纳米磁珠法与试剂盒法分析载脂蛋白E基因的多态性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.016

中国组织工程研究

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纳米磁珠法与试剂盒法分析载脂蛋白E基因的多态性

吴婷，易黎，黄莹，吴军

北京大学深圳医院神经内科，广东省深圳市 518036

收稿日期:2013-01-15 修回日期:2013-01-21 出版日期:2013-09-17 发布日期:2013-09-17
通讯作者: 易黎，副教授，主任医师，北京大学深圳医院神经内科，广东省深圳市 518036 yilitj@hotmail.com
作者简介:吴婷★，女，1985年生，广东省丰顺县人，汉族，北京大学医学部在读硕士，主要从事脑血管病的基础研究与阿尔茨海默病的早期诊断研究。 wuting405@sina.com
基金资助:
深圳市科技工贸和信息化委员会资助项目(201002063、JC201105180757A)**

Magnetic nanoparticles versus a commercial kit for apolipoprotein E gene polymorphism analysis

Wu Ting, Yi Li, Huang Ying, Wu Jun

Department of Neurology, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China

Received:2013-01-15 Revised:2013-01-21 Online:2013-09-17 Published:2013-09-17
Contact: Yi Li, Associate professor, Chief physician, Department of Neurology, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China yilitj@hotmail.com
About author:Wu Ting★, Studying for master’s degree, Department of Neurology, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China
Supported by:
Economy, Trade and Information Commission of Shenzhen Municipality, No. 201002063*, JC201105180757A*

摘要/Abstract

摘要：

背景：相对于血液标本，口腔拭子标本更利于大规模载脂蛋白E基因多态性分析的研究，但目前对口腔拭子标本基因组DNA的提取尚无统一方法。
目的：探索合适的口腔拭子标本基因组提取方法以分析载脂蛋白E基因的多态性。
方法：收集50例散发性阿尔茨海默病患者口腔拭子标本，每份标本分别应用纳米磁珠法与PicoDNA微量核酸提取试剂盒法提取基因组DNA，对比分析两种方法获得的基因组DNA纯度和浓度，后续进行PCR反应，应用DNA电泳确认有无成功扩增出目的条带，通过DNA测序方法分析载脂蛋白E基因的多态性。
结果与结论：两种方法提取的基因组DNA纯度均较好，纳米磁珠法提取的基因组DNA浓度要高于PcioDNA微量核酸提取试剂盒法所得浓度(P < 0.05)。两组获取的基因组DNA均可成功进行PCR扩增，但电泳结果示纳米磁珠法扩增的目的条带更清楚。两组PCR产物DNA测序结果一致，载脂蛋白E基因ε2、ε3、ε4基因型的比例分别是6%，71%，23%。表明纳米磁珠法相对于PcioDNA微量核酸提取试剂盒法提取口腔拭子标本基因组DNA更适合用于大样本载脂蛋白E基因多态性的研究。

关键词: 生物材料, 纳米生物材料, 载脂蛋白E基因, 散发性阿尔茨海默病, 基因组DNA, 纳米磁珠, 口腔拭子, 基因型, DNA测序

Abstract:

BACKGROUND: Relative to blood samples, mouth swab samples are more beneficial for apolipoprotein E gene polymorphism analysis among large cohorts. However, agreement has not yet been reached about how to extract genomic DNA form mouth swab samples.
OBJECTIVE: To develop an appropriate method to extract genomic DNA form mouth swab samples, which are suitable for apolipoprotein E gene polymorphism analysis.
METHODS: Fifty mouth swab samples from patients with sporadic Alzheimer’s disease were collected. Magnetic nanoparticles and PicoDNA trace nucleic acid extraction kit were used to extract genomic DNA form mouth swab samples. And the purity and concentration of the genomic DNA extracted by the two methods were analyzed. Then PCR amplifications and DNA electrophoresis were performed to confirm whether the genomic DNA was able to amplify desired DNA fragments. DNA sequencing was applied to analyze apolipoprotein E gene polymorphisms.
RESULTS AND CONCLUSION: Genomic DNA extracted by the two methods was of high purity. The concentration of genomic DNA extracted by magnetic nanoparticles was higher than by PicoDNA trace nucleic acid extraction kit, and the difference had statistical significance (P < 0.05). All the genomic DNA were able to performed PCR amplifications to obtain desired PCR products, but results of DNA electrophoresis showed that DNA fragments were more clear by nanoparticles method. The results of DNA sequencing were the same by the
two methods. The distribution of ε2, ε3, ε4 genotypes of apolipoprotein E gene was 6%, 71%, 23%, respectively. Magnetic nanoparticles were better than PicoDNA trace nucleic acid extraction kit for extracting genomic DNA form mouth swab samples for apolipoprotein E gene polymorphism analysis.

