两种细胞因子联合诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014-06-002

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞可被定向诱导分化为神经样细胞，理论上骨髓间充质干细胞可作为种子细胞应用于周围神经组织工程。

目的：用2种细胞因子联合诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞，进一步探讨其在周围神经损伤方面的应用。

方法：从Wistar大鼠胫骨和股骨提取骨髓间充质干细胞，采用差速贴壁法进行培养和纯化，联合应用碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对细胞进行诱导，观察细胞形态变化，并用免疫组织化学方法检测骨髓间充质干细胞中神经元特异性标志物的表达；并研究终止诱导后骨髓间充质干细胞的形态及免疫组织化学方面的变化。

结果与结论：骨髓间充质干细胞经诱导后呈典型神经细胞样改变，有两个或多个突起，突起之间相互连接成网状，可见细胞核及核仁，免疫组化检测神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白及突触素蛋白表达阳性。撤除诱导条件后大部分细胞逐渐恢复原来的成纤维细胞样形态，上述3种蛋白的表达量明显下降。表明应用神经营养因子可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞，但其形态及组织学变化仅能维持一段较短的时间。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 神经营养因子, 骨髓间充质干细胞, 种子细胞, 碱性成纤维细胞生长因子, 表皮生长因子, 诱导, 分化, 周围神经损伤

Abstract:

BACKGROUND:Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) can be induced to differentiate into neuron-like cells directionally. Accordingly, BMSCs can be used as seed cells theoretically in constructing tissue-engineered peripheral nerves.

OBJECTIVE: Using combination of two cytokines to induce BMSCs differentiating into neuron-like cells directionally, and further to discusse its application in peripheral nerve injury.

METHODS: BMSCs were isolated and purificated from the bone marrow of Wistar rats by using the differential adherence method. Basic fibroblast growth factor and epidermal growth factor were used to induce the BMSCs differentiating into neuron-like cells. The morphological change was observed and the neuronal specific markers were detected by immunohistochemistry technique. The morphological and immunohistological changes were also studied after the induce agent were removed.

RESULTS AND CONCLUSION: With presence of morphological and immunohistochemical features of nerve cells induced by neurotrophic factors, BMSCs exhibited two or more processes that were interconnected as a meshwork; cell nucleus and nucleus could be observed with strong light refraction of cytoplasm. After immunohistochemical staining, neuroln specific enolase, neurofilament protein and synaptophysin protein positive cells were detected. A great amount of cells reversed to their original fibroblast-like morphology, and the expression of the three above-mentioned proteins decreased as the induce agent withdrawn. Our study showed that BMSCs can be induced to differentiate into neuron-like cells, but the transdifferentiation is a short-time reversible phenomenon.

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Key words: neurturin, mesenchymal stem cells, mesenchymal stem cell transplantation, cell differentiation

中图分类号:

R394.2

黄建锋，黄继锋，张伟才. 两种细胞因子联合诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(6): 829-834.

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图/表（结果） 3

2.1 骨髓间充质干细胞生长情况和形态变化 初接种的原代细胞呈圆形，悬浮状，接种24 h后部分细胞开始贴壁，但仍保持圆形(图1A1)；接种3 d后全量换液去除未贴壁细胞，贴壁细胞有伪足伸出，大部分细胞呈多角形或短梭形，折光性变强(图1A2)；培养7 d后出现团簇集落样生长并有纤维发出(图1A3)；培养10 d后细胞呈成纤维细胞样的长梭形，胞核呈卵圆形，胞浆丰富，彼此融合成片(图1A4)。

2.2 诱导后骨髓间充质干细胞形态的变化 对照组细胞保持扁平宽大的状态(图1B1)；干预组联合诱导5 d后细胞胞浆回缩，呈水滴样，折光性明显增强，部分细胞呈现典型神经细胞样改变，细胞伸出2个或多个突起(图1B2)；联合诱导8 d后细胞突起逐渐增多并延长，相互连接成网状，可见细胞核及核仁(图1B3)；撤除诱导条件3 d后可见大部分细胞逐渐恢复原来的成纤维细胞样形态(图1B4)。

2.3 免疫组化结果进一步确定骨髓间充质干细胞的神经分化 为进一步确定骨髓间充质干细胞是否分化为神经细胞，分别于各观察时相点采用神经元特异标志物神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白，突触囊泡膜特异性蛋白质突触素进行鉴定^[35-37]。免疫组化结果显示，碱性成纤维生长因子及表皮生长因子联合诱导5 d后，大部分有核细胞胞质表达神经元特异性烯醇化酶，染色呈红色(图2A)，部分细胞突起延长相互交织成网状。神经丝蛋白是一种神经元特异性的中间纤维，是神经元胞质的主要结构之一^[36]，其阳性表达部位与神经元特异性烯醇化酶类似，染色呈绿色，主要存在于细胞胞体与突起部位(图2D)。突触素蛋白是存在于突触囊泡膜上的一种糖蛋白质，参与突触发生^[37]，其表达主要集中在胞质，染色呈绿色(图2G)。联合诱导8 d后，细胞呈典型的神经细胞形态，神经元特异性烯醇化酶的表达有所下降(图2B)，神经丝蛋白和突触素的表达上升，主要集中在胞质，甚至是部分突触(图2E，H)。撤除诱导条件3 d后，大部分细胞逐渐恢复原来的成纤维细胞形态，上述3种蛋白的表达量均明显下降(图2C，F，I)。对照组细胞未见3中蛋白阳性表达(图2J，K，L)。各个观察时相点3种蛋白的阳性率：诱导5 d后，神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、突触素阳性率表达分别为(70.3±4.2)%，(25.7±1.6)%，(3.6±0.5)%；诱导8 d后，神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、突触素阳性率表达分别为(54.1±3.8)%，(47.1±2.3)%，(32.0±2.1)%，与诱导5 d后比较差异有显著性意义(P < 0.01)；撤除诱导条件3 d后，神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、突触素阳性率表达分别为(21.6±2.3)%，(13.8±1.7)%，(9.4±1.1)%，与诱导5 d、诱导8 d后比较差异均有显著性意义(P < 0.01，图3)。

