附组小团块细胞团几乎完全生长开，团消失；hanging-drop组中团块球形开始有消散的迹象；Eppendorf管组大团块细胞极性消失，整个球体周围均爬出细胞(图9D-F)。

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引言

材料方法

设计：细胞生物学体外培养观察比较实验。

时间及地点：实验于2012年5月至2013年6月在暨南大学再生医学教育部重点实验室完成。

材料：

实验材料来源：脂肪组织来源于在暨南大学附属第一医院以及华美整形美容医院行抽脂术的肥胖患者，标本采集均获得当事人同意并签订知情同意书。

实验方法：

脂肪干细胞的分离和培养：将抽脂得到的脂肪组织用PBS洗涤六七次至洗涤液变澄清，在洗涤干净的脂肪组织中加入同等体积的已预热的0.1%Ⅰ型胶原酶，37 ℃消化30-45 min，并经常摇动，待脂肪组织块呈黏稠且细小的颗粒状后，300×g离心5 min，小心去除上层杂液，留5 mL悬液于底部，加入适量PBS稀释胶原酶作用，吹打悬液后用100目筛网过滤，所得滤液300×g离心5 min，收集细胞，最后用含有体积分数为10%胎牛血清、1%双抗(P/S)(青霉素和链霉素)的LG-DMEM完全培养液重悬，以1×10⁸ L^-¹的浓度接种于25 cm²的培养瓶中，37 ℃，体积分数为5%CO₂采件下培养3 d后换液去除未贴壁的血细胞及其他杂质，以后每3 d换液1次，待细胞近90%融合时，即用0.25%的胰蛋白酶消化，进行传代培养^[3]。以下所有实验均采用3代内的细胞。

流式细胞术鉴定干细胞表型标志物：利用流式细胞分析技术检测原代脂肪干细胞表面标志物的表达(CD29，CD44，CD59，CD34，CD45，HLA-DR)。消化收集原代脂肪干细胞，1×10⁶个细胞/管，用PBS冲洗两三次，用100 μL包含单克隆抗体的PBS重悬脂肪干细胞，室温孵育30 min，然后用PBS冲洗细胞两三次，再用FITC标记的二抗(1∶100稀释)4 ℃避光孵育20 min，PBS冲洗两三次后用200 μL PBS重悬，流式细胞仪检测。

成脂诱导：待第3代脂肪干细胞生长至80%融合时，换成脂诱导培养基(DMEM/F12，体积分数为10%胎牛血清，1 μmol/L胰岛素，200 μmol/L吲哚美辛，1 μmol/L地塞米松，0.5 mmol/L异丁基-甲基黄嘌呤，1% P/S)进行培养，每3 d换1次成脂诱导液，诱导2周后，进行油红O染色。细胞进行染色之前，先用40 g/L多聚甲醛溶液固定细胞 15 min，后用PBS冲洗两三次。再将细胞置于2%油红O试剂中，室温孵育30 min，用60%异丙醇漂洗两三次进行脱色处理，后用淡苏木精染液复染2 min，PBS清洗后进行拍照观察。以未用成脂诱导液培养的第3代脂肪干细胞作为空白对照组，采用常规的完全培养液进行培养。

成骨诱导：待第3代脂肪干细胞生长至80%融合时，换成骨诱导培养基(DMEM/F12，体积分数为10%胎牛血清，0.1 μmol/L 地塞米松，50 mg/L 2-磷酸化抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸盐，1% P/S)进行培养，每3 d换1次成骨诱导液，诱导2周后发现细胞出现大量的钙化节，用PBS清洗细胞后用纯丙酮固定15 min，用茜素红和碱性磷酸酶(1 g/L Fast Red-TR和0.04% Naphthol AS-MX)染色，PBS清洗后进行拍照观察。以未用成骨诱导液培养的第3代脂肪干细胞作为空白对照组，采用常规的完全培养液进行培养。

低黏附培养脂肪干细胞形成细胞球形(低黏附组)：参照文献[4]方法。常规培养脂肪干细胞至第2代进行细胞团实验。消化收集细胞，用KSR培养液(DMEM/F12，1×non-Essential Amino Acids，1×L-Glutamine，0.1 mmol/L β-mercaptoethanol，4 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，20% KSR)^[5]轻轻吹打、重悬细胞，分别以1×10⁷ L^-¹，1×10⁸ L^-¹，1×10⁹ L^-¹ 3个浓度接种于低黏附的6孔板中，每孔加KSR培养液2 mL，并于培养0，12，24 h对其进行拍照观察。

hanging-drop法培养脂肪干细胞形成细胞球形(hanging-drop组)：参照文献[6]方法。常规培养脂肪干细胞至第2代进行细胞团实验。在6孔板中培养细胞近90%融合，用0.25%胰蛋白酶消化细胞后，每孔用3 mL KSR培养液轻轻重悬细胞(浓度约2×10⁸ L^-¹)，滴20-30 μL (4 000- 6 000个细胞)悬液于35 mm细胞培养皿盖上，进行悬滴状培养，分别于培养24，48，72 h时进行拍照观察。