Key words: genes, nanoparticles, apolipoproteins E, Alzheimer disease

中图分类号:

R318

吴婷，易黎，黄莹，吴军. 纳米磁珠法与试剂盒法分析载脂蛋白E基因的多态性[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.016.

Wu Ting, Yi Li, Huang Ying, Wu Jun. Magnetic nanoparticles versus a commercial kit for apolipoprotein E gene polymorphism analysis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.016.

图/表（结果） 4

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引言

载脂蛋白E基因位于染色体19q13.2，有4个外显子和3个内含子，一共有3 597个碱基对^[1]。载脂蛋白E基因编码载脂蛋白E，它是由299个氨基酸组成的相对分子质量为34 200的脂质转运蛋白，富含精氨酸。载脂蛋白E在各种器官和不同类型细胞中对于胆固醇和三酰甘油的代谢具有重要作用，另外有研究认为载脂蛋白E在中枢神经系统中还具有参与脂质代谢外的作用。

载脂蛋白E 基因有两个重要的单核苷酸多态性位点rs429358 和 rs7412。载脂蛋白E基因常见的基因型是ε2(rs429358 T/rs7412 T)、ε3(rs429358 T/rs7412 C)、ε4(rs429358 C/rs7412 C)，分别编码载脂蛋白E 2、载脂蛋白E3、载脂蛋白E4^[2-3]。载脂蛋白E氨基酸序列的第112位和158位两种氨基酸残基(即精氨酸和半胱氨酸)的存在情况决定了载脂蛋白E异构体的类型。载脂蛋白E 2在112位和158位均为半胱氨酸；载脂蛋白E3第112位为半胱氨酸，而在158位是精氨酸；载脂蛋白E4在112位和158位都是精氨酸。不同的载脂蛋白E异构体具有不同的功能。正常人群中载脂蛋白Eε2、ε3、ε4基因型占载脂蛋白E基因库的比例分别是5%-10%，70%-80%，10%-15%^[4-5]。

阿尔茨海默病是一种中枢神经系统退行性疾病，发病率逐年增高，已成为继心脑血管疾病和肿瘤后第3大危及人类生命健康的疾病^[6]。阿尔茨海默病是老年性痴呆最常见和最重要的原因，主要临床表现为缓慢进展的记忆障碍、失语、失用、失认、视空间能力损害、抽象思维和计算力损害、行为异常和人格改变等^[7-9]。阿尔茨海默病分为散发性阿尔茨海默病与家族性阿尔茨海默病，前者占所有阿尔茨海默病的绝大部分^[10]。家族性阿尔茨海默病可能的致病基因有淀粉样前体蛋白基因、早老素1基因、早老素2基因等；但散发性阿尔茨海默病的致病基因尚未阐明。

有研究表明，载脂蛋白Eε4基因型是发生散发性阿尔茨海默病的主要危险因素，并与散发性阿尔茨海默病的发病率呈剂量-依赖性关系^[11-12]，而载脂蛋白Eε2基因型则为降低发生散发性阿尔茨海默病的保护因素，但目前国内外对此尚有争议。因此，载脂蛋白E基因多态性与散发性阿尔茨海默病的关系仍是近年痴呆研究的热点之一^[13]。

传统用于载脂蛋白E基因多态性分析的基因组DNA来源主要是血液。血液标本的优点是基因组DNA产量高，适用于各种用途的基础和临床研究，而且提取血液标本基因组DNA的方法成熟可靠^[14-15]。但这种有创的方法不利于大样本研究，人群依从性差，尤其是较难得到精神疾病患者的配合。

1998年Ilveskoski等^[16]尝试用口腔黏膜脱离细胞提取基因组DNA，通过多聚酶链反应和限制性片段长度多态性的方法进行载脂蛋白E基因多态性分析。从人口腔细胞中提取基因组DNA相比抽血的方式具有无创、快速、经济的特点，可降低采集基因组DNA样本的困难，同时采集技术要求低，并且口腔拭子标本不需要冷链管理^[17-18]。

