模拟体液浸泡法评价柠檬酸钙的生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.017

中国组织工程研究

• 生物材料基础实验 basic experiments of biomaterials • 上一篇下一篇

模拟体液浸泡法评价柠檬酸钙的生物学特性

丁秀明¹，彭磊^{2, 3}，文峰¹，谭昭伟⁴，牟忠林^{2, 4}

¹海南大学，海南省海口市 570228；²海南省人民医院，海南省海口市 570311；³海南医学院附属医院创伤中心，海南省海口市 570206；⁴海南医学院，海南省海口市 571101

收稿日期:2013-03-28 修回日期:2013-05-11 出版日期:2013-09-17 发布日期:2013-09-17
通讯作者: 牟忠林，教授，主任医师，海南医学院，海南省海口市 571101；海南省人民医院，海南省海口市 570311
作者简介:丁秀明★，女，1987年生，河北省唐山市人，汉族，海南大学材料与化工学院在读硕士，主要从事生物骨材料研究。 38011426@qq.com

Simulated body fluid immersion method for assessing biological characteristics of calcium citrate

Ding Xiu-ming¹, Peng Lei^{2, 3}, Wen Feng¹, Tan Zhao-wei⁴, Mu Zhong-lin^{2, 4}

1University of Hainan, Haikou 570228, Hainan Province, China; 2the People’s Hospital of Hainan Province, Haikou 570311, Hainan Province, China; 3Trauma Center of the Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570206, Hainan Province, China; 4Hainan Medical University, Haikou 571101, Hainan Province, China

Received:2013-03-28 Revised:2013-05-11 Online:2013-09-17 Published:2013-09-17
Contact: Mu Zhong-lin, Professor, Chief physician, Hainan Medical University, Haikou 571101, Hainan Province, China; the People’s Hospital of Hainan Province, Haikou 570311, Hainan Province, Chinae
About author:Ding Xiu-ming★, Studying for master’s degree, University of Hainan, Haikou 570228, Hainan Province, China 38011426@qq.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：柠檬酸钙本身的溶解性能优于磷酸钙、硫酸钙等其他钙生物材料，并且合成的柠檬酸钙致密性良好，在降解过程中可高效平稳释放钙离子，所以更适合用于骨折缺损的填充，为骨折愈合初期提供所需要的钙离子。
目的：将天然生物矿化牡蛎壳和柠檬酸反应生成生物型柠檬酸钙生物材料，以期望在骨折愈合修复方面得到良好的应用。
方法：通过球磨机粉碎天然生物矿化的牡蛎壳，再经研磨制备成适合粒径的牡蛎壳粉，与柠檬酸反应得到生物型柠檬酸钙，再经研磨，过筛，得到适宜大小的柠檬酸钙颗粒。应用X射线和FT-IR光谱研究材料的结构和组分，扫描电子显微镜观察材料的表面形态，模拟体液实验评价其生物特性。
结果与结论：牡蛎壳粉末与饱和柠檬酸发生化学反应，转化生成了柠檬酸钙材料，并且晶体结构排列有序，形态紧密，晶体之间结合紧凑，具有一定的力学性能，这种结构也有利于延长材料的降解时间，平稳释放钙离子。柠檬酸钙在降解吸收过程中并未明显改变体液的pH值，整个pH值波动于7.20-7.46之间，对人体细胞的刺激性小。随着柠檬酸钙材料的逐渐降解，溶液中Ca2+浓度逐渐增大，且释放相对平缓，最终达到适宜成骨细胞增殖分化所需的胞外钙浓度，逐步稳定在7 mmol/L左右。表明以天然牡蛎壳为原料制备的柠檬酸钙具有优良的生物特性，作为人工骨材料具有天然的优越性。

关键词: 生物材料, 生物材料基础实验, 柠檬酸钙, 牡蛎壳, 性能评价, 生物特性, 模拟体液实验

Abstract:

