tTA/tetO-CCKR-2 双转基因模型小鼠鉴定及生存时间分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3079

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (11): 1682-1687.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3079

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tTA/tetO-CCKR-2 双转基因模型小鼠鉴定及生存时间分析

高子清1，阮思蓓2，李丽1，凌凤2，唐晓琴2，康清梅2，罗斯译2，罗静2，唐亚平 3，4，唐明希2

1西南医科大学，四川省泸州市 646000；2西南医科大学附属医院病理科，四川省泸州市 646000；3西南医科大学神经生物教研室，四川省泸州市 646000；4 广州市妇女儿童医疗中心，广东省广州市 510000

收稿日期:2020-06-24 修回日期:2020-07-01 接受日期:2020-07-31 出版日期:2021-04-18 发布日期:2020-12-21
通讯作者: ang Mingxi, MD, Professor, Master’s supervisor, Department of Pathology, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China Co-corresponding author: Tang Yaping, MD, Professor, Doctoral supervisor, Department of Neurobiology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China
作者简介:高子清，1994年生，四川省会理县人，汉族，西南医科大学在读硕士，医师，主要从事临床及实验病理学研究。
基金资助:
四川省科技厅科技支撑计划(14ZC0054)，项目负责人：唐亚平；泸州市科知局-西南医科大学联合资助项目(2017LZXNYD-J14)，项目负责人：唐明希

Identification and survival analysis of tTA/tetO-CCKR-2 double transgenic mice

Gao Ziqing1, Ruan Sibei2, Li Li1, Ling Feng2, Tang Xiaoqin2, Kang Qingmei2, Luo Siyi2, Luo Jing2, Tang Yaping3, 4, Tang Mingxi2

1Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Department of Pathology, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 3Department of Neurobiology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 4Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China

Received:2020-06-24 Revised:2020-07-01 Accepted:2020-07-31 Online:2021-04-18 Published:2020-12-21
Contact: 唐明希，博士，教授，硕士生导师，西南医科大学附属医院病理科，四川省泸州市 646000 并列通讯作者：唐亚平，博士，教授，博士生导师，西南医科大学神经生物教研室，四川省泸州市 646000；广州市妇女儿童医疗中心，广东省广州市 510000
About author:Gao Ziqing, Master candidate, Physician, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Science and Technology Support Plan of Sichuan Provincial Department of Science and Technology, No. 14ZC0054 (to TYP); Luzhou Science and Technology Bureau-Southwest Medical University joint Funded Project, No. 2017LZXNYD-J14 (to TMX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)：是能对人类焦虑反应产生复杂影响的一种神经肽类物质，与焦虑症、恐惧行为、急性应激障碍等相关疾病都有着密切的联系。胆囊收缩素在中央杏仁核(CeA)中通过CCKR-2传导信号，可以双重调节炎症反应性疼痛和焦虑相关行为。
原位杂交：指将特定标记的已知顺序核酸为探针，与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。
转基因技术：宿主细胞的基因组接受并稳定整合外源基因，且在下一代予以表达，引起生物体可遗传性状改变的基因操作技术。

背景：前脑特异性胆囊收缩素受体2(CCKR-2)双转基因小鼠(tTA/tetO-CCKR-2 tg，简称dtg)是焦虑相关疾病的理想动物模型，但尚缺乏该模型鉴定及寿命相关数据。
目的：鉴定dtg小鼠子代DNA及胆囊收缩素受体2转基因前脑特异性表达并分析其生存情况。
方法：由α-CaMKII/tTA单转基因小鼠和tetO-CCKR-2单转基因小鼠杂交，构建tTA/tetO-CCKR-2 双转基因小鼠模型，取子代鼠尾提取DNA进行基因型鉴定；以野生型小鼠(WT小鼠)做对照，原位杂交特异性识别前脑胆囊收缩素受体2转基因表达；记录2年内dtg和WT小鼠(雌、雄分别各30只)的自然寿命进行生存分析。实验方案经西南医科大学实验动物伦理委员会批准；伦理审批号：20150068。
结果与结论：①基因型鉴定：dtg实验小鼠预期基因片段大小与琼脂糖凝胶电泳结果相符；②原位杂交鉴定：dtg小鼠前脑区域呈现强烈的胆囊收缩素受体2杂交信号，而WT小鼠几乎未呈现；③寿命观察：雌、雄dtg小鼠中位生存时间分别为76周和77周，生存率均随小鼠的年龄增长而降低，且均分别显著低于雌、雄WT小鼠(均P < 0.001)；不同性别dtg小鼠间生存率差异无显著性意义(P=0.577)；④结果表明，dtg小鼠可通过鼠尾提取DNA、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型及原位杂交鉴定胆囊收缩素受体2转基因在前脑特异性表达；tTA/tetO-CCKR-2双转基因诱导可能会缩短小鼠的总体寿命，但对雌、雄dtg小鼠间的影响无显著差异。
https://orcid.org/0000-0001-6136-974X (高子清)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 双转基因小鼠, 基因型鉴定, 原位杂交, 生存分析, 焦虑症, 恐惧行为, 应激障碍