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引言

周围神经损伤的治疗一直是显微外科的难题，其中一些粗大、长段的周围神经缺损和多发性神经损伤，再生很难重建其正常结构，也很难再建立和远端的正常联接。周围神经缺损后的修复，不仅要恢复其结构，更重要的是恢复其感觉和运动功能，即周围神经功能性再生。近年来神经干细胞移植治疗成为周围神经损伤修复领域的研究热点^[1]，但神经干细胞来源有限，且存在伦理学方面的问题，细胞替代治疗成为周围神经系统疾病治疗的新途径^[2]。其中骨髓间充质干细胞来源方便，增殖快，体外分离纯化较容易；且具有多向分化潜能，一定的条件下能向神经细胞定向分化，同时能分泌多种神经营养因子，可有效修复周围神经损伤^[3]。

表皮生长因子可以促进细胞有丝分裂以及糖、蛋白质、DNA及RNA的合成，因此能够促进上皮细胞分裂增殖^[4]。表皮生长因子也与与细胞增殖调控及细胞衰老密切相关^[5]。与肿瘤生长、关节炎等许多疾病相关的血管生成作用是由包括表皮生长因子在内的一些血管生成因子介导的。表皮生长因子还可以促进肝细胞分裂和增殖，与肝再生和创伤修复关系密切^[6]，并且可经自分泌或旁分泌方式对气道上皮细胞的功能进行调控，从而对呼吸系统产生影响^[7]。表皮生长因子也具有影响睾丸发育和精子发生，调节卵巢的发育与生殖功能，促进合子发育，还可作为胚胎营养因子调节早期胚胎发育，并可通过激活胚泡和调节子宫接受性等途径启动胚泡植入^[8-10]。研究显示表皮生长因子能以自分泌和(或)旁分泌方式与表皮生长因子受体结合，促进角膜损伤修复，且表皮生长因子同时又是角膜瘢痕形成、青光眼术后滤道阻塞、人工晶体植入后纤维膜形成、翼状胬肉复发、激光角膜光学切除后上皮下混浊以及糖尿病和外伤导致的增殖性玻璃体视网膜病变的主要原因^[11-12]。表皮生长因子能够防止溃疡发生和促进溃疡愈合^[12-14]，并保护肠黏膜屏障，对黏膜上皮细胞等的生长、分化及组织修复起重要作用^[15-16]。

既往研究显示在发育脑和成年脑内，神经元和星形胶质细胞均可表达表皮生长因子，且在发育较晚期，表皮生长因子参与神经前体细胞增殖分化及细胞的生存和迁移，同时其作为具有神经营养活性的因子，在神经损伤后可以保护相应的背根神经节感觉神经元。此外，表皮生长因子还是一种脑肠肽神经递质^[17]。碱性成纤维生长因子能够促进创伤愈合及软骨组织的修复中的作用^[18-22]。研究显示碱性成纤维生长因子与心血管疾病关系密切，能够通过对基质细胞、成熟的血细胞生长的调控，在正常的生理性和病理性造血过程中发挥作用，还能促进了心肌细胞的增殖及毛细血管的形成^[23-25]。碱性成纤维生长因子对神经系统具有营养作用。

研究发现碱性成纤维生长因子广泛存在于中枢及外周神经系统中，对神经元有维持生存和促进生长及受损神经元的修复与再生作用^[26-30]，且碱性成纤维生长因子能够与其它生长因子协同共同修复神经损伤^[31-32]。

实验拟利用差速贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，并用表皮生长因子和碱性成纤维生长因子联合诱导其定向分化为神经样细胞，探讨此诱导方法对骨髓间充质干细胞分化能力的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：体外细胞学对比观察实验。

时间及地点：实验于2012年11月至2013年3月在武汉理工大学生物材料与工程研究中心完成。

材料：

动物：SPF级雄性Wistar大鼠3只，鼠龄4周，由湖北省疾控中心提供，合格证号：SCXK(鄂)2008-0005。实验过程中对动物的处理严格遵循2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准^[33]。