BACKGROUND: Calcium citrate has a better solubility than calcium phosphate, calcium sulfate, and other calcium biomaterials. The synthetic calcium citrate has a good denseness, and stably releases calcium ions at a high efficiency during the degradation. Consequently, it may be more suitable for the filling of fracture defects, providing needed calcium ions for early fracture healing.
OBJECTIVE: To prepare calcium citrate biomaterials with a novel formulation based on the natural bio-mineralized oyster shells and citric acid so as to expect to get a good application in fracture healing repair.
METHODS: Crushing, grinding, and chemical reaction methods were used for refinement. Particle size analyzer, X-ray diffraction, scanning electron microscope, and Fourier transform infrared spectroscopy were adopted for analysis of the size distribution, composition, mineral phases, and micro-morphology. Biological characteristics were evaluated through a simulated body fluid experiment.
RESULTS AND CONCLUSION: Oyster shell powder was reacted with saturated citric acid to produce the calcium citrate material that had uniform crystal structure and compact bonding among crystal bodies, and exhibited a certain mechanical ability. The calcium citrate material had a good crystal structure that was conductive to prolong the degradation time. The calcium citrate released calcium ions slowly, and did not produce dramatic changes in the pH value (7.20-7.46) of the surrounding in the dissolution process. With the gradual degradation of calcium citrate materials, Ca2+ concentration in solution increased gradually and stably, and ultimately achieved an appropriate concentration of 7 mmol/L, suitable for osteoblast proliferation and differentiation. Calcium citrate prepared using natural oyster shell has good biological properties, and exhibits a natural superiority to artificial bone materials.

Key words: calcium citrate, tissue engineering, biology, fractures

中图分类号:

R318

丁秀明，彭磊，文峰，谭昭伟，牟忠林. 模拟体液浸泡法评价柠檬酸钙的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.017.

Ding Xiu-ming, Peng Lei, Wen Feng, Tan Zhao-wei, Mu Zhong-lin. Simulated body fluid immersion method for assessing biological characteristics of calcium citrate[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.017.

图/表（结果） 5

2.1 柠檬酸钙的红外与X射线衍射分析结果柠檬酸含有3个羧基的有机酸，其红外光谱的特征峰νO-H 3 496.4 cm-1，νC-H 3 297.7 cm-1，νC=O 1 700.9 cm-1，νC-C 1 178.3 cm-1，δO-H(面外)775.3 cm-1 ，与图1中的特征吸收峰3 496 cm-1、3 320 cm-1、1 683 cm-1、 1 142 cm-1、779 cm-1比较吻合，只是有一些偏移； 1 683 cm-1是COO-的伸缩振动吸收峰，与柠檬酸的羰基峰1 700.9 cm-1比较，柠檬酸钙的C=O峰向低波数移动，说明羧酸跟与钙离子形成了配位键，反应物柠檬酸转化为产物柠檬酸钙，得到了实验的产物。

图2表示产物柠檬酸钙的X射线衍射图谱，图谱与标准PDF图谱进行比对，相关峰的峰位与柠檬酸钙水合物的峰的峰位相同，证实已得到柠檬酸钙晶体。

2.2 柠檬酸钙扫描电镜分析图3为样品的扫描电镜图片，牡蛎壳粉与柠檬酸钙反应后，生成大小均一的片状柠檬酸钙结晶体，片状柠檬酸钙晶体相互簇拥，小颗粒通过表面彼此相互结合，形成排列有序结构，晶体间结合紧密。

均一、有序，紧密的特殊微观结构决定了海洋型柠檬酸钙有利于提高材料本身的力学强度，具有耐压性，同时这种结构也有利于延长材料的降解时间，使钙离子能够平稳的释放。
2.3 柠檬酸钙降解过程中的pH值测定和Ca2+释放柠檬酸钙在模拟体液中37 ℃恒温保存过程中的pH-时间曲线，见图4。

柠檬酸钙在降解吸收过程中并不明显改变体液的pH值，整个pH值波动于7.20-7.40之间，对人体细胞的刺激性小。生物材料在植入人体后引起体液pH值变化的研究在临床应用中有重要意义，过高或过低的pH值都有可能引起人体内细胞碱或酸中毒，造成对生物体局部环境的影响。
柠檬酸钙在模拟体液中37 ℃恒温保存过程中的Ca2+释放曲线，见图5：随着柠檬酸钙骨修复材料的逐渐降解，溶液中Ca2+浓度逐渐增大，且释放相对平缓，最终达到适宜成骨细胞增殖分化所需的胞外钙浓度，逐步稳定在7 mmol/L左右。

参考文献

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引言

各种创伤及慢性疾病如骨质疏松症等使骨折的发生率显著增加，如何使骨折更好更快地愈合已成为骨科医生研究的热点问题之一。钙是骨组织的主要矿物质之一，人体中99%的钙存在骨骼中，只有1%在细胞外液中循环。Maeno等^[1]报道高钙对成骨细胞有促进增殖作用。为使骨折较快愈合及增加骨折愈合率，钙已成为骨折患者的必补营养元素之一，临床医生也有普遍应用钙剂的传统。但据研究发现，骨折早期沉积在骨痂中的钙主要来自于骨组织处，而不是饮食摄取；在骨折愈合的晚期阶段，饮食中的钙则成为主要来源^[2-3]。这就需要在骨折早期愈合处填充骨移植生物材料，向骨组织处释放提供愈合所需要的钙离子。骨移植材料-羟基磷灰石、磷酸三钙、磷酸一氢钙及可注射性磷酸钙、磷酸钙骨水泥等存在着吸收困难、降解性差、长期疗效不明等缺陷^[4-7]，这就需要从新视觉及新材料出发研究新的生物材料，为进一步治疗提供新的思路和方法。

