设计:前瞻性自身对照研究。
时间及地点:于2011年3月至2013年1月在广州医科大学大学附属第二医院完成。
对象:
慢性移植物肾病诊断标准[1]:根据Banff 2007标准诊断。①临床表现:肾移植后6个月以上,移植肾功能呈进行性减退,血肌酐水平高于133 μmol/L,伴或不伴有高血压和/或蛋白尿等;彩超提示移植肾血管阻力指数升高(RI > 0.7)。②病理组织学标准:移植肾穿刺活检提示以间质纤维化、肾小管萎缩、肾小球硬化、细胞外基质沉积等改变为主要特征的慢性移植物肾病病理改变。③临床上排除急性排斥反应、典型的肾脏原发病复发、外科手术并发症、明确的神经钙蛋白阻滞剂类药物中毒、肾血管狭窄或栓塞、原发性或继发性糖尿病等引起的移植肾功能改变。
纳入标准:①移植肾穿刺活检证实为慢性移植肾损伤的患者,血肌酐133-300 μmol/L。②群体反应性抗体(PRA) < 10%。③首次移植,供肾者年龄< 60岁。④Banff2007分级:Ⅰ-Ⅲ度。
排除标准:①病理证实合并急性排斥反应、抗排斥药物毒性反应等其他情况。②乙肝、丙肝病毒感染或携带者。③伴有肺部等其他部位活动性感染。④新发恶性肿瘤。
2011年3月至2013年1月期间经移植肾穿刺活检确诊为慢性移植物肾病患者11例。男7例,女4例;年龄15-62岁,平均(39.2±13.7)岁;移植后时间1-11年,平均(5.4±3.9)年;移植前原发病为慢性肾小球肾炎9例,IgA肾病1例,多囊肾1例;服用他克莫司(FK506) 7例,环孢素4例。均签署骨髓间充质干细胞治疗知情同意书,治疗方案通过医院伦理委员会医疗新技术项目审核。
方法:
骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养:抽取患者自身骨髓50 mL,取其髂前上棘为穿刺点,行骨髓穿刺术,严格按照无菌操作进行,放置于装有低分子肝素钠抗凝溶液的无菌离心管中,充分混匀,并密封。进行骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养、鉴定以及病原体检测,确保骨髓间充质干细胞的细胞活性及无污染。
分离:将收集的骨髓用适量PBS稀释(1∶1),并将稀释液沿管壁小心叠加到预先放有一定体积的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque[密度为(1.077±0.001) g/mL]的离心管中(细胞悬液∶淋巴细胞分离液=3∶2),2 000 r/min离心 20 min。离心完成后,吸取云雾状的单个核细胞层,并再次用PBS洗涤,1 100 r/min离心4 min,弃去上清液,接种。
培养:将分离到的骨髓单个核细胞沉淀后用L-DMEM完全培养液重悬,接种于25 cm2的培养瓶中,加入L-DMEM完全培养液置于37 ℃、体积分数为5%CO2、相对湿度80%的培养箱中,3 d后半量换液,并去除未贴壁的细胞,之后每隔3 d全量换液1次。使用倒置相差显微镜逐日观察细胞的形态、贴壁及生长情况,直至每个克隆中细胞生长到几乎完全融合。
传代与扩增:待克隆中细胞几乎完全融合后,去掉培养液,用PBS洗涤2次,加入0.25%胰酶37 ℃消化,待瓶底细胞有70%-80%变圆时,加入含血清的L-DMEM完全培养液中止消化,并用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散细胞悬液,然后将细胞悬液收集到离心管内,按1∶3传代培养。之后每3 d换液1次,观察细胞的生长情况,待细胞达80%以上融合,再用胰酶进行消化,细胞计数后1 100 r/min离心4 min,弃去上清,继续按1∶3比例传代扩增培养。