Eppendorf管法培养脂肪干细胞形成细胞球形(Eppendorf管组)：自创Eppendorf管培养法。常规培养脂肪干细胞至第2代进行细胞团实验。脂肪干细胞培养于6孔板中，用0.25%胰蛋白酶消化细胞后，每孔用3 mL KSR培养液轻轻重悬细胞(浓度约2×10⁸ L^-¹)，取200 μL于Eppendorf管中，后将其垂直置于37 ℃，体积分数为5%CO₂的培养箱中培养2 d。待细胞聚集成团状后，将其转移至低黏附培养板中继续悬浮培养两三天，至细胞聚缩成形态规则、边缘整齐且紧实的细胞球，分别于2 d和5 d时对其进行拍照观察。

球形细胞活力比较：上述3种方法对脂肪干细胞进行球形培养48 h后，形成相应的球形细胞。为检测细胞团的活力，使用Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live & Dead Cells试剂盒对其进行检测。收集细胞团，用PBS冲洗两三次，后用2 mL PBS重悬细胞团，在其中加入4 μL EthD-III，1 μL Calcein AM，室温孵育30-45 min，弃去染液用PBS冲洗两三次，用荧光显微镜进行拍照观察，其中活细胞呈绿色而死细胞呈红色^[7]。

球形细胞贴壁生长：上述3种方法对脂肪干细胞进行培养48 h后，形成相应的球形细胞。分别将其吸出后用常规完全培养基进行贴壁培养，分别在1，3 d时对其进行拍照观察。

主要观察指标：①细胞表面标志物的表达。②干细胞成脂成骨分化能力。③细胞形态变化。④球形细胞活力比较。

统计学分析：3种不同的球形培养方法产生的细胞球形面积采用image j软件进行计算，所有数据由第一作者用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

目前大多数细胞的体外培养均为贴壁培养即二维培养状态，这种方式不能真实反映细胞在体内的正常生理状态，部分会失去其在自然状态下的组织特异性。很多哺乳类的细胞在悬浮或低黏附培养环境下可聚集形成多细胞的三维球体，与常规单层细胞的贴壁培养比较，这种三维球形培养产生的细胞球体更接近于真实的组织状态，更接近其结构与功能特征^[8]。研究发现，较多原代细胞或祖细胞在形成球形细胞后其活力及功能表征均显著提高，这使细胞球体成为组织重建的理想来源。细胞形成球形后会出现不同表征，在某些细胞团中甚至出现极性生长现象。成体干细胞成球后有利于其干性的保持与提高^[9]，甚至部分成体细胞在聚集成球形后还可激发其干性的形成与表达^[10]，另外，细胞形成球形后再移植有更高的存活率，这对于生物医学很有意义^[11]，在临床能实现人创面的快速修复，且能有效促进细胞的活性愈合。

图9 脂肪干细胞经过48 h悬浮培养后所成球形贴壁培养1，3 d(倒置相差显微镜，×100)

Figure 9 Spheroids formed after 48 hours of suspension culture of adipose-derived stem cells, which were then placed into adherent culture for 1 and 3 days (inverted phase contrast microscope, ×100)

图注：常规贴壁培养1 d时，低黏附组小团块迅速爬出细胞(A)；hanging-drop组中团块开始均匀爬出细胞(B)；Eppendorf管组大团块出现极性生长特性(C)。常规贴壁培养3 d后，低黏附组小团块细胞团几乎完全生长开，团消失(D)；hanging-drop组中团块球形开始有消散的迹象(E)；Eppendorf管组大团块细胞极性消失，整个球体周围均爬出细胞(F)。

因此，目前对于细胞球形培养的研究已然成为科学研究的热点，大批学者正在对球形形成的方法、原理、应用进行广泛的研究。细胞形成球形的方式有很多，包括无血清培养法^[12-13]，低黏附培养法^[14-15]，甲基纤维素培养法^[16]，离心沉降培养法^[17]，摇床动态培养法^[18]，机械刮除细胞成球法^[19]，借助载体成球法^[20-21]，hanging-drop培养法以及在旋转的生物反应器中悬浮培养法等^[22-27]。