Abstract: BACKGROUND: The inducible forebrain-specific cholecystokinin receptor-2 (CCKR-2) double transgenic (tTA/tetO-CCKR-2 tg, abbreviated as dtg) mice are an ideal model of anxiety-related diseases. However, there is still a lack of model identification and life related data
OBJECTIVE: To identify the genomic DNA of the offspring and the specific expression of CCKR-2 transgene in the forebrain, and to analyze the survival probability of dtg mice.
METHODS: α-CaMKII/tTA single transgenic mice and tetO-CCKR-2 single transgenic mice were cross-fertilized to construct a dtg mouse model. The genomic DNA was extracted from the tail of the offspring, and the genotypes were detected by PCR and agarose gel electrophoresis. Wild-type (WT) mice were used as controls. In situ hybridization was used to detect the expression of CCKR-2. Survival of dtg mice and WT mice (30 females and 30 males) was observed and recorded within 2 years. The study protocol was approved by the Experimental Animal Ethics Committee of Southwest Medical University, with an approval No. 20150068.
RESULTS AND CONCLUSION: Agarose gel electrophoresis results showed the molecular weight of the PCR products of dtg mice was consistent with the expected target gene fragment. In situ hybridization results showed a strong signal of CCKR-2 was detected in the forebrain of dtg mice, but hardly present in the WT mice. The median survival time of dtg mice was 76 weeks in females and 77 weeks in males. The survival probability was decreased with age in dtg mice. The survival probability of WT mice was significantly better than that of dtg mice (P < 0.001). There was no significant sex difference between males and females of dtg mice (P=0.577). Therefore, the specific expression of CCKR-2 transgene in the forebrain can be identified using PCR amplification, genomic DNA extraction, agarose gel electrophoresis, and in situ hybridization. tTA/tetO-CCKR-2 double transgenic induction may shorten the survival time of mice, but no significant difference is observed between the females and males of dtg mice.

Key words: double transgenic mouse">, genotype identification">, in situ hybridization">, survival analysis">, anxiety disorder">, fear behavior">, post-traumatic stress disorder

中图分类号:

高子清, 阮思蓓, 李丽, 凌凤, 唐晓琴, 康清梅, 罗斯译, 罗静, 唐亚平 , 唐明希. tTA/tetO-CCKR-2 双转基因模型小鼠鉴定及生存时间分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1682-1687.

Gao Ziqing, Ruan Sibei, Li Li, Ling Feng, Tang Xiaoqin, Kang Qingmei, Luo Siyi, Luo Jing, Tang Yaping, Tang Mingxi . Identification and survival analysis of tTA/tetO-CCKR-2 double transgenic mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(11): 1682-1687.

