重组慢病毒载体转染羊骨髓间充质干细胞及成骨基因表达量的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.001

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (6): 821-828.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.001

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重组慢病毒载体转染羊骨髓间充质干细胞及成骨基因表达量的变化

韩祥祯¹，何惠宇¹，胡杨¹，巴娇娇¹，王欢欢¹，米雪¹，阿布力孜•阿布杜拉²

¹新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；²新疆医科大学地方病重点分子生物学实验室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2013-12-25 出版日期:2014-02-05 发布日期:2014-02-05
通讯作者: 何惠宇，博士，主任医师，硕士生导师，新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:韩祥祯，男，1987年生，河南省滑县人，新疆医科大学在读硕士，主要从事口腔修复学临床及基础研究工作。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81060088)：三维打印构建组织工程化牙槽骨的实验研究；新疆维吾尔自治区自然科学基金(2011211A073)：荧光蛋白标记的组织工程骨修复颌骨缺损及其成骨能力的观测研究；新疆医科大学第一附属医院院内项目(2012ZZGC01)：组织工程牙支架材料粘结剂改性及力学性能的实验研究

Recombinant lentiviral vector transfected sheep bone marrow mesenchymal stem cells and osteogenic gene expression changes

Han Xiang-zhen¹, He Hui-yu¹, Hu Yang¹, Ba Jiao-jiao¹, Wang Huan-huan¹, Mi Xue¹, Abulizi•Abudula²

¹Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Molecular Biology Laboratory of Endemic Diseases, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2013-12-25 Online:2014-02-05 Published:2014-02-05
Contact: He Hui-yu, M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Han Xiang-zhen, Studying for master’s degree, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81060088; the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2011211A073; the grant from the First Affiliated Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2012ZZGC01

摘要/Abstract

摘要：

背景：碱性成纤维细胞生长因子具有促进骨髓基质细胞分裂增殖作用，而骨形态发生蛋白2在诱导新骨形成方面有重要的研究意义。

目的：分析骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子基因单独和联合转染对体外培养的骨髓间充质干细胞的增殖和骨向分化的影响，比较Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白等非特异性成骨基因于转染前后骨髓间充质干细胞相对表达量的差别，为构建组织工程骨的种子细胞做理论依据。

方法：构建碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2慢病毒载体，分别转染羊骨髓间充质干细胞，得到碱性成纤维细胞生长因子组、骨形态发生蛋白2组、联合组、对照组细胞，提取RNA后采用实时定量PCR的方法检测Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白等非特异性成骨基因的mRNA水平相对表达量的变化。

结果与结论：对照组、碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2及联合组4组间非特异性成骨基因表达量存在明显差异(P < 0.05)，且碱性成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白2具有交互作用(P < 0.05)，碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2联合组的Ⅰ型胶原蛋白和骨钙蛋白基因表达量明显高于其他3组，且差异有显著性意义(P < 0.05)；但是骨桥蛋白基因中差异无显著性意义(P > 0.05)。体外实验结果显示联合转染组中的Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白等非特异性成骨基因mRNA水平相对表达量较多，该组细胞的成骨功能最强，适合作为组织工程骨的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 碱性成纤维细胞生长因子, 骨形态发生蛋白2, 种子细胞, Ⅰ型胶原, 骨钙蛋白, 骨桥蛋白, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND:Basic fibroblast growth factor (bFGF) can promote the proliferation of bone marrow stromal cells, and bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) has an important significance in the induction of new bone formation.

OBJECTIVE: To analyze the effects of bFGF, BMP-2 and their co-transfection on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and to compare the relative expressions of collagen I, osteocalcin and osteopontin before and after cell transfection, thereby providing theoretical implications for seed cells in the construction of tissue-engineered bone.

METHODS:Lentiviral vectors carrying bFGF and BMP-2 were constructed to transfect sheep bone marrow mesenchymal stem cells. Cells were divided into four groups: bFGF group, BMP-2 group, co-transfection group and control group. The RNA was extracted using real-time quantitative PCR to detect mRNA levels of collagen I, osteocalcin, and osteopontin.

RESULTS AND CONCLUSION: Significant difference in non-specific osteogenic gene expressions was found among the four groups (P < 0.05). bFGF and BMP-2 showed an interaction (P < 0.05). Expressions of collagen I and osteocalcin in the co-tranfection group were higher than those in the other three groups (P < 0.05), but osteopontin expression exhibited no difference (P > 0.05). In vitro experiments showed that the relative expression of collagen I, osteocalcin and osteopontin were higher in the co-transfection group, indicating the cells from the co-transfection group have strongest osteogenic capacity that are suitable for seed cells for bone tissue engineering.

