设计：基因水平，斑马鱼整胚原位杂交染色观察。
时间及地点：于2014年9至11月在北京大学深圳研究生院遗传与发育实验室完成。
材料：
实验动物：Tubingen野生型斑马鱼，取自北京大学深圳研究生院遗传与发育实验室；
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实验方法：细胞周期蛋白D1探针的制备：
斑马鱼胚胎总RNA提取：收集受精后正常发育至24 h(hour past fertilization)的胚胎50枚，用Proteinase K处理脱膜，后按照TRIGene总RNA提取试剂盒使用说明提取斑马鱼胚胎总RNA，加入30 μL RNase free H2O，测定RNA浓度和纯度，于-80 ℃保存。
RT-PCR 反转录成cDNA：按照PrimeScript® RT reagent Kit试剂盒操作说明书配制反转录反应体系，进行反转录反应，所得cDNA产物置于-20 ℃保存。反转录条件为：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。
PCR引物设计：在NCBI网站上查得细胞周期蛋白D1 cDNA序列，使用primer premier 5.0软件设计引物，引物序列：
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PCR扩增目的基因细胞周期蛋白D1；根据HotStart Taq MasterMix PCR试剂盒操作说明配制50 μL反应体系，置PCR仪进行扩增，扩增条件：预变性：95 ℃，3 min；PCR反应：95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃，1 min，30次循环；延伸：72 ℃，7 min；4 ℃，3 min。
琼脂糖凝胶回收PCR产物及产物纯化：根据琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)的使用说明回收PCR产物，收集DNA溶液。
将目的基因细胞周期蛋白D1连接到EZ-TTM载体：配制10 μL反应体系：PCR产物，4 μL；EZ-TTM Cloning Vector，1 μL；solutionⅠ，5 μL；于16 ℃过夜连接。
转化及重组转化子的筛选：准备LB/氨苄平板，在涂板前恢复至室温；取连接产物10 μL至于1.5 mL离心管；从-80 ℃冰箱取出感受态细胞，冰上融化，混匀；向装有连接产物的离心管加入感受态细胞50 μL，冰浴30 min；精确的42 ℃水浴热激60 s，迅速移入冰浴，冷却2 min；加入200 μL无抗氨苄的LB培养基，37 ℃震荡1 h；将转化培养基100 μL涂到LB/氨苄平板上，37 ℃过夜培养。
菌落PCR鉴定：根据HotStart Taq MasterMix PCR试剂盒操作说明配制10 μL反应体系。扩增条件：95 ℃，5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃，1 min，30次循环；72 ℃，7 min；4 ℃，3 min。凝胶电泳后将符合目的条带的菌液送华大基因公司测序。
质粒的提取：根据TIANprep Midi Plasmid Kit质粒小提中量试剂盒(离心柱型)操作说明提取质粒。DNA产物保存在-20 ℃，以防DNA 降解。
酶切鉴定：将含有细胞周期蛋白D1目的基因的重组质粒用kpnI-nf酶切线性化。酶切体系：质粒，12 μg；10×buffer cutsmart，10 μL；加ddH2O至100 μL。
线性化产物纯化：根据TIANquick Mini Purification kit使用说明纯化线性化质粒，收集DNA溶液。
合成RNA探针：在冰上配制探针合成体系：5×buffer，4 μL；酶切产物(800 ng)，5 μL；DTT，2 μL；RNAsin，0.5 μL；(Dig)10×NTPmix，2 μL；T3酶，1.2 μL；RNase free H2O补至20 μL。37 ℃温育1.5 h，加入1.2 μLRNA合成酶，然后继续温育1.5 h。取1 μL琼脂糖凝胶电泳检测产物。
探针纯化：根据Rneasy FFPE kit(50)操作说明纯化细胞周期蛋白D1 RNA探针，并于-80 ℃保存。
胚胎的收集：根据Zebrafish book中描述的方法养殖斑马鱼[7]，鱼房内每日光照、黑暗时间比为14/10，循环系统水温控制在28.5 ℃，每日喂饲料2次。实验前天晚上，将雌雄以1∶1移入产卵缸，并用隔板隔开。次日清晨，移去隔板，雄鱼追逐雌鱼后30 min便可收集胚胎。收集后的胚胎于28.5 ℃恒温箱中培养，根据Kimmel等[8]的方法选取需要的发育阶段的胚胎。
