生物可降解分子印迹聚合物的制备及评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.018

中国组织工程研究

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生物可降解分子印迹聚合物的制备及评价

李曼，朱全红，李敏婷，王文娜，戴娇娇，殷勇冠

南方医科大学中医药学院，广东省广州市 510515

收稿日期:2013-06-27 修回日期:2013-08-17 出版日期:2013-09-17 发布日期:2013-09-17
通讯作者: 朱全红，博士，教授，南方医科大学中医药学院，广东省广州市 510515 zqh@sum.edu.cn
作者简介:李曼★，女，1987年生，河北省安国市人，汉族，2013年南方医科大学毕业，硕士，主要从事生物可降解分子印迹聚合物的制备及评价研究。 liman887@163.com
基金资助:
国家自然科学基金项目(81173566、81102793)**，广州市科技计划项目(12C32121549)*

Preparation and evaluation of biodegradable molecularly imprinted polymers

Li Man, Zhu Quan-hong, Li Min-ting, Wang Wen-na, Dai Jiao-jiao, Yin Yong-guan

School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Received:2013-06-27 Revised:2013-08-17 Online:2013-09-17 Published:2013-09-17
Contact: Zhu Quan-hong, M.D., Professor, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China zqh@sum.edu.cn
About author:Li Man★, Master, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China liman887@163.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81173566*, 81102793*; the Scientific and Technological Plan of Guangzhou City, No. 12C32121549*

摘要/Abstract

摘要：

背景：交联剂是支撑分子印迹聚合物骨架的主要单元，分子印迹聚合物是否生物友好与交联剂的性能密不可分，但目前常用交联剂的生物相容性和生物降解性还不明确。
目的：制备新型生物可降解分子印迹聚合物，分析其吸附性能和可降解性能。
方法：以丙烯酰化的聚ε-己内酯为交联剂，以丙烯酸为功能单体，采用紫外光引发聚合法制备茶碱分子印迹聚合物，通过等温吸附、Scatchard分析和动力学曲线研究其吸附能力，在模拟人体生理环境体系中进行体外降解实验。
结果与结论：等温吸附曲线表明茶碱分子印迹聚合物和非分子印迹聚合物对模板分子茶碱均有吸附能力，但茶碱分子印迹聚合物的吸附量显著高于非分子印迹聚合物。茶碱分子印迹聚合物对茶碱的载药量为1.54%，包封率为12.48%，茶碱分子印迹聚合物和聚ε-己内酯二醇在观察时间内的体外降解率分别为6.60%和1.33%。制备的分子印迹聚合物不仅对目标分子有特异的吸附性能，而且具有良好的生物降解性能，可在模拟人体环境中进行降解。

关键词: 生物材料, 生物材料基础实验, 分子印迹聚合物, 聚ε-己内酯, 生物降解性, 吸附能力, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The cross-linking reagent is the main unit to support the skeleton of molecularly imprinted polymers, which is closely related to the bio-friendly adaption of polymers. The biocompatible and biodegradable capacities of common crosslinking agents are unclear.
OBJECTIVE: To prepare a novel biodegradable molecularly imprinted polymer and to evaluate the adsorption and biodegradability properties of the polymer.
METHODS: The biodegradable molecularly imprinted polymer was synthesized with the acrylated poly ε-caprolactone as the cross-linking reagent under the UV polymerization. The adsorption of the polymer was evaluated by adsorption isotherm, Scatchard analysis and kinetic curves. The biodegradation of the polymer was observed in the simulated physiological environment system in vitro.
RESULTS AND CONCLUSION: Both the molecularly imprinted polymer and non-molecularly imprinted polymer showed an adsorption effect on theophylline, the template. But the adsorption amount of the molecularly imprinted polymer was significantly more than that of the non-molecularly imprinted polymer. The drug loading and encapsulation efficiency of the molecularly imprinted polymer were 1.54% and 12.48%, respectively. The degradation rates of molecularly imprinted polymer and poly(ε-caprolactone) diol were 6.60% and 1.33%, respectively, within the observation time in vitro. The obtained molecularly imprinted polymer not only exhibited specific adsorption to certain molecules but also showed good biodegradable properties in the simulated physiological environment system, which is necessary to be a potent drug carrier.