图/表（结果） 10

2.1 实验动物数量分析截止到2年(104周)寿命观察时间点，各组动物的生存情况记录见表1。

2.2 dtg子代小鼠和WT小鼠PCR扩增产物电泳结果 WT小鼠和dtg小鼠电泳条带见图1。dtg小鼠显示位于550 bp和350 bp位置的双条带。

2.3 dtg小鼠和WT小鼠脑组织原位杂交检测结果见图2。WT小鼠前脑区域未见明显杂交信号(图2A)，在dtg小鼠包括大脑皮质、海马、纹状体等在内的前脑区域观察到强烈的杂交信号，而在中脑区域(丘脑/下丘脑)、后脑区域(脑干、脑桥、小脑)未观察到(图2B)。

2.4 雄性dtg小鼠和雄性WT小鼠生存情况及生存率结果比较实验观察至104周，雄性小鼠截尾数据情况见表2。

雄性小鼠K-M生存曲线见图3。雄性dtg小鼠和雄性WT小鼠的生存率均随年龄增长逐渐降低，且雄性dtg小鼠生存率明显低于WT小鼠，雄性dtg小鼠中位生存时间为77周。两种小鼠生存率差异有显著性意义(χ2=35.280，P < 0.001)。

2.5 雌性dtg小鼠和雌性WT小鼠生存情况及生存率结果比较实验观察至104周，雌性小鼠截尾数据情况见表3；雌性小鼠K-M生存曲线见图4。雌性dtg小鼠中位生存时间为76周，两组小鼠的生存率均随年龄增长逐渐降低，且雌性WT小鼠的生存率明显优于雌性dtg小鼠，两组小鼠生存时间差异有显著性意义(χ2=56.231，P < 0.001)。

2.6 雄性dtg小鼠和雌性WT小鼠生存情况及生存率结果比较实验观察至104周，雄性dtg小鼠和雌性WT小鼠截尾数据情况及K-M生存曲线见图5。雄性dtg小鼠中位生存时间为77周；雄性dtg小鼠生存率明显低于雌性WT小鼠生存率，两种小鼠生存时间差异有显著性意义(χ2=48.550，P < 0.001)。

2.7 雌性dtg小鼠和雄性WT小鼠生存情况及生存率结果比较实验观察至104周，雌性dtg小鼠和雄性WT小鼠截尾数据情况及K-M生存曲线见图6。雌性dtg中位生存时间为76周。雌性WT小鼠的生存时间明显优于雄性dtg小鼠，且差异有显著性意义(χ2=41.563，P < 0.001)。

2.8 雄、雌dtg小鼠生存情况及生存率结果比较实验观察至104周，两种性别的dtg小鼠截尾数据情况及K-M生存曲线见图7。dtg小鼠雌性与雄性之间生存时间差异无显著性意义(χ2=0.312，P=0.577)，雄、雌dtg小鼠中位生存时间分别为76周和77周。

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引言