目前对人口腔脱落细胞基因组DNA的提取尚无统一的方法，且现有的方法大部分步骤繁琐、耗时多^[19-21]。为探索合适的口腔拭子基因组DNA提取方法，作者这次研究设计纳米磁珠和PicoDNA微量核酸提取试剂盒提取口腔拭子基因组DNA，对比分析2种方法提取的基因组DNA纯度和浓度，通过PCR扩增、DNA电泳确认目的条带，再用DNA测序的方法分析载脂蛋白E基因多态性，并评估哪种方法更适合用于载脂蛋白E基因多态性的分析。

材料方法

设计：采用纳米磁珠法和PicoDNA微量核酸提取试剂盒法分析载脂蛋白E基因多态性，对比观察实验。

时间及地点：于2011年7月至2012年2月在北京大学深圳医院中心实验室完成。

对象：主要参照美国国立神经病语言障碍卒中研究所和阿尔茨海默病及相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)的诊断标准^[22-23]，在北京大学深圳医院门诊和住院部选取散发性阿尔茨海默病患者50例，其中男24例，女26例，平均年龄为(74.16±5.80)岁，所有研究对象均为汉族人群。

北京大学深圳医院伦理委员会批准试验方案，研究符合赫尔辛基宣言。

材料：

纳米磁珠法与试剂盒法分析载脂蛋白E基因多态性比较实验的主要试剂及仪器：

方法：

收集口腔拭子标本：受试对象漱口后，用灭菌口腔拭子末端在其两侧颊黏膜往返擦拭各10次，之后将口腔拭子末端剪下置于1.5 mL离心管，室温保存。加入200 μL超纯水，漩涡振荡使口腔黏膜脱落细胞脱离拭子并悬浮于超纯水中，用移液器等量移入两1.5 mL离心管中，以备后续分别用纳米磁珠和PicoDNA微量核酸提取试剂盒提取基因组DNA。

纳米磁珠提取口腔拭子标本基因组DNA：①加入200 μL裂解液至放置悬浮口腔黏膜脱落细胞的离心管，80 ℃加热30 min。②往裂解完成液中加入20 μL纳米磁珠，用漩涡振荡器混匀数秒，静置结合10 min，期间每隔 3 min再用漩涡振荡器混匀数秒。③室温高速离心数秒，在磁力架上弃上清，小心保留纳米磁珠。④加入100 μL体积分数70%乙醇清洗纳米磁珠，高速短时离心，在磁力架上弃上清。⑤重复步骤④1次。⑥加入50 μL超纯水洗脱，70 ℃加热10 min。⑦室温高速离心数秒，将上清液转移至新离心管，该上清液为基因组DNA， -20 ℃保存备用。

PicoDNA微量核酸提取试剂盒提取口腔拭子标本基因组DNA：①在放置悬浮口腔黏膜脱落细胞的离心管内加入250 μL裂解液LY。②加入10 μL蛋白酶K溶液，短暂涡旋振荡混匀，55 ℃加热30 min。③样品裂解完全后，加入250 μL中和液，短暂涡旋振荡混匀。④12 000×g室温离心5 min，将上清转至新离心管中。⑤加入5 µL DNA结合液，涡旋振荡混匀数秒。⑥加入750 μL异丙醇，涡旋振荡混匀数秒，室温静置结合2 min。⑦12 000×g室温离心10 min，弃上清，小心保留乳白色沉淀。⑧加入1 mL体积分数70%乙醇，短暂涡旋振荡混匀。 ⑨12 000×g室温离心2min，弃上清。⑩重复步骤⑧、⑨一次。?用50 μL的TE缓冲液溶解沉淀，此溶液即为基因组DNA，-20 ℃保存备用。

紫外分光光度计检测基因组DNA：用紫外分光光度计uv-2450检测所提取的基因组DNA紫外吸收峰，计算基因组DNA的纯度(A₂₆₀/A₂₈₀比值)和浓度。

PCR反应：用于PCR扩增的上下游引物序列分别是：5’-GGG CAC GGC TGT CCA A-3’，5’-CGC GGC CCT GTT CCA-3’。引物由上海基康生物技术有限公司设计并合成，扩增的目的条带为300 bp，包括需要分析的载脂蛋白E基因多态位点，即rs429358 T、rs7412 T位点。PCR扩增反应在ABI 2720 Thermal Cycler中进行，反应体系为25 μL，包括12.5 μL 2×premix Ex Taq，5 μL的上、下游引物，2 μL基因组DNA，剩下体积由超纯水补足。每次扩增均设阴性对照，即用超纯水代替模板基因组DNA。PCR反应条件： 95 ℃，30 s；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，18 s；共40循环；4 ℃保温。