冻存:按上述方法将培养的细胞用胰酶消化,用L-DMEM完全培养液终止消化,PBS冲洗培养瓶,离心后弃去上清,加入细胞冻存液,充分混匀,调制细胞浓度为1×109 L-1,移入细胞冻存管,密封,先置于4 ℃ 30 min预冷,并依次置0 ℃、-20 ℃各30 min,再移入-80 ℃低温冰箱放置48 h后,最后移入液氮罐冻存。冻存之前常规行病原学检测。
复苏:从液氮中取出冻存的种子细胞迅速放入37 ℃水浴中解冻,然后转入预置5 mL培养基的离心管中,用移液管缓慢吹打均匀,离心,弃上清液,加入12 mL培养基重新悬浮,接入75 cm2培养瓶中,置于37 ℃,体积分数为5%CO2,80%相对湿度的培养箱中,培养第2天换液,以后每3 d换液1次。
输注前病原学检测:包括①乙肝抗原、抗体。②丙肝抗原、抗体。③梅毒。④HIV。⑤抗结核抗体-IgG。⑥抗巨细胞病毒抗体-IgM。⑦EB抗体。⑧肺炎支原体。⑨细菌及真菌培养。
骨髓间充质干细胞的鉴定:
骨髓间充质干细胞成骨诱导:取生长状态良好的第4代细胞接种于6孔板中,继续培养,待细胞铺面板底的90%以后,弃去上清,加入配置好的成骨诱导液(体积分数为10%胎牛血清的HG-DMEM中加入终浓度分别为10 mmol/L β-甘油磷酸钠+10-8 mol/L地塞米松+50 μmol/L维生素C )。培养2周,每3 d换1次液。
骨髓间充质干细胞成脂诱导:细胞准备与成骨诱导相同,细胞准备完成后加入配置好的成脂诱导液(体积分数为10%胎牛血清的HG-DMEM中加入终浓度分别为0.5 mmol/L 1,3-异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)+10-6 mol/L地塞米松+ 10 mg/L胰岛素+0.2 mmol/L吲哚美辛)。培养2周,每3 d换1次液。
骨髓间充质干细胞表面标记物测定:各取CD45、CD90原始抗原10 μL,PBS稀释至20 μL,分别加入10 μL Zenon荧光素(Alex647、R-PE),避光孵育15 min,然后加入10 μL Zenon阻断剂,孵育15 min,以上操作尽量在避光条件下进行。将准备好的经过消化、离心、漂洗好的细胞,用PBS调节至浓度为2×108 L-1悬浊液,各取100 μL(2×104)分别加入6个流式细胞仪管中,再把上述孵育好的抗原复合物(CD45-Alex647、CD90-R-PE)及本身带有荧光的CD105-FITC分别加入其中1个管中,剩下3个管中各加入100 μL PBS作为阴性对照。室温孵育30 min,离心、漂洗两遍后,上机检测。
骨髓间充质干细胞移植:
第1次输注骨髓间充质干细胞:在数字减影动脉造影引导下经移植肾动脉输注。采用Seldinger法,自对侧或同侧股动脉插入Cobra导管行移植肾动脉造影,明确部位后,插管至移植肾动脉,造影明确,注入骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞的量为5.0×106个[2],用生理盐水稀释至20 mL推注。首次输注骨髓间充质干细胞的同时,不调整神经钙蛋白阻滞剂类免疫抑制剂的用量。
第2次、第3次输注骨髓间充质干细胞:在首次输注后1周、1个月经外周静脉输注,骨髓间充质干细胞的量为1.0×106个/kg[3-6],用生理盐水稀释至50 mL,经静脉注射泵缓慢推注,30 min内完成,输注前静脉推注地塞米松5 mg。
主要观察指标:①骨髓间充质干细胞治疗前、输注后 7 d、输注后1,3,6,12个月检测血肌酐、尿素氮、内生肌酐生成率、胱抑素C、24 h尿蛋白定量、血/尿β2微球蛋白等临床指标。②不良事件:感染、肿瘤、移植肾血管栓塞发生率。
统计学分析:数据用SPSS 16.0软件分析,实验结果计量资料采用x±s表示,采用重复测量资料的多变量分析进行统计学分析。所有的统计方法的检验水准α=0.05。