焦虑症已经成为当今人类社会最常见的精神疾病之一[1-2]，其遗传及分子机制的阐明需要相关的体外和体内实验模型[3]，而利用动物模型来探究其发病机制及相关临床前药物疗效、代谢、毒理等作用已得到广泛认可并体现出不可替代的优越性。因此，动物模型的制作、选择、繁殖、饲养，以及包括自然寿命在内的生命体征等揭示都很必要。胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)是能对人类焦虑反应产生复杂影响的一种神经肽类物质，与焦虑症、恐惧行为、急性应激障碍等相关疾病都有着密切的联系[4]。近年，涉及分布于神经系统的胆囊收缩素受体2(cholecystokinin receptor2，CCKR-2)被认为与焦虑症、恐慌症等相关性甚高。CCK在中央杏仁核(CeA)中通过CCKR-2传导信号，可以双重调节炎症反应性疼痛和焦虑相关行为[5]。另外，CCK-4作为CCKR-2激动剂，可能会促进恐慌焦虑的发生，且与剂量呈正相关[6]。焦虑障碍的临床诊治中，能拮抗CCK-2受体的药物被认为是具有很大治疗潜力和研究价值的药物[7]。前期已成功构建tTA/tetO-CCKR-2 tg小鼠[8-9]，其作为焦虑症的一种遗传动物模型，表现出明显且稳定的焦虑行为学特征，其前脑中CCK-2受体结合能力显著提高，可能参与了焦虑表达的神经分子机制。因此，此次研究对象dtg小鼠是焦虑症相关疾病的理想动物模型，而模型的成功构建、繁殖与正确饲养可为相关疾病机制的揭示等奠定重要实验基础。
由于前期研究中的直接造模方法复杂且成本高[8]，而动物交配繁殖作为后期实验造模方式的一种，能简化操作、节约时间及经费等。因此，此次研究通过对dtg小鼠繁殖子代进行基因型鉴定和组织学定位，以确认该模型在实验室的成功建立。由于焦虑常被抑郁表现掩盖，而焦虑对某些疾病的影响比抑郁更大[10]。焦虑及抑郁的患病率女性均高于男性且可能缩短人类寿命，特别是有基础疾病的患者[11-12]。抑郁护理治疗可改善患者症状和生活质量，但尚缺乏足够的证据表明其对生存率有显著影响[13]。另外，正常近交系小鼠生活能力较正常野生型小鼠弱，寿命可能缩短[14]。因此，对鉴定符合的dtg小鼠进行生存寿命观察和分析十分必要，为进一步繁育及选择该模型进行焦虑症、恐惧行为、创伤后应激障碍等研究的实验时间设计等提供有益参考。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计分组对照动物实验。
1.2 时间及地点实验动物繁育、饲养于西南医科大学SPF实验动物中心屏障动物房完成，使用许可证号：SYXK (川)2018-065；生产许可证号：SCXK(川)2018-17。实验总时间为2015年9月至2018年9月。
1.3 材料
1.3.1 实验动物实验所用亲代动物为以B6/CBA F1为遗传背景(品系)的双转基因SPF级小鼠，其构建是利用tTA依赖系统诱导CCKR-2基因前脑特异性表达的tTA/tetO-CCKR-2双转基因小鼠，由α-CaMKII/tTA单转基因小鼠和tetO-CCKR-2单转基因小鼠杂交所得[9]。子代dtg小鼠繁殖如已发表文献所述[9]。实验中寿命观察动物包括基因型鉴定和组织学定位均符合的实验组dtg小鼠雌、雄各30只；野生型对照组小鼠(简称WT小鼠)雌、雄各30只。实验方案经西南医科大学实验动物伦理委员会批准，伦理审批号：20150068。