球形培养常常用于组织干细胞的分离与扩增。干细胞是一类具有自我更新与增殖能力的细胞，按其分化阶段不同分为胚胎干细胞与成体干细胞，目前对成体干细胞的研究较为广泛。脂肪干细胞是来源于脂肪组织的干细胞，具有自我更新及多向分化的能力，在适宜诱导条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等^[28]。本研究通过流式细胞术鉴定细胞表型标志物以及成脂成骨诱导实验，证实所提取的细胞为实验所需的脂肪来源干细胞。同时，通过体外的原代以及传代培养，发现脂肪干细胞易扩增，不易衰老等特点。

近几年来，有不少学者对脂肪干细胞的球形培养进行了研究，2009年，Radtke等^[29]使脂肪干细胞在无血清培养基中形成神经球后分化为神经胶质细胞。2011年， Huang等^[30]利用壳聚糖和透明质酸等载体使脂肪干细胞产生聚集球形细胞团。同年，Ferro等^[31]在脂肪干细胞成球形后成功将其转化成牙齿组织。2012年，Kapur等^[6]通过hanging-drop培养技术使脂肪干细胞形成多细胞球体，并发现所形成的球体具有极性的特点。细胞的活力与密度会直接影响细胞聚集成球的效率，要有比较适合的细胞密度，才能形成较规则的多细胞球形。

本研究应用低黏附培养法、hanging-drop培养法和Eppendorf管培养法3种不同的方法进行脂肪干细胞球形培养有以下特点：①低黏附培养法操作简单，脂肪干细胞的三维成球的速率相对较快，可保持细胞较高的活性，但缺点是成球的效率不稳定，所形成的球形细胞大小不能统一。②Hanging-drop可以形成大小均一、细胞量确定的脂肪干细胞球形，缺点是操作比较繁琐，工作量大，所形成的球体相对较小。③Eppendorf 管培养法可将较大量的细胞悬液置于管内，形成较hanging-drop培养法大的细胞球形，其优点是操作简单，可大批量产生较大的且大小均一的细胞球形。另外，将Eppendorf 管培养法产生的多细胞球体转移至黏附培养板进行常规壁培养时，在培养早期可发现细胞团具有一定的极性生长趋势。但是，要形成形态规则、边缘圆滑的细胞球形则需相对较长的时间。

脂肪干细胞的体外培养过程中，发现上述3种方法均可使其形成较理想的球形，且保持较高的细胞活力与细胞生长形态；3种方法的脂肪干细胞球形状态既可以保持活力进行悬浮三维培养，也可以贴壁二维生长。本研究获得的脂肪干细胞三维球形培养将有利于应用脂肪干细胞进行干细胞分化、生物3D打印、组织工程和干细胞移植治疗等研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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单层的细胞培养系统不是一种贴近细胞真实生理状态的培养模式，不能真实地反映细胞在体内的形态与功能。而三维培养环境，能在一定程度上模拟细胞在体内的生存环境，还原细胞正常的生理生化状态，便于我们在体外对其进行观察与研究，同时也对日后的临床应用有着相当重要的意义。因此，目前对细胞三维培养模式的探讨已成为当前的研究热点。

近年来，关于三维球形培养的研究也在一步步深入中。细胞形成球形的方法，细胞形成球形的原理与机制，细胞在形成球形后产生的特殊生理功能、各方面生化性质的变化，以及球形细胞的优势与应用价值等方面的相关研究报道层出不穷。

本文则着重探讨了人脂肪干细胞形成球形的3种方法，并对其进行比较与优缺点说明，以及观察脂肪干细胞在形成球形后的部分生化性质，在干细胞球形培养上有一定的指导意义和参考价值，但脂肪干细胞形成球形的原理以及相关临床应用价值还需要更深入的研究。

关于干细胞球形培养的报道也有很多。例如，球形培养有利于间充质干细胞的生长以及分化应用，科学家甚至能够让这些细胞表达控制内皮细胞贴壁的功能基因CXCR4。球形培养人牙龈间充质干细胞有利于减轻化疗带来的口腔黏膜炎。通过利用琼脂糖降低细胞贴壁性，使细胞球形生长，在体外没有支架的条件下人脂肪干细胞可以转分化为多层的三维组织。通过形成球形，人间充质干细胞能够成功地转化成肝脏细胞等。

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脂肪干细胞的三维球形培养

Three-dimensional spherical culture of adipose-derived stem cells

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