方法：

细胞分离纯化及形态特征观察：过量戊巴比妥腹腔麻醉处死Wistar大鼠，严格无菌条件下分离双侧股骨及胫骨，剪去骨骺端，暴露骨髓腔，用5 mL注射器抽取无血清α-MEM培养基反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液于无菌离心管中，过滤后1 000 r/min离心10 min，弃上清，完全培养基(体积分数10%胎牛血清，1.0×10⁵ U/L青霉素，100 g/L链霉素)重悬，按1.0×10⁹ L^-¹细胞浓度接种于75mL培养瓶中，37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度下孵育。2 d后全量换液，去除未贴壁细胞，隔天换液。待细胞长至基本融合后用0.25%胰酶37 ℃消化3 min，以6×10⁶ L^-¹细胞浓度接种传代。每天倒置相差显微镜下观察细胞生长形态并拍照。

分组诱导方法：将细胞分为分为干预组及对照组，各设置3个观察时相点：联合诱导后5，8 d和联合诱导8 d后再撤除诱导条件继续培养3 d。

选取生长状态良好的第3代细胞，胰酶消化后收集细胞并调整其浓度为1×10⁷ L^-¹，接种于预置盖玻片(预先灭菌并以多聚赖氨酸包被)的24孔板内，接种1 d后干预组加入终浓度均为20 μg/L的碱性成纤维生长因子及表皮生长因子进行诱导分化；对照组细胞仅用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养；37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%CO₂条件下孵育，隔天半量换液。每天倒置相差显微镜下观察2组细胞形态变化^[34]。

免疫组化染色观察细胞中特异性烯醇化酶、神经丝蛋白和突触素的表达：分别于各观察时相点取两组细胞爬片；40 g/L多聚甲醛固定30 min，体积分数3%H₂O₂室温孵育 5 min，去除特异性过氧化物酶；0.1%Triton-X100透膜 4 min；体积分数5%山羊血清封闭30 min；兔来源抗大鼠神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体(1∶200)、小鼠来源抗大鼠神经丝蛋白单克隆抗体(1∶400)、小鼠来源抗大鼠突触素蛋白单克隆抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜；CY3标记山羊抗兔IgG(1∶200)，FITC标记山羊抗小鼠IgG(1∶200)室温避光孵育30 min；DAPI染核，荧光显微镜下随机选择10个视野，计数阳性细胞率。

主要观察指标：细胞诱导前后形态学变化及神经元特异标志物神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白和突触囊泡膜特异性蛋白质突触素的表达情况。

统计学分析：所有数据均以x(_)±s表示，用SPSS 13.0统计软件(美国SPSS公司)进行分析。各组间的两两比较用LSD-t 检验，设定P ≤ 0.05为差异有显著性意义的标准。

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讨论

骨髓间充质干细胞来源方便，在体外培养能迅速纯化；且具有多向分化潜能，一定的条件下能向神经细胞定向分化，同时能分泌多种神经营养因子，可有效修复外周神经损伤^[3]。因此，骨髓间充质干细胞完全满足种子细胞的要求，将可能是神经组织工程一类理想的细胞来源。体内外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为神经样细胞，国内外学者已进行了一系列研究，主要诱导方法包括：二甲基亚砜、维甲酸、β-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等^[38]，这些方法诱导分化的骨髓间充质干细胞-许旺细胞移植入动物体内可有效修复周围神经缺损^[39-41]。

表皮生长因子是有丝分裂的促进因子，对细胞分裂具有促进作用，可诱导神经干细胞向星形胶质细胞分化，并促进轴突的生长和维持其存活^[42]；碱性成纤维细胞生长因子能维持由表皮生长因子激发的神经干细胞的存活及增殖，同样对神经干细胞具有定向诱导分化作用，并能维持神经元和星形胶质细胞的存活，具有丝裂原样作用^[43]。表皮生长因子和碱性成纤维生长因子具有协同作用，促进神经干细胞的分化^[44]。作者采用表皮生长因子、碱性成纤维生长因子联合诱导骨髓间充质干细胞分化为在形态上呈神经元样细胞形态，折光性明显增强，细胞伸出两个或多个突起，相互连接成网状，且分化的细胞表达神经元细胞的特异性标记蛋白神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、突触素，证明该细胞不仅形态学发生改变，而且分子水平也随之发生改变。然而，撤除诱导条件后，大部分细胞恢复到原来的成纤维样细胞形态，表达蛋白的阳性率表达明显降低。说明在脱离诱导条件后，用表皮生长因子、碱性成纤维生长因子联合诱导出来的细胞并非稳定的神经细胞，不能长期维持神经细胞的特性。

有研究表明，突触素蛋白是反应神经元和突出功能状况的一类内在标志物^[45]，是突触囊泡膜上的一种糖蛋白质，含有钙结合点，调节神经元突起延伸，参与突触囊泡的介导转运、神经递质释放、突触囊泡循环，参与突触发生^[37]。实验结果显示突触素蛋白不止在细胞胞体上有表达，在突起也有表达。实验利用表皮生长因子和碱性成纤维生长因子联合诱导出来的细胞具备神经元传导所需的结构-长的突起，但是否对去极化刺激有反应，是否具备成熟神经元的传导功能，尚需进一步深入研究。