2004年，Science杂志报道并证实牡蛎壳的形成与人体内骨盐的形成具有统一性^[8-11]，骨和珍珠层在生物矿化结构上有很高的一致性，二者的钙化结构共享一种机制-通过特化的细胞分泌无机盐，堆积形成矿物质盐。薛思兴等^[12]研究证实牡蛎壳具有良好的生物相容性，同时有研究证实牡蛎壳不会抑制骨髓基质干细胞的生长^[13]。薛恩兴等^[14]评价牡蛎壳材料填充兔骨缺损的生物相容性、降解性及成骨能力，实验将牡蛎壳用机械方法碾碎致牡蛎壳粉末，建立牡蛎壳材料修复兔股骨下段骨缺损动物模型，应用组织学、影像学、大体观察研究该材料的生物相容性、降解能力及成骨能力。结果显示，术后组织无明显排斥反应，8周牡蛎壳材料开始降解，16周材料基本降解，24周材料完全降解，表明牡蛎壳材料具有良好的生物相容性，在体内可以发生生物降解，能促进骨修复，成骨方式为传导成骨，呈内向性。李振威等^[15]研究活性牡蛎壳天然纳米体复合型骨材料作为骨缺损修复材料的可行性，实验研制人工骨材料，并用扫描电镜观察其结构，把研制的牡蛎壳复合型骨材料、医用硫酸钙骨材料和自体骨植入人工形成的兔桡骨缺损区域内进行体内生物相容性实验，通过对实验侧和对照侧进行大体标本X射线片观察和组织学的检测，观察新骨形成、骨愈合、生物相容性等情况，评价该材料的骨缺损修复能力。结果显示，天然牡蛎壳纳米体复合型骨材料多孔支架的孔径、孔隙率和抗压强度分别为200- 400 μm、40%-50%、45-49 MPa。在2，4，8，12周进行组织学检查及X射线检查骨缺损修复程度，实验组优于医用硫酸钙组，生物力学测试显示术后12周实验组与自体骨比较抗弯曲强度无明显差别，表明天然牡蛎壳纳米体复合型骨材料相对医用硫酸钙有着更好的生物学特性、骨诱导性、成骨能力，并能更持久的提供支架作用修复骨缺损，在骨组织修复材料方面有应用前景。

柠檬酸钙具有早期促进骨折愈合的活性^[16]，同时柠檬酸钙较其他骨修复材料的溶解性大，有较好的吸收性，并已作为一种补钙剂被广泛应用。王伟等^[17]研究柠檬酸钙与骨形态发生蛋白2复合后成骨的作用，实验取2月龄雄性昆明小鼠15只，通过体外实验获取柠檬酸钙与骨形态发生蛋白2最佳比例，在体外将10 mg柠檬酸钙与2 mg骨形态发生蛋白2复合后植入小鼠股部肌肉上中，行肌袋实验，以柠檬酸钙与骨形态发生蛋白2复合物为实验组，单独骨形态发生蛋白2为对照组，术后2，4，6周取材进行大体标本观察与组织学观察，计算新骨形成面积比及新生骨密度比。结果显示，大体标本观察与组织学观察示实验组成骨明显高于对照组，成骨面积较对照组明显增多，2，4，6周时比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；2，4，6周时骨密度测量实验组较对照组高，差异均有显著性意义(P < 0.05)；实验组骨质2周时出现骨小梁结构，成熟度高，成骨细胞数量多，分化明显，成骨密度高；4周时骨的成熟度增高，更多粉红色骨质形成，骨质基本成熟，骨小梁增粗增大，出现大面积成骨区域；6周时血管化及骨髓腔形成充分，骨质密度高，结果表明柠檬酸钙与骨形态发生蛋白2复合后具有良好的诱导成骨作用，可促进骨形成，是一种较理想的载体材料，可作为一种新型复合人工骨修复骨缺损。所以将天然牡蛎壳转化成柠檬酸钙材料，可结合二者的优势，极有可能成为最佳的骨折愈合修复材料促进剂。