全文链接：

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, fibroblast growth factor 2, bone morphogenetic proteins, osteoblasts

中图分类号:

R394.2

韩祥祯，何惠宇，胡杨，巴娇娇，王欢欢，米雪，阿布力孜•阿布杜拉. 重组慢病毒载体转染羊骨髓间充质干细胞及成骨基因表达量的变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(6): 821-828.

Han Xiang-zhen, He Hui-yu, Hu Yang, Ba Jiao-jiao, Wang Huan-huan, Mi Xue, Abulizi•Abudula. Recombinant lentiviral vector transfected sheep bone marrow mesenchymal stem cells and osteogenic gene expression changes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(6): 821-828.

图/表（结果） 3

2.1 RNA电泳及碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2基因检测 凝胶电泳显示RNA完整(图1A)。碱性成纤维细胞生长因子PCR反应产物片段约468 bp，骨形态发生蛋白2 PCR反应产物片段约1 330 bp，电泳凝胶显示各基因片段大小与Marker显示的条带一致(图1B)。

质粒测序全序列对比发现有99%的同源性，碱性成纤维细胞生长因子质粒和骨形态发生蛋白2质粒均无移码突变(图1C-E)。

2.2 成骨相关基因的检测 Ⅰ型胶原蛋白基因PCR反应产物片段约290 bp，骨钙蛋白基因PCR反应产物片段约 149 bp，骨桥蛋白基因PCR反应产物片段约122 bp，β-actin PCR反应产物片段约150 bp，电泳凝胶显示各基因片段大小与Marker显示的条带一致(图2A)。成骨基因连接PMD-19T载体后测序结果显示：4个基因全序列对比发现有99%的同源性(图2B-E)。

2.3 诱导后的羊骨髓间充质干细胞转染前与转染后细胞图 诱导后的羊骨髓间充质干细胞即对照组，细胞形态呈长梭形。转染后的细胞形态差别明显，碱性成纤维细胞生长因子转染后细胞大量成纤维化，长梭形，漩涡状排列。骨形态发生蛋白2转染后细胞镜下可见1到2个呈巢状排列的细胞团块。联合转染组细胞两种形态均有，对照组细胞无上述改变，细胞生长无单独干预两组密集(图3)。

2.4 统计学检测结果 将3个非特异性成骨基因看成整体，通过多元方差分析可得出，对照组、碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2以及碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2联合组4组间Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白基因在mRNA水平表达量上存在明显差异(P < 0.05)，且碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2具有交互作用(P < 0.05，表1)。3个非特异性基因在4个组间表达量分别进行析因分析，得出结果显示碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2联合组中Ⅰ型胶原蛋白和骨钙蛋白基因mRNA水平表达量明显高于其余3组，且差异有显著性意义(P < 0.05)，即因子间在这两基因处有交互作用；但是骨桥蛋白基因差异并不存在显著性意义(P > 0.05)，即因子间在此基因处无显著交互作用(图4)。

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引言

材料方法

设计：2×2析因设计试验。

时间及地点：于2012年7月10日至2013年9月22日在新疆医科大学一附院科技楼感染与免疫实验室完成。

材料：

质粒来源：碱性成纤维细胞生长因子-plenti6/V5质粒由新疆医科大学第一附属医院口腔修复科胡杨硕士赠送；骨形态发生蛋白2-C4Flag-PMD19-T质粒由课题组韩祥祯构建。第3代羊骨髓间充质干细胞由新疆医科大学地方病重点分子生物学实验室提供。

方法：

骨形态发生蛋白2-C4Flag -Plenti6/V5真核表达质粒的制备及验证碱性成纤维细胞生长因子基因：

获得骨形态发生蛋白2-C4Falg PCR纯化产物和碱性成纤维细胞生长因子基因PCR产物：

人骨形态发生蛋白2基因上游引物：5’-CAC CAT GGT GGC CGG GAC CCG CTG T-3’，下游引物：5’- TCA ACT AGT CTT GTC GTC GTC GTC C-3’退火温度为55 ℃，扩增片段大小为1 330 bp；PCR反应体系 25 μL，Pfu PCR Buffer 4 μL，dNTP 3.5 μL，Pfu 0.5 μL、灭菌的dd H₂O 15.5 μL、模板骨形态发生蛋白2-C4Flag-PMD-19T质粒0.5 μL、上游引物和下游引物 (20 μmol/L)各0.5 μL，枪混匀。上PCR仪，预变性95 ℃ 5 min，1个循环；变性95 ℃ 50 s，退火温度55 ℃ 90 s，72 ℃ 105 s，35个循环；72 ℃，15 min，1个循环；扩增出骨形态发生蛋白2基因，片段约1 330 bp，1%琼脂糖凝胶电泳检测。参照大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书，进行纯化回收。