DNA电泳与DNA测序：用琼脂糖、TAE电泳缓冲液与溴化乙锭制备2%琼脂糖凝胶。取5 μL DL 1000 molecular mass marker、 5 μL PCR产物分别与1 μL 6×loading buffer混匀后，用微量移液器小心加入样品槽中。在Biometra电泳系统中100 V电泳20 min。电泳结束后，在凝胶成像分析系统中拍照成像，观察电泳结果以确认有无成功扩增出300 bp的目的条带。成功扩增出300 bp的PCR产物送至深圳华大基因公司测序以分析载脂蛋白E 基因多态性，测序结果由澳大利亚Technelysium公司的Chromas2.22软件分析。

主要观察指标：观察纳米磁珠与PicoDNA微量核酸提取试剂盒提取口腔拭子标本基因组DNA所需的时间，2种方法获得的基因组DNA纯度、浓度，DNA电泳结果、DNA测序图及载脂蛋白E基因ε2、ε3、ε4基因型的分布。

统计学分析：所有数据均以x(_)±s表示，由SPSS 13.0统计学软件进行组间t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

有研究探讨了载脂蛋白E基因多态性和中国汉族阿尔茨海默病患者发病年龄的相关性，研究对象来源于北京协和医院认知障碍门诊1999至2010年连续就诊的495例很可能阿尔茨海默病患者，根据发病年龄分为早发性阿尔茨海默病(发病年龄<65岁)和晚发性阿尔茨海默病(发病年龄≥65岁)，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法检测ApoE基因型，应用单因素方差分析不同基因型和阿尔茨海默病发病年龄的相关性，应用一般线性模型分析阿尔茨海默病患者发病年龄的影响因素。结果显示495例阿尔茨海默病发病年龄为(69±10)岁，其中149例早发性阿尔茨海默病的发病年龄为(58±5)岁，而346例晚发性阿尔茨海默病的发病年龄为(74±6)岁，不同的载脂蛋白E基因型与早发性阿尔茨海默病患者发病年龄无统计学相关性(F=0.99，P=0.38)，而携带载脂蛋白Eε4的基因型与晚发性阿尔茨海默病患者的发病年龄存在统计学相关性(F=6.51，P=0.002）；晚发性阿尔茨海默病患者中，5种基因型发病年龄总体比较差异有统计学意义，发病年龄从大到小依次是ε2/3>ε3/3>ε3/4>ε2/4 >ε4/4；在晚发性阿尔茨海默病患者中，无痴呆家族史者不同基因型发病年龄差异有统计学意义(F=5.18，P < 0.01)，而有痴呆家族史者不同基因型发病年龄差异无统计学意义(F=1.73，P > 0.05)，表明携带ε4的载脂蛋白E基因型可能降低了中国汉族晚发性阿尔茨海默病患者发病年龄，呈现ε4剂量依赖效应，而在具有痴呆家族史患者中未观察到这种效应。

载脂蛋白E 基因多态性分析往往需要通过大样本研究，基因组DNA模板的质量是基因多态性分析的前提，因此选取合适的标本和基因组DNA提取方法非常重要^[25-26]。最常用于获取基因组DNA模板的血液标本除收集过程是有创的缺点外，它还通常需要冷藏、加抗凝剂，增加了实验成本。此外，血液标本还存在使实验室技术人员感染的风险^[27-30]。相反，口腔拭子标本是用口腔拭子无创收集口腔黏膜脱落细胞，能得到高质量的基因组DNA以分析基因多态性。同时口腔拭子标本不需要冷藏，从而降低了成本^[31-33]。试验采用灭菌口腔拭子收集口腔黏膜脱落细胞标本，感染的风险低，操作步骤简单，无需复杂的技术，花费时间少。在采集口腔拭子标本过程中，受试对象表示无痛苦，依从性好。标本收集后在常温保存，并不影响标本的质量以及后续实验的正常进行。

试验应用纳米磁珠与PicoDNA微量核酸提取试剂盒提取口腔拭子标本基因组，耗时短。不足之处是2种方法均未实现仪器自动化提取，需手工操作，但操作步骤均较简单，容易掌握。同时应用直观和客观的评价标准A₂₆₀/A₂₈₀比值作为判断基因组DNA纯度的标准，一般A₂₆₀/A₂₈₀比值正常范围为1.7-1.9，小于1.7提示有蛋白污染，大于1.9说明有RNA污染或DNA降解^[34]。试验结果显示纳米磁珠法和PicoDNA微量核酸提取试剂盒法获取口腔拭子基因组A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.7-1.9之间，提示两种方法获得的口腔拭子标本基因组DNA纯度好，无RNA、蛋白质污染和DNA降解。