中国现有的海洋贝壳(牡蛎壳等)多数被作为废弃物堆放，对生态环境存在着资源浪费和产生二次污染的问题，充分利用海洋生物材料、环境材料、生物制造技术将中国沿海来源广泛的海洋资源优势转变新型环保型骨修复材料，具有重要的现实意义。实验使用过饱和的柠檬酸和少量粉碎颗粒状牡蛎壳反应，生成生物型柠檬酸钙生物材料，采用模拟体液浸泡法评价新型柠檬酸钙材料的生物特性。

材料方法

讨论

有研究证实当细胞外钙离子浓度在5 mmol/L时，促成骨细胞的增殖作用最强，6-8 mmol/L可促进成骨细胞在二维、三维支架上的分化，5 mmol/L的钙离子既有利于成骨细胞增殖又有利于其分化^[1]。在骨折愈合过程中局部微环境是不断变化的，促使局部钙离子浓度的变化，游离钙与结合钙的比率也随着骨折的愈合进程而呈现一定的变化规律，并且细胞外钙离子通过钙离子通道对成骨细胞的增殖和分化起主要作用。硫酸钙、碳酸钙及磷酸钙等存在降解慢，吸收慢等缺陷，影响钙离子的释放浓度及释放效率，所以这会影响骨折早期愈合过程。

柠檬酸钙本身的溶解性能要优于磷酸钙、硫酸钙等其他钙生物材料，且合成的柠檬酸钙体外降解实验表明，钙离子释放浓度为5 mmol/L以上，并且由于材料本身致密性良好，在降解过程中钙离子是缓慢释放到外环境中，高效平稳释放钙离子。柠檬酸钙与其他生物材料相比，被吸收的更快，钙离子被释放到更高的水平^[16]，所以更适合用于骨折处的填充，在骨折愈合初期为患处提供所需要的钙离子；同时柠檬酸钙作为一种优良的生物医学材料已被证实。研究证实，柠檬酸钙植入体内后，在早期断裂治疗中，柠檬酸钙诱导兔股骨骨髓形成骨，从而证实柠檬酸钙可增加原位成骨细胞的分化和增殖，增加骨形成。柠檬酸钙植入大鼠肌袋实验中，局部组织钙浓度在4.1 mmol/L，血浆钙离子浓度在生理水平，同时植入实验证实早期可以促进局部骨生成，新生骨软骨数量也明显增多^[17]。通过模拟体液浸泡后，液体的pH值在7.2-7.4之间，未引起剧烈的变化，而硫酸钙骨修复材料植入后会使局部pH变小，产生微酸性，引起相应炎症反应，所以相较于硫酸钙而言，柠檬酸钙引起炎症反应的概率更小。同时，柠檬酸根阴离子在骨磷灰石的形成和降解中也起到了重要作用，柠檬酸根吸附在磷灰石、八磷酸钙和磷酸二氢钙的表面^[21-24]，通过核磁共振技术能清楚识别出柠檬酸根的信号，并显示出被束缚柠檬酸根占骨有机成分的5.5%^[25]，柠檬酸钙有更高的生物相容性。