Key words: biocompatible materials, polymers, biodegradation, environmental, cross-linking reagents

中图分类号:

R318

李曼，朱全红，李敏婷，王文娜，戴娇娇，殷勇冠. 生物可降解分子印迹聚合物的制备及评价[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.018.

Li Man, Zhu Quan-hong, Li Min-ting, Wang Wen-na, Dai Jiao-jiao, Yin Yong-guan. Preparation and evaluation of biodegradable molecularly imprinted polymers[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.018.

图/表（结果） 9

2.1 聚ε-己内酯交联剂分析比较聚己内酯二醇和未经优化制备工艺交联剂的红外光谱图，聚己内酯二醇红外谱图中3 451 cm-1处为末端羟基的特征峰，经过丙烯酰化修饰后，仍然存在；交联剂的红外图谱中1 675 cm-1处为引入丙烯酰氯的C=O的伸缩振动峰，由此可判定对聚己内酯二醇进行修饰后为反应完全，见图1。
根据预实验结果，优化交联剂的制备工艺。聚己内酯二醇(M=2 000) 2 mmol溶于20 mL除水后苯中，常温搅拌的条件下用滴液漏斗加入溶解于3 mL苯中的 6 mmol丙烯酰氯，滴加完成后加入6 mmol三乙胺，升温至80 ℃恒温搅拌3 h。反应完成后过滤，将滤液倒入盛有80 mL正己烷的烧杯中，20 ℃下静置15 h后烧杯底部有白色蜡状的固体沉淀产生，将固体沉淀真空干燥 24 h备用。
对优化合成工艺制备的聚ε-己内酯交联剂进行红外表征，见图2。

由图2可看出，聚己内酯二醇的红外谱图中 3 451 cm-1处末端羟基的特征峰，经过丙烯酰化修饰后几乎消失，反应完全，制备的聚己内酯交联剂为符合要求的目标产物。
2.2 印迹聚合物与非印迹聚合物的结构表征
扫描电镜：制备的印迹聚合物和非印迹聚合物的扫描电镜见图3，标尺分别为200，10 μm。

在所观察倍数下，两类聚合物表面均很光滑、平整，形态无明显差别。分析形成该形貌的原因，印迹水凝胶的组成中主要为聚合物骨架即丙烯酰化的交联剂，约占组成的95%，而模板分子茶碱的印迹空穴、功能单体丙烯酸等与聚己内酯交联剂相比所占比例很少，且分散在由此交联剂聚合而成的大环境中，因此较难观察到。
红外光谱表征：将印迹聚合物、非印迹聚合物及未移除模板分子的聚合物进行红外光谱测定，结果见图4。
由图4可以看出，印迹聚合物与非印迹聚合物的红外光谱非常相似，都含有2 945，2 866 cm-1处的C-H的伸缩振动峰，1 725 cm-1处的C=O的伸缩振动峰， 1 188 cm-1处的-C-O-C-的伸缩振动峰，1 368 cm-1处的-OH弯曲振动峰。这是由于两种聚合物的骨架基本相同，组成聚合物的官能团完全一样，都是由丙烯酰化的聚己内酯二醇为交联剂和丙烯酸为功能单体聚合而成，故两类聚合物的红外光谱未有明显区别。交联剂在聚合物中所占比重大，因此红外谱图显示的吸收峰主要来自交联剂。
此外，在图4A和图4B中，均未看到C=C双键的吸收峰，说明自由基聚合反应进行完全。在未洗脱模板分子的聚合物的红外谱图(图4C)中，除与两类聚合物相同的官能团外，还可以看到1 566 cm-1处的伯胺弯面内吸收峰和1 665 cm-1处碳碳双键的伸缩振动吸收峰，这是因为未洗脱模板分子的聚合物中，不仅含有模板分子，还含有残留的过量的反应原料功能单体及交联剂，因此在图4C中可看到明显的模板分子茶碱的-NH官能团吸收峰，以及功能单体和交联剂上的C=C官能团吸收峰。