1.3.2 实验条件动物繁育标准条件[15]：控制在室温21-23 ℃，湿度75%，每间隔12 h进行1次光照循环，期间随意饮水进食。标准小鼠笼饲养，每笼小于4只，混合饲养过程中若发现小鼠状态异常及打架受伤等情况，及时隔离饲养，尽可能避免意外伤害对小鼠自然生存时间的影响。高温高压灭菌消毒所有饲养所需物品；每间隔3 d进行1次垫料、饮水及鼠笼的更换，每次供应足够的饮水及饲料。按实验动物使用3R原则给予人道的关怀。

1.4 实验方法
1.4.1 基因鉴定
(1) dtg小鼠子代DNA提取：①取材：麻醉后无菌状态下结扎并切取40 d小鼠尾尖部0.4-0.6 cm，置于已消毒且已标记1.5 mL离心管，操作后对创口进行消毒，必要时予以止血。②提取(天根DNA提取试剂盒)：加200 μL GA 和18 μL蛋白酶K并倒转混匀，置于恒温箱消化(56 ℃，16-18 h)；简短离心2 s，加200 μL GB并倒转混匀，简短离心3 s；置于水浴箱(70 ℃，10 min)，简短离心3 s；加200 μL无水乙醇，振荡15 s，简短离心3 s；将溶液及絮状物转入带有收集管的吸附柱CB3，离心 (12 000 r/min，30 s)，弃废液；加500 μL GD，离心(12 000 r/min，30 s)，弃废液；加600 μL PW，离心(12 000 r/min，30 s)，弃废液；重复上一步骤；离心(12 000 r/min，2 min)，弃废液；开盖置于恒温箱(37 ℃，3 min)，弃收集管，将吸附柱转入对应干净离心管中；加100 μL TE，闭盖室温放置3 min，离心(12 000 r/min，2 min)。置于 -20 ℃冰箱保存以用于后续实验。
(2)PCR：①tTA和CCKR-2 PCR扩增体系：CCKR-2及tTA反应体系总量为25 μL，组成如下：DNA 1 μL； Primer R 0.1 μL； Primer F 0.1 μL；2×MasterMix 12.5 μL；dd H2O 9.5 μL；纯水1.8 μL；②PCR扩增条件：预变性(94 ℃，30 s)；变性(94 ℃，10 s)；退火(55 ℃，30 s)，延申(72 ℃，45 s)，重复 35个循环；4 ℃维持；③引物序列设计：CCKR-2(5’-3’)，F：ACG GTG GGA GGC CTA TAT AA，R：GAG TGT GAA GGG CAT GCA A；tTA(5’-3’)，F：AGG CTT GAG ATC TGG CCA TAC，R：AGG AAA AGT GAG TAT GGT G。
(3)琼脂糖凝胶电泳：配制1.2%琼脂糖凝胶，加样：DNA Marker 2 μL，各PCR产物5 μL；电泳：140 V，125 mA，18 W，22 min；在紫外观测仪上观察电泳结果。
1.4.2 组织学鉴定低温恒温器(Leica，CM-1900)切取基因型鉴定符合的随机1只dtg小鼠子代及WT小鼠20 μm大脑矢状切面。使用35S标记的寡核苷酸探针(β-球蛋白poly-A)进行原位杂交，具体方法如文献所述[9-10]。
1.4.3 寿命分析观察2年内(104周)在自然状态下的每只实验小鼠从出生到其死亡的过程，记录出生和死亡日期以及生存到104周时的小鼠存活情况，绘制Kaplan-Meier生存曲线并分析结果。退出(在2年实验时间内因打架受伤死亡的小鼠)和终止(在2年实验的时间后仍然存活的小鼠)的数据为截尾数据。不明原因死亡且尸体解剖无明显疾病和外伤认定为小鼠自然死亡。
1.5 主要观察指标子代小鼠琼脂糖凝胶电泳条带位置、dtg小鼠和wt小鼠前脑区域杂交信号、实验时间内每只小鼠的出生日期、自然死亡日期、生存状态、意外死亡日期及原因。
1.6 统计学分析以SPSS 20.0软件进行数据分析，采用非参数估计法 K-M 法 ( Kaplan-Meier 法) 进行生存分析，用中位生存时间表示各比较组小鼠的生存时间，P < 0.05 时表示差异有显著性意义。