牡蛎壳作为新的骨替代材料原料，目前已有诸多研究，并已证实牡蛎壳类碳酸钙多孔材料能够早期修复骨缺损，同时柠檬酸钙本身具有早期促进骨愈合的活性，因此由牡蛎壳转化的柠檬酸钙材料同样具有该全新的特性。例如有研究观察牡蛎壳/消旋聚乳酸复合人工骨修复兔桡骨节段性骨缺损的成骨能力，同时观察其在体内的生物相容性、降解情况，并评价其性能。实验应用热致相分离法分别制得牡蛎壳/消旋聚乳酸复合人工骨及纯消旋聚乳酸多孔材料，将27只成年新西兰白兔随机分成3组，制作1.2 cm的双侧桡骨干缺损并植入上述两种材料，设立不植入任何材料的空白对照组，观察材料植入后动物的局部及全身反应，于术后6，12，18周分别取材，作X射线、大体标本及组织形态学观察，同时观察术后不同时期的组织反应、材料的降解、骨缺损的修复情况。结果显示牡蛎壳/消旋聚乳酸复合人工骨及纯消旋聚乳酸植入动物体内无明显的局部不良反应，且牡蛎壳/消旋聚乳酸复合人工骨材料修复骨缺损的能力明显强于纯消旋聚乳酸及空白对照组(P < 0.05)；术后18周时，植入牡蛎壳/消旋聚乳酸复合人工骨材料的骨缺损基本修复，牡蛎壳/消旋聚乳酸复合人工骨与宿主骨结合紧密；植入纯消旋聚乳酸材料的骨缺损部分修复；空白对照组则骨缺损断端只有少量骨生成，形成骨不连；同时牡蛎壳/消旋聚乳酸复合人工骨材料植入后在6，12周分别可见吞噬有材料的巨噬细胞和多核巨细胞，18周时仍有部分复合材料未降解吸收，证明牡蛎壳/消旋聚乳酸复合人工骨材料具备良好的生物相容性及骨缺损修复能力，是一种良好的骨组织工程修复材料。以天然海洋生物碳酸钙多孔材料和由此转化的柠檬酸钙作为促进骨愈合的活性材料，在骨缺损和骨折中局部应用，分别对症下药，对解决临床骨修复材料严重不足的难题，促进骨折早期愈合具有重要的现实意义。例如王伟等^[17]研究柠檬酸钙与骨形态发生蛋白2复合后成骨的作用。实验取2月龄雄性昆明小鼠15只，通过体外实验获取柠檬酸钙与骨形态发生蛋白2最佳比例，在体外将10 mg柠檬酸钙与2 mg骨形态发生蛋白2复合后，植入小鼠股部肌肉上中，行肌袋实验。以柠檬酸钙与骨形态发生蛋白2复合物为实验组，单独骨形态发生蛋白2为对照组，术后2，4，6周取材进行大体标本观察与组织学观察，计算新骨形成面积比及新生骨密度比。大体标本观察与组织学观察结果示实验组成骨明显高于对照组，成骨面积较对照组明显增多，2，4，6周时比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；2，4，6周时骨密度测量实验组较对照组高，差异均有显著性意义(P < 0.05)。实验组骨质2周时出现骨小梁结构，成熟度高，成骨细胞数量多，分化明显，成骨密度高；4周时骨的成熟度增高，更多粉红色骨质形成，骨质基本成熟，骨小梁增粗增大，出现大面积成骨区域；6周时血管化及骨髓腔形成充分，骨质密度高，证明柠檬酸钙与骨形态发生蛋白2复合后具有良好的诱导成骨作用，可促进骨形成，是一种较理想的载体材料，可作为一种新型复合人工骨修复骨缺损。有研究以僧帽牡蛎壳粉末为原料，通过水热反应合成纳米羟基磷灰石，考察反应时间、反应温度、反应物摩尔比及牡蛎壳粉末的微结构对反应的影响，运用X射线衍射、扫描电子显微镜、红外光谱、X射线能谱仪及MTT实验表征产物的晶相组成、形貌、化学组成及细胞相容性。结果显示，牡蛎壳粉末经水热反应后仍保持其原有形貌，产物为部分CO₃^2-取代的片状纳米羟基磷灰石，其Ca/P摩尔比约为1.5，其结构及组成与人骨羟基磷灰石相似，细胞相容性良好；牡蛎壳粉末外表面方解石通过溶解重结晶过程转化为片状纳米羟基磷灰石，内部方解石则经由固态局部规整离子交换反应转化为纳米羟基磷灰石，最佳水热反应条件为220 ℃下反应6 h，牡蛎壳中Ca与(NH₄)₂HPO₄中P摩尔比为5∶6。有研究以僧帽牡蛎壳粉末为原料，通过水热反应合成纳米羟基磷灰石，考察反应时间、反应温度、反应物摩尔比及牡蛎壳粉末的微结构对反应的影响，运用X射线衍射、扫描电子显微镜、红外光谱、X射线能谱仪及MTT实验表征产物的晶相组成、形貌、化学组成及细胞相容性。结果显示，牡蛎壳粉末经水热反应后仍保持其原有形貌，产物为部分CO₃^2-取代的片状纳米羟基磷灰石，其Ca/P摩尔比约为1.5，其结构及组成与人骨羟基磷灰石相似，细胞相容性良好；牡蛎壳粉末外表面方解石通过溶解重结晶过程转化为片状纳米羟基磷灰石,内部方解石则经由固态局部规整离子交换反应转化为纳米羟基磷灰石，最佳水热反应条件为220 ℃下反应6 h，牡蛎壳中Ca与(NH₄)₂HPO₄中P摩尔比为5∶6。

实验以天然牡蛎壳为原料制备柠檬酸钙，取材广泛、方法简单、容易操作，作为人工骨材料具有天然的优越性。新型海洋型柠檬酸钙的生物相容性、骨诱导行及骨传导性有待进一步体内动物实验的证实。

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