两种方法获得的基因组DNA模板均可成功通过PCR扩增出300 bp 载脂蛋白E 基因目的片段。需要注意的是，载脂蛋白E 基因目的片段GC含量高达75%，用普通的PCR酶扩增难以成功。试验先后应用大连宝生物公司的TaKaRa TaqTM、PrimeSTAR^® HS DNA Polymerase with GC Buffer和深圳欣海凌生物科技有限公司的普通PCR酶进行PCR扩增，电泳均未见目的条带。而采用通常用于荧光定量PCR扩增的2×premix Ex Taq进行本实验的载脂蛋白E 基因目的片段的普通PCR扩增，DNA电泳能看到清晰的目的条带，可能与2×premix Ex Taq消除引物二聚体能力强有关，虽然DNA电泳的结果仍可见引物二聚体，但不影响分析目的条带。引物的设计对本研究亦至关重要，试验曾设计数对引物，但是扩增成功的只有上述方法部分描述的上下游引物。因载脂蛋白E 基因目的片段结构复杂，变性和退火的温度比一般的PCR反应要适当提高才能成功扩增出目的片段。

两组PCR产物后续通过DNA测序的方法均能获得清楚的测序图，能用于正确分析载脂蛋白E基因多态性，从而为研究载脂蛋白Eε4基因型与散发性阿尔茨海默病的关系提供了前提。主要成分由嗜银神经轴索突起包绕β-淀粉样蛋白形成的神经炎性斑和由过度磷酸化的微管Tau蛋白形成的神经原纤维缠结是阿尔茨海默病的重要病理学标志^[35-37]。研究表明，载脂蛋白E与β-淀粉样蛋白的结合具有异构体特异性。有研究认为，载脂蛋白Eε4基因型与散发性阿尔茨海默病脑内过度磷酸化Tau蛋白有关，其含量随载脂蛋白Eε4的增加而增加，且载脂蛋白Eε4基因型携带者皮质区神经炎性斑密度明显增加^[38-39]。此外，有学者认为载脂蛋白Eε4基因型与血脂代谢异常有关。载脂蛋白Eε4基因型携带者血脂含量常偏高，同时一些动物实验显示出高血脂与阿尔茨海默病及β-淀粉样蛋白之间有一定的联系，脑胆固醇含量高造成β-淀粉样蛋白沉积增多。因此，载脂蛋白Eε4基因型可能通过高血脂引起脑中胆固醇含量增高，最终导致β-淀粉样蛋白增多^[40-41]。载脂蛋白Eε4基因型对神经原纤维缠结的形成亦有促进作用，参与神经炎症反应同时导致行为缺陷^[42-43]。胆碱能神经元减少和乙酰胆碱转移酶活性减低是阿尔茨海默病的神经化学特征，载脂蛋白Eε4基因型携带者的胆碱能神经元数目明显减少，胆碱能细胞体密度降低，海马突触前神经受体数目减少^[44-46]。但对于上述结论国内外学者仍未有统一的意见，因此通过大样本分析载脂蛋白E基因多态性与散发性阿尔茨海默病的关系，以及对散发性阿尔茨海默病发病机制和病理生理的影响具有重大意义^[47-48]。

纳米磁珠法所获取的基因组DNA浓度较PicoDNA微量核酸提取试剂盒法高(P < 0.05)，且DNA电泳提示纳米磁珠组PCR产物目的条带更清楚，从这个角度看，前者优于后者。纳米颗粒被誉为21世纪的新材料，其概念在20世纪中叶被科学界提出后受到广泛的重视和快速的发展^[49]。纳米颗粒尺度一般为1-100 nm，介于原子簇与一般微粒子之间。随着纳米技术的快速发展，纳米磁珠逐渐被应用到分子生物学领域。纳米磁珠在法医学与检验检疫领域应用较多，近年来在基础和临床医学的研究中开始受到重视^[50]。纳米磁珠提取基因组DNA具有以下的优点：纳米磁珠所具有的量子效应、表面效应与协同效应使其展现出许多特有的性质，如比表面积大，表面活性中心多，毒性低且不易受体内和细胞内各种酶降解，对环境污染小^[51]。因此，纳米磁珠法提取口腔拭子基因组DNA更适合用于大样本载脂蛋白E基因多态性的研究，值得推广应用。

纳米磁珠法与试剂盒法分析载脂蛋白E基因的多态性

Magnetic nanoparticles versus a commercial kit for apolipoprotein E gene polymorphism analysis

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