洗脱后这些峰都随之消失，说明洗脱过程中聚合物上的模板分子以及反应中残留的过量的功能单体和交联剂清除完全。
2.3 印迹聚合物对模板分子茶碱的等温吸附曲线由图5可见，印迹与非印迹聚合物的吸附量随茶碱浓度的增加而增加，当茶碱浓度为0.06 mmol/L时，印迹聚合物的吸附基本达到平衡。在所观察的浓度范围内印迹聚合物对茶碱的吸附量明显高于非印迹聚合物。

将获得的数据进行Scatchard分析[31-32]：Q/Ce = (Qmax-Q)/Kd，式中，Qmax是结合位点的最大表观结合量(µmol/g)，Ce为上清液中茶碱的浓度(mmol/L)，Kd为结合位点的平衡解离常数(mL/g)，由Q/Ce对Q作图，结果见图6。

由图6可以看出，以Q/Ce对Q作图，通过拟合得到线性关系良好的直线，相关系数为0.990 3，且由图可知直线的斜率和截距，计算得结合位点的平衡解离常数Kd值为0.48 mmol/L及最大表观结合量Qmax值为 25.45 µmol/g。
2.4 印迹聚合物的动力学曲线为进一步研究印迹聚合物的吸附机理，实验对印迹聚合物做了动态吸附实验，考察其对模板分子茶碱的结合速度，并确定吸附达到平衡的时间，结果见图7。

由图7可知，印迹聚合物在吸附初始阶段对茶碱的结合速率较快，吸附量迅速增加，1 h后吸附速率减慢，吸附量增加的趋势变缓慢，到3 h左右达到基本吸附平衡。
2.5 印迹聚合物的特异性吸附采用静态平衡吸附实验，考察印迹聚合物和非印迹聚合物对茶碱、咖啡因的结合能力，结果见图8，9。

由图9可知，印迹聚合物对茶碱的吸附量为 1.27 μmol/g，对咖啡因的吸附量为0.23 μmol/g，约为咖啡因吸附量的5倍。印迹与非印迹聚合物对茶碱的吸附量均高于对咖啡因的吸附量。这是因为印迹聚合物不仅具有识别模板分子茶碱的官能团，能与茶碱发生相互作用，同时还留有模板分子茶碱的孔穴，与茶碱分子空间相匹配，因此对茶碱表现出专一的识别性；而对其结构类似物咖啡因的吸附仅表现为官能团的相互作用，由于空间结构的不匹配，因此吸附量很低。可见印迹聚合物不仅对模板分子茶碱具有良好的吸附性能，而且还对模板分子还表现出特殊的选择性能。
在茶碱印迹聚合物的识别过程中，底物的空间结构及官能团均会影响印迹聚合物对其的吸附。茶碱与咖啡因的化学结构非常相似，都具有嘌呤的母核，仅在取代基上存有微小差别，但印迹聚合物对二者却表现出完全不同的吸附性能。说明印迹聚合物对模板分子茶碱有明显的吸附选择性，这种选择性能不仅与模板分子和功能单体丙烯酸之间形成的氢键、静电作用有关，还与印迹聚合物的印迹空穴的空间匹配性有关，这些都是影响分子之间发生精确识别的重要因素。
2.6 印迹聚合物和聚己内酯二醇的体外降解曲线见图10。
由图10可知在观察时间范围内印迹聚合物的降解率为6.60%，聚己内酯二醇的降解率为1.33%。印迹聚合物的降解率高于聚己内酯二醇是由于物聚合中占绝大部分的聚己内酯交联剂的降解速率高于聚己内酯二醇[33-35]。丙烯酰化的聚己内酯二醇降低了原有物质的结晶度，加快了降解速率。印迹聚合物在观察时间内有良好的生物降解性能。

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引言

分子印迹聚合物是一种对模板分子具有显著识别性能的新型高分子材料，聚合物网络中具有与模板分子在体积和形状上完全匹配的印迹孔穴，因此具有与生物抗体相媲美的分子识别性能，已被广泛应用于分析和分离^[1-3]。近年来分子印迹聚合物因其制备简单、性质稳定、亲和性良好等特点逐渐被应用于人工合成材料^[4-5]，特别是用于药物传递系统中^[6-10]。在体内进行药物传输与传递的载体必须是生物友好型材料。分子印迹的方法十分简单，操作便利，在实际操作过程中需要的原料有功能单体、模板分子、交联剂及溶剂(致孔剂)等。目前制备分子印迹聚合物所用的功能单体、交联剂大多是甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯等，他们的生物相容性和生物降解性还不明确。