胚胎的加药处理：
对照组：鱼水(1%二甲基亚砜)收集受精后正常发育至2-cell期(受精后0.75 h)以及shield期(6 h)的胚胎，随机移入12孔板，每孔25枚，每组设3个复孔。
加药组：鱼藤素用二甲基亚砜助溶，用鱼水稀释至终浓度100 nmol/L，200 nmol/L，400 nmol/L。吸干鱼水后迅速加入2 mL配好的药液，于28.5 ℃恒温箱中培养。2-cell期的胚胎加药处理至shield期收集，shield期(6 hpf)的胚胎加药处理至受精后 24 h收集。
整胚原位杂交：
胚胎固定：将收集的受精后24 h实验组和对照组胚胎，用蛋白酶脱膜；加BT-fix，4 ℃固定过夜。
第1天：
水溶液体系重新建立：吸去恢复到室温的胚胎中的乙醇(ETOH)，用75%，体积分数50%，25%的 ETOH的PBST溶液依次处理5 min；室温，PBST溶液处理胚胎5 min，3次；用1/1 000 X蛋白酶K的PBST溶液(蛋白酶K，终浓度10 mg/L)常温消化，受精后24 h胚胎消化120 s；室温，40 g/L多聚甲醛(paraformaldehyde，para)固定胚胎20 min，使蛋白酶失活；室温，PBST溶液处理胚胎5 min，3次。
预杂交：用500 μL HYB润洗1次胚胎，竖直放置离心管，待胚胎沉到离心管底后，等待5 min，再加入500 μL HYB，65 ℃预杂交三四个小时。
杂交：RNA探针以3 mg/L浓度溶于HYB，67 ℃温育30 min；吸去胚胎管中的HYB，加入含探针的HYB溶液100 μL；67 ℃温育过夜，杂交15-16 h。
第2天：
去除探针并洗涤胚胎：吸去探针溶液并重新保存于-20 ℃；洗涤：65 ℃，100%HYB，每管700 μL洗涤1次，10 min；65 ℃，75%HYB：25% 2XSSC混合液，1 mL/管洗涤1次，15 min；65 ℃，50%HYB：50% 2XSSC混合液，1 mL/管洗涤1次，15 min；65 ℃，25%HYB：75% 2XSSC混合液，1 mL/管洗涤1次，15 min；65 ℃，2XSSC，1 mL/管洗涤1次，15 min；65 ℃，0.2XSSC，1 mL/管洗涤2次，30 min/次；室温，75% 0.2XSSC：25% MABT混合液，1 mL/管洗涤1次，10 min室温，50% 0.2XSSC：50% MABT混合液，1 mL/管洗涤1次，10 min；室温，25% 0.2XSSC：75% MABT混合液，1 mL/管洗涤1次，10 min；将胚胎转移至24孔板，MABT，1 mL/管洗涤1次，10 min；每管加入500 μL阻断溶液(阻断溶液12 mL配方：120 μL羔羊血清+2.4 mL10%block，MABT补充至12 mL)，在摇床上慢摇，阻断3 h。
地高辛抗体检测(Anti-Dig Detection)：加入新用阻断溶液4 000倍稀释的地高辛抗体(digitin antibody，anti-dig)，每管300 μL，4 ℃摇动过夜。
第3天：
碱性磷酸酶底物染色：室温，MABT溶液处理胚胎5 min，6次；50 mL检测缓冲液AP buffer配制(现用现配)：1 mol/L TrisHCl pH 9.5，5 mL；1 mol/L MgCl2，2.5 mL；5 mol/L NaCl，1 mL；10% Tween-20，0.5 mL；ddH2O， 41.25 mL；检测缓冲液AP buffer处理胚胎，1 mL/管洗涤 2次，5 min/次；
染色：显色缓冲液配制：AP缓冲液，1 000 μL；50 g/L NBT，4.5 μL；50 g/L BCIP(X-Phosphate)，3.5 μL；显色液200 μL/管，室温温育，金属箔片包裹避光，置于于摇床上慢摇。不断观察染色情况。
终止显色：PBST 洗涤2次，1 min/次，然后用PBS洗涤1 min。
脱水处理：室温，体积分数30%乙醇PBS溶液，洗涤1次，2 min；室温，体积分数50%乙醇PBS溶液，洗涤1次，2 min；室温，体积分数70%乙醇水溶液，洗涤1次，2 min；体积分数100%乙醇，-20 ℃储存过夜。
复水：室温，体积分数70% 乙醇水溶液，洗涤1次，2 min；室温，体积分数50% 乙醇PBS溶液，洗涤1次，2 min；室温，体积分数30% 乙醇PBS溶液，洗涤1次，2 min；室温，PBST 洗涤2次，5 min/次；于解剖显微镜白场下拍照。
主要观察指标：①鱼藤素下调shield期斑马鱼胚胎中细胞周期蛋白D1的表达。②鱼藤素抑制斑马鱼胚胎发育结果。③鱼藤素下调受