碱性成纤维细胞生长因子基因上游引物：5’-GGG CCC ATG GCA GCC GGG AGC ATC ACC AC-3’，下游引物： 5’- GTT TAA ACT CAG CTC TTA GCA GAC ATT G -3’，退火温度为55 ℃，扩增片段大小为482 bp；PCR反应体系25 μL，PCR Buffer 4 μL，dNTP 3.5 μL，rTaq 0.3 μL、灭菌的dd H₂O 15.5 μL、模板碱性成纤维细胞生长因子- plenti6/V5质粒 0.5 μL、上游引物和下游引物(20 μmol/L)各0.5 µL，枪混匀。上PCR仪，预变性95 ℃ 3 min，1个循环；变性95 ℃ 30 s，退火温度55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃，7 min，1个循环；扩增出碱性成纤维细胞生长因子基因，片段约，482 bp，1%琼脂糖凝胶电泳检测。

Plenti6/V5 Directional TOPO cloning：①Fresh 骨形态发生蛋白2 PCR产物：4 μL(产物∶质粒=0.5∶1-2∶1)。②Salt solution：1 μL。③TOPO载体：1 μL。共6 μL，室温孵育30 min，-20 ℃连接过夜。

连接产物转化，提取质粒：参照pLenti6/V5 Directional TOPO^®Cloning Kit说明书，将连接产物加入Stbl3感受态细胞进行转化，挑取5-10个阳性单克隆菌落于液体培养基中培养过夜，后用高纯度质粒小提中量试剂盒提取质粒，测序鉴定。

慢病毒载体转染羊骨髓间充质干细胞：参照胡杨等^[4]文献方法构建骨形态发生蛋白2慢病毒载体，收集病毒液。将诱导培养的第3代羊骨髓间充质干细胞，接种入六孔板，每孔1×10⁶个细胞。分别加入1 mL碱性成纤维细胞生长因子-慢病毒病毒液、骨形态发生蛋白2-慢病毒病毒液、以及碱性成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白2混合慢病毒病毒液、并且均加入Polybrene 10 mg/L，孵育过夜。最后用含Blasticidin的培养基筛选6-8 d，可见数个大小不等的、分散的细胞团块；未加病毒液筛选组细胞全部死亡。分别取不同病毒液转染后的羊骨髓间充质干细胞 1×10¹⁰ L^-¹，终体积为500 μL，设为碱性成纤维细胞生长因子组、骨形态发生蛋白2组及两因子混合组，再取未转染骨髓间充质干细胞1×10¹⁰ L^-¹，终体积为500 μL，设为对照组。

Trizol法提取RNA并反转录为cDNA：用TRIzol法提取 4组羊骨髓间充质干细胞总RNA，1×10¹⁰ L^-¹密度的细胞加 1 mL trizol裂解细胞后，顺序加入氯仿、异丙醇、75% ethanol，DEPC-treated-Water溶解RNA，用紫外分光光度计检测总 RNA的浓度和纯度，1%凝胶电泳显示RNA完整性。

两步法RT-PCR，顺序加入以下试剂：oligo(dT)18 Primer，总RNA模板，PCR仪设置70 ℃，5 min，1个循环；5×Reaction buffer，RiboLockTMRibonuclease inhibitor，(10 mmol/L)dNTP Mix，RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase。上PCR仪，37 ℃，5 min， 42 ℃，60 min，70 ℃，10 min，1个循环，cDNA合成完毕。

实时荧光定量PCR：引物由上海生工生物工程公司合成，骨桥蛋白的扩增片段长度122 bp，上游引物5’-CAG AGG CAC CAC ATG ACC AC-3’，下游引物 5’- CGA GTG AGC GAA AGA CAG CA-3’；骨钙蛋白的扩增片段长度 149 bp，上游引物 5’- GAT GCA GAG TCG GGC AAA G-3’，下游引物 5’-AGC TCA CAC ACC TCC CTC CT - 3’；Ⅰ型胶原蛋白扩增片段长度290 bp，上游引物5'-ACC TAC CAC TGC AAG AAC AGC G-3’，下游引物5'-AAG CAG ACA GAG CCG ATG TCG-3’；管家基因β-actin扩增片段长度150 bp，上游引物5’- GGC TCT CTT CCA GCC TTC CT-3’，下游引物5’- ATG CCA GGG TAC ATG GTG GT-3’。PCR反应产物，胶回收纯化后连接到PMD19-T载体，抽提质粒，测序鉴定。