分子印迹聚合物是近几年应用到药物传输领域的高分子聚合物，通过模板分子介导生成的聚合物能产生对模板分子具有特定的亲和力、容量和选择性的孔穴。聚合物对模板药物具有的特异性吸附功能识别位点，可减缓药物从聚合物中的释放速度。外界环境的改变可使位点发生变化，使药物从聚合物中释放，而位点的改变是可逆的，环境的逆向变化能使识别位点回到原来的状态，使聚合物恢复对药物的吸附功能，使模板药物重新被摄取到聚合物上；作为药物载体，应用分子印迹技术可使载体对药物达到释放-重吸附的平衡。

目前发现以分子印迹聚合物为基础的药物传输系统主要有以下3种作用^[11]：①对药物的缓释。Nicholls 等^[12]以茶碱为模板分子制备了分子印迹聚合物微球，载药后进行了体外释放动力学研究，结果发现药物在磷酸缓冲液中释放缓慢，载药量以及释药行为与介质的pH值有关，这项研究开创了分子印迹聚合物在给药系统中应用的先河。Piccii小组一直致力于研究分子印迹聚合物在模拟生理环境中的释放行为，研究对象包括磺胺吡啶、5-氟尿嘧啶、甘草酸及抗氧剂α-生育酚、肌醇六磷酸等，制备的分子印迹聚合物不仅亲水性好，载药量大，而且在模拟胃液、肠液及血浆环境中释放缓慢^[13-15]。此外，采用分子印迹聚合物制备的低交联度隐形眼镜、水凝胶隐形眼镜能够克服常规镜片不具载药能力及眼部药物生物利用度低、不能缓释的缺点。国内学者也积极开展了基于分子印迹聚合物的药物载体研究，制备的材料包括分子印迹聚合物纳米球、微球、纳米管等^[16-18]。②对药物对映异构体的选择性释放。因印迹聚合物可特异性识别药物的对映异构体和对消旋体药物，其中的印迹对映体将被吸附在印迹聚合物中，而非印迹对映体因构象与聚合物中结合位点的空间构型不符而释放出来，从而实现药物对映体的立体选择性释放。基于分子印迹聚合物能专一性识别模板分子的认识，Suedee小组以分子印迹聚合物为载体在手性药物的选择性释放方面开展了深入而又细致的研究工作^[19-21]，他们分别制备了以手性药物对映体R-普萘洛尔、S-布洛芬和S-酮洛芬为模板分子的印迹聚合物，用作片剂的辅料以及透皮给药的膜材料，发现制备的分子印迹聚合物不仅载药量大，而且与模板分子构型相同的药物对映体释放速度要明显慢于其对映异构体的释放，表明分子印迹聚合物能选择性释放消旋体药物中与模板分子相同构型的对映体。因制备手性药物的单一对映体较复杂、耗时，所以手性药物制剂对药物对映体的选择性释放受到较大关注^[22]，分子印迹技术为其提供了一种思路。③调控式释放。由于环境的酸度、温度及竞争性结合物的存在等因素均会影响印迹聚合物的药物释放行为，所以可通过改变环境中的这些影响因素，使印迹聚合物与模板药物的作用方式发生改变，从而调控其释药行为^[23]。最近研究发现，分子印迹聚合物释药时对介质的pH值非常敏感。包载奥美拉唑消旋体的分子印迹聚合物纤维膜在选择性释放其S-对映体时呈现出pH依赖的行为^[24]。地塞米松印迹的印迹水凝胶在生理pH值下释放缓慢，但在较低的pH值环境中却相对迅速，用作植入性生物传感器的涂层可有效抑制机体植入异物产生的炎症反应^[25]。