讨论

CCK与焦虑症的发病机制相关，作为CCK受体最主要的一种亚型，CCK-2受体被认为在操控焦虑行为等方面扮演重要角色[16]。Tet诱导调控系统包括Tet-on(rtTA)系统和Tet-Off(tTA依赖)系统，是最常用的药物诱导型转基因表达系统之一[17]。此次实验模型dtg小鼠亲代构建采用的Tet-Off系统已被广泛用于许多哺乳动物和转基因动物中的可逆诱导基因表达[18]。其利用tTA/tetO诱导型基因表达系统来产生诱导型前脑特异性CCKR-2转基因小鼠，建立了两种单转基因小鼠品系(α-CaMKII/tTA和tetO-CCKR-2)，再由此两种单转基因小鼠杂交出tTA /tetO-CCKR-2半合子双转基因小鼠[8-9]。由于焦虑症人体实验的局限性，一个较好的遗传动物模型应用对研究焦虑症机制及相关药物疗效、代谢、毒理等试验显得非常重要，因此，正确选择实验动物模型是进行研究实验的前提，成功繁殖和正确饲养dtg小鼠及其生命体征的揭示是利用该模型进行相关研究的基础。此次实验通过对dtg小鼠子代基因型及组织学的完整鉴定以及饲养过程中寿命的观察并分析其生存率，为进一步繁育及使用该模型对焦虑症、恐惧行为等进行研究的实验设计等提供有益参考，对焦虑症发展等神经分子机制的研究以及对今后临床对焦虑症治疗干预等都具有重要意义。
基因组DNA鉴定方式有多种(如Southern法和酚氯仿提取法等)，且均各有不同程度的优缺点[19]。此次实验采用的鉴定方式具有准确、便捷和低成本等优点，且电泳结果条带显示与预期目的基因片段大小一致，表明通过鼠尾提取DNA、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳鉴定的方法可以用于dtg小鼠模型的基因型鉴定。另外，成功建立的可以应用于焦虑症相关疾病研究dtg小鼠模型，其CCKR-2转基因表达应为前脑特异性的,因为α-CaMKII阳性细胞主要是前脑的兴奋性神经元。因此，鉴定此模型除了需要确认子代小鼠基因组DNA片段大小外，还需有确认CCKR-2转基因在dtg小鼠中的表达模式。原位杂交使用的35S标记的寡核苷酸探针(β-球蛋白poly-A)，可以特异性识别转基因CCKR-2，但不能识别内源性CCKR-2。此次实验结果显示与WT小鼠相比，在dtg小鼠前脑区域观察到更强烈的杂交信号，表明CCKR-2转基因表达是前脑特异性的，进一步说明以上鉴定方法可以应用与此模型子代的鉴定。
转基因技术是指宿主细胞的基因组接受并稳定整合外源基因，且在下一代予以表达，引起生物体可遗传性状改变的基因操作技术，而动物转基因技术更是早已成为生物医学研究领域的研究趋向[20]。转基因动物模型被广泛应用于各种临床及基础研究实验中，以期更好地模仿、研究人类疾病奠定基础。由于导入基因、品系及种别的不同，各种转基因动物的生存时间可以不同。神经系统相关疾病研究显示，转基因诱导可以不同程度缩短实验小鼠寿命，如缺少FgfrL1基因外显子3编码的Ig结构域的转基因小鼠寿命缩短[21]，3xTg-AD转基因小鼠患有免疫系统功能障碍可能导致生存时间的降低[22]，Tg 2576转基因小鼠和5xFAD转基因小鼠的中位生存时间显著小于对照组B6SJL野生型小鼠的中位生存时间[23]。另外，同一转基因模型不同性别的实验动物之间可能因为基因突变的性别差异导致转基因诱导对其生存时间的影响不同[24]，如3xTg-AD转基因小鼠雌性小鼠的死亡率要低于雄性小鼠[22]，APP/PS1转基因模型(TASTPM)雄性小鼠到300 d时死亡率为10%，雌性的死亡率为45.5%，对照组小鼠的死亡率为0%[25]。虽然转基因随机插入小鼠基因组中可能会破坏另一个重要的基因座而对神经元的发育产生影响，但课题组前期的研究显示，该实验模型，转基因过表达和随机基因组整合均不会导致小鼠神经元发育缺陷[9]。此次实验以WT小鼠作为对照，观察2年内dtg小鼠的自然寿命并分析其生存曲线，结果显示雌、雄dtg小鼠中位生存时间分别为76周和77周，其生存率均随小鼠的年龄增长而降低，且均分别明显低于对照组雌、雄WT小鼠的生存时间，均有明显统计学差异。其具体原因尚不清楚，转基因后外源基因是否对动物的饮水、饮食、代谢功能等造成了影响也不明确，还有待进一步观察、分析和相关机制研究；但雌、雄dtg小鼠间的生存时间差异无统计学意义。因此，利用dtg小鼠模型进行相关研究的实验设计时，需控制实验时间在此动物模型观察寿命内进行，还应考虑随年龄的增加其生存概率变化对实验的影响等。另外，此动物模型性别间寿命差异暂无统计学意义。
总之，dtg小鼠子代可以通过原位杂交鉴定CCKR-2转基因在前脑特异性表达，并通过取鼠尾进行PCR扩增的方法鉴定其是否符合预期模型基因型。并且，tTA/tetO-CCKR-2双转基因诱导可能会降低小鼠的生存概率并缩短其生存时间，但基本也都在50周龄以后才出现死亡现象。另外，对不同性别dtg小鼠之间的寿命影响差异不明显。以上结论对实验室繁育该品系小鼠及使用该模型对焦虑症、恐惧行为等进行研究的实验设计等提供了重要参考依据。当然，此次实验存在于非自然环境的人为控制因素下，受饲养条件、实验时间及其数量等的影响和限制，可能对小鼠的寿命也存在一定影响，比如，按只数分笼饲养可能会影响小鼠在自然状态下的接触与交流，按性别分笼饲养可能阻断了小鼠自然状态下的雌雄交配及情感交互等。另外，观察时间内发生的不可控因素，如其他疾病的发生和相互间的精神状态及打架争斗也可能影响实验小鼠的自然死亡寿命，故实验结论还有待更多的数据来完善与支撑。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

tTA/tetO-CCKR-2 双转基因模型小鼠鉴定及生存时间分析

Identification and survival analysis of tTA/tetO-CCKR-2 double transgenic mice

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