荧光定量PCR反应体系为25 μL，Premix Ex Taq 12.5 μL，cDNA 2 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH₂O 9.5 μL；反应参数设置如下：骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和管家基因β-actin预变性，95 ℃ 3 min，然后按95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，进行40个循环。重复3次。

主要观察指标：碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2慢病毒，分别单独和联合转染骨髓间充质干细胞前后，Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白等非特异性成骨基因的mRNA水平相对表达量的变化。

统计学分析：使用2×2析因设计及多元方差分析进行统计学分析，应用SPSS 17.0软件进行数据处理，P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

构建组织工程骨的重点之一就是种子细胞的选择，骨髓间充质干细胞因具有多向分化潜能，取材方便，无明显的自体移植免疫排斥反应，常被认为是较为理想的种子细胞。但骨髓中骨髓间充质干细胞的数量较少，在体外培养经过多次传代后细胞增殖能力和分化能力均下降，导致成骨效果不佳^[5]。而生长因子如骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、转化生长因子等，因其能够调节成骨细胞的成骨能力等功能，而备受组织工程学者们的青睐。

现阶段，生长因子以体外培养细胞时，直接加入较为常见，此种方法添加生长因子，会随着换液或培养时间的延长，而不断降低其功能。慢病毒载体因其具有感染谱广(可感染分裂期和非分裂期细胞)，能够容纳较大外源性目的基因片段，目的基因整合后较少发生基因沉默现象，宿主免疫反应较小^[6]，安全性较好等特点成为常用的转基因方法之一^[7]。张经纬等^[8]用构建碱性成纤维细胞生长因子慢病毒载体转染软骨细胞，结果发现转染48 h后细胞培养液中碱性成纤维细胞生长因子明显表达。Indraccolo等^[9]研究发现，慢病毒载体在卵巢癌的基因治疗的体内实验中转染效率比逆转录病毒载体高10倍，表达效率高近100多倍。研究表明，慢病毒载体法具有质粒、腺病毒，腺相关病毒载体不具备的优势，有望成为基因治疗的良好载体。

碱性成纤维细胞生长因子是成纤维细胞生长因子家族的一员，具有促进新生毛细血管生成，促进软组织、软骨、骨组织及神经组织损伤修复的作用。Bonab等^[10]发现骨髓间充质干细胞在体外培养的过程中增殖和分化活性下降。Kotev-Emeth等^[11]在加入碱性成纤维细胞生长因子后，骨髓间充质干细胞的增殖活性增强，细胞增多，并能增加传代的次数。有学者认为，碱性成纤维细胞生长因子是一种强有力的促分裂素，能促进骨髓基质细胞分裂增殖，保持其成骨特性，并能促进软骨细胞前质的分化和软骨细胞的成熟^[12-13]。Nakamura等在动物实验中静脉注射碱性成纤维细胞生长因子，观察到成骨前体细胞明显增加，新生骨形成增多。而Xiao等^[14]的研究发现碱性成纤维细胞生长因子可促进鼠成骨样细胞株MC3T3-E1细胞骨钙素的mRNA表达和启动子活性，并呈剂量和时间依赖方式。李桥等^[15]研究发现碱性成纤维细胞生长因子可促进体外培养人牙髓细胞FGFR和骨桥蛋白的表达。而骨钙素是成骨细胞特征性分泌物之一，其出现标志着成骨细胞的成熟，可认为是细胞向成骨细胞方向转变的后期表型^[16]。骨桥蛋白(OPN)在骨基质的矿化和吸收过程中及维持骨组织与周围组织的完整性中有重要作用，是矿化形成的标志物之一^[17-18]。骨钙素可与骨桥蛋白形成复合物共同调控骨的钙化功能。Nakajima等^[19]体外实验发现碱性成纤维细胞生长因子可促进成软骨细胞增殖，并合成Ⅰ型胶原型和Ⅱ型胶原纤维，加速骨折端软骨形成。Ⅰ型胶原对骨的矿化起重要作，其基因表达的增强，可增加骨髓间充质干细胞向前成骨细胞和成骨细胞的分化，促进Ⅰ型胶原的合成，增加成骨细胞的来源，增加骨形成^[20-21]。本实验将骨钙蛋白、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原蛋白作为评价骨髓间充质干细胞成骨功能指标，发现单独碱性成纤维细胞生长因子基因转染组细胞骨钙蛋白、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原蛋白基因的mRNA水平表达量均高于对照组，与上述学者实验结果一致，说明碱性成纤维细胞生长因子不但可以对增强骨髓间充质干细胞的增殖能力，而且可以增强其成骨分化能力。