分子印迹聚合物在递药系统中的出色表现来自其固有的结构特点，以药物为模板分子制备的印迹聚合物在其表面留有药物分子的“印迹”空穴，因此对模板药物表现出高度的亲和力及特殊的吸附性能。这种吸附不同于以往简单的物理混合或难解离的共价键键接，它是通过非共价键的超分子作用，如分子间氢键、π-π作用、静电作用等维系，药物不易泄露、突释；进入体内后受机体极性环境的影响，非共价键逐渐断裂，药物持续缓慢释放出来；当这种非共价键作用是以氢键、静电作用等主导时，在酸性介质中由于质子性溶剂会与药物竞争印迹聚合物上的吸附位点，不难理解包载在印迹聚合物上的药物会随介质pH值的降低释放加快。

生物可降解聚合物是指在生物体内能被降解或酶解，生成小分子物质能够被机体吸收并排出体外的一类高分子材料，将此类聚合物作为药物载体时释药时程可持续几天甚至几年。理想的生物且可降解材料一般应满足4个基本条件：有良好的生物降解性，药物的释放速率与载体材料的降解时间可调节；药物释放满足零级释放，突释现象不明显，释药过程安全性高；有良好的生物相容性，无毒，不致畸，降解产物对机体细胞无毒害作用，无不良反应和突变反应，降解产物不在体内累积可排出体外；制备工艺简单，成本低，对环境无污染。近十年来，生物可降解聚合物作为缓控释、靶向给药系统的载体研究使得欧美国家和日本的药物释放系统向商业化发展。已研究开发的生物降解聚合物主要有天然高分子、微生物合成高分子和人工合成高分子3大类。目前只有聚酯类聚合物是目前惟一被被美国FDA批准可用于生物医学领域的生物可降解材料。聚ε-己内酯属于脂肪族聚酯类，这些聚酯的主链大都是由脂肪族结构单元，通过易水解的酯键连接而成，容易被自然界中的多种微生物或动植物体内酶分解代谢，有良好的生物相容和生物降解性^[26-28]。

水凝胶定义为当水或者是其他生物体液在溶胀的同时能够保持大量液体，同时又不能被上述液体溶解，在空间结构上具有三维网状结构的一类交联高分子聚合物的统称^[29-30]。水凝胶能够感应外界的刺激，如光、温度、pH值、介质、离子强度、磁场等，并对这些变化或刺激作出不同程度的反应。研究中发现这类化合物具有良好的物理化学性质和生物学性质，化学结构上含有羟基、氨基、醚键等亲水基团，物理结构上具有三维的聚合网络结构，当外界环境变化时可溶胀或收缩。

另外水凝胶在生物相容和生物降解方面有突出的应用前景，已经有研究者利用水凝胶实现了新型药物在人体内的缓释、控释和触发式释放，提高了药效。实验以丙烯酰化的聚己内酯为交联剂，以丙烯酸为功能单体，在紫外光引发下制备茶碱分子印迹水凝胶聚合物，并对其吸附性能、体外降解性能等进行评价。

材料方法

设计：样本观察实验。

时间及地点：实验于2011年9月至2013年2月在南方医科大学中医药学院完成。

材料：

生物可降解分子印迹聚合物制备及评价实验的材料：

实验方法：

茶碱印迹聚合物的制备：

丙烯酰化聚ε-己内酯交联剂的制备：将聚ε-己内酯二醇4.0 g溶于40 mL苯中，加入4.5 mmol丙烯酰氯和4.5 mmol三乙胺，80 ℃搅拌3 h。反应完成后过滤，将滤液倒入盛有150 mL正己烷的烧杯中，20 ℃下静置15 h后烧杯底部有白色蜡状的固体沉淀产生，将固体沉淀真空干燥24 h并进行IR表征。

丙烯酰化聚ε-己内酯交联剂的制备工艺优化：对聚ε-己内酯二醇进行丙烯酰化的过程中，丙烯酰氯的用量和滴加方法、反应温度、反应体系是否无水都会影响聚ε-己内酯二醇的丙烯酰化程度。丙烯酰氯性质活泼，为保证其能充分参加反应，滴加前需溶于少量已除水的苯中，用分液漏斗缓慢滴加到反应溶液中。

茶碱印迹聚合物的制备：茶碱是一种有效的抗哮喘类药物，能松弛支气管平滑肌，主要用于支气管性与心源性哮喘。从化学结构上看，茶碱具有1, 3-二甲基黄嘌呤的结构，呈弱碱性。因此选择酸性功能单体丙烯酸，通过与茶碱分子间的氢键及静电作用预聚合形成复合物，进而发生自由基聚合反应。将0.2 mmol茶碱溶于 15 mL氯仿中，加入功能单体丙烯酸0.8 mmol，室温下静置30 min，使模板分子与功能单体充分作用。加入交联剂丙烯酰化的聚己内酯二醇1.5 mmol和引发剂 0.5 mmol，引发剂由0.1 g安息香双甲醚溶于1 mL N-乙烯基吡咯烷酮中制得。混合溶液在低强度波长为366 nm的紫外光下照射1 h，即得凝胶状的聚合物。将聚合物用200 mL的氯仿-冰醋酸(9∶1，体积比)溶液连续抽提，直至洗脱液中检测不到模板分子茶碱，再用氯仿洗去冰醋酸，于40 ℃真空干燥24 h，即得茶碱分子印迹聚合物。空白印迹聚合物的制备除不加入模板分子茶碱外，过程同上。

茶碱印迹聚合物的吸附性能评价：

茶碱在氯仿溶液中标准曲线的制定：精密称取茶碱5 mg，溶于50 mL氯仿中，配成质量浓度为0.1 g/L的茶碱对照品溶液。用移液管分别移取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL对照品溶液并稀释至10 mL容量瓶中，配成系列浓度的标准溶液，平行操作3次。测其275 nm处各个吸光度值(A)，并与溶液质量浓度(W)做标准曲线为： W=18.961A+0.119 2，r=0.999 9。

平衡吸附实验：精密称取印迹和非印迹聚合物 20 mg各6份，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入到不同浓度的10 mL茶碱氯仿溶液中，室温下振荡4 h后，过滤取上清液，用紫外-可见分光光度计于275 nm处测定上清液中游离茶碱的浓度，根据吸附前后底物浓度的变化，计算印迹聚合物的吸附量Q(µmol/g)，绘制等温吸附曲线。

结合动力学实验：精密称取印迹聚合物20 mg，加入10 mL 10 mg/L的茶碱氯仿溶液，室温下振荡吸附不同时间后，过滤取上清液测定其中游离茶碱的浓度，计算吸附量Q(µmol/g)，绘制吸附量(Q)-时间关系(T)关系曲线。

茶碱印迹聚合物的载药实验：

释放介质的配制：模拟人体环境，选用PBS(pH值7.4)作为释放介质。参照《中华人民共和国药典》2005年版配制。取磷酸二氢钾1.36 g，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液79 mL，用水稀释至200 mL即得。

茶碱在PBS中标准曲线的绘制：精密称取茶碱 5 mg，溶于50 mL PBS中，摇匀，得0.1 g/L的茶碱对照品溶液。将对照品溶液用PBS稀释成系列标准溶液，平行操作3次。测其275 nm处吸光度值并做质量浓度的标准曲线为：A=18.068W-0.099 2，r=0.999 7。

载药印迹聚合物的制备：称取印迹聚合物20 mg，置于50 mL具塞锥形瓶中，然后加入50 mL 10 mg/L茶碱氯仿溶液，室温下振荡4 h，过滤，将聚合物于40 ℃真空干燥24 h，即得载药印迹聚合物，同时测定上清液中茶碱的含量，计算得载药量为1.54%，包封率为12.48%。

体外降解实验：精密称取印迹聚合物0.300 5 g和聚己内酯二醇0.300 1 g，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL PBS，恒温37 ℃下放置，每隔一定时间间隔测定质量减少量，以每次测得的质量减少量百分率对时间作图，比较印迹聚合物与聚己内酯二醇的降解百分率。

主要观察指标：分子印迹聚合物的吸附性能和可降解性能。

生物可降解分子印迹聚合物的制备及评价

Preparation and evaluation of biodegradable molecularly imprinted polymers

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