骨形态发生蛋白2是转化生长因子β超家族的成员，是骨生长的启动因子。骨形态发生蛋白2可以诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞表型分化，促进钙化作用，显著地增加骨钙素和碱性磷酸酶的表达，促进大部分骨基质蛋白的表达和细胞外基质的矿化，促进成骨细胞成熟^[22]。现阶段研究表明，骨形态发生蛋白2具有强大的成骨潜能，是其他生长因子无法比拟的。使用骨形态发生蛋白2研究细胞骨向分化的研究较多，杜俊杰等^[23]实验发现，在体内诱导成骨中人重组骨形态发生蛋白2促进了Ⅰ型胶原蛋白、mRNA及碱性磷酸酶的表达。李建军等^[24]用骨形态发生蛋白2基目的重组腺病毒(Ad-BMP2)转染人骨髓间充质千细胞，转染后细胞稳定表达骨形态发生蛋白2基因，骨钙蛋白、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶呈高性表达。Nakashinma和Mayr-Wohlfart等^[25-26]也得出这一结论，即骨形态发生蛋白2的促细胞分化作用表现为碱性磷酸酶的活性增高，骨桥蛋白、骨钙素及Ⅰ型胶原蛋白合成增加。但是相较于碱性成纤维细胞生长因子，其表达量上是有差异的。张为西等^[27]分别观察骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响发现，骨形态发生蛋白2刺激组的碱性磷酸酶，Ⅰ型胶原蛋白，骨钙蛋白的mRNA呈高表达；碱性成纤维细胞生长因子刺激组的碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白的mRNA表达量也高于对照组，但不如骨形态发生蛋白2明显。实验组中，单独骨形态发生蛋白2基因转染组中骨钙蛋白、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原蛋白基因的mRNA水平表达量均高于对照组，与上述学者实验结果一致，且高于碱性成纤维细胞生长因子组。说明，骨形态发生蛋白2的促成骨能力较碱性成纤维细胞生长因子强。

骨的形成、发育以及修复是一个复杂的多因素参与过程，其中涉及到许多生长因子的相互协调作用，多因子的联合应用受到越来越多的学者重视。李毅等^[28]用骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子基因的联合修饰体外培养的骨髓间充质干细胞，发现其增殖及成骨分化能力相比较于单独基因修饰，有更加明显的促进作用，动物实验发现其诱导形成拥有更大的相对骨面积和更高的血管密度的新生骨组织。现阶段研究表明骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子相互间可能还有协同作用。钱奇春等^[29]研究证明，重组人骨形态发生蛋白2与碱性成纤维细胞生长因子联合作用时，促增殖作用及碱性磷酸酶值均高于单一因子组，呈现出明显的协同作用，弥补了单一因子的不足。李鹏等^[5]也证实，一定浓度范围内，骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子的联合应用，促进骨髓间充质干细胞增殖的同时，也促进其骨向分化，两者对骨髓间充质干细胞有明显协同的生物学效应。这可能因为重组人骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子都具有促增殖作用，同时重组人骨形态发生蛋白2抑制了碱性成纤维细胞生长因子促进骨髓间充质干细胞向脂肪细胞等转化作用。并且骨形态发生蛋白2启动骨形成过程后，为碱性成纤维细胞生长因子提供了大量靶细胞。碱性成纤维细胞生长因子无异位诱导成骨活性，骨形态发生蛋白2的异位骨诱导作用又可弥补碱性成纤维细胞生长因子的不足^[30-31]。本实验组中联合基因转染组细胞骨钙蛋白、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原蛋白基因的mRNA水平表达量均高于对照组，且高于单独基因转染组，说明联合组促进骨髓间充质干细胞成骨功能最强，将Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白这3个非特异性成骨基因做为整体评价骨髓间充质干细胞细胞成骨功能，发现骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子基因在成骨功能上确有交互作用。同时，还发现骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子在Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白非特异性成骨基因表达中表现为协同作用。

骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子基因的联合转染能够增强羊骨髓间充质干细胞增殖及成骨功能^[32-33]，提高骨钙蛋白、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原蛋白等非特异性成骨基因的mRNA水平表达，两者对骨髓间充质干细胞有明显的协同作用，作用效果较碱性成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白2基因单独转染具有更佳的结果，其可作为理想的种子细胞，用于组织工程骨的构建。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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重组慢病毒载体转染羊骨髓间充质干细胞及成骨基因表达量的变化

Recombinant lentiviral vector transfected sheep bone marrow mesenchymal stem cells and osteogenic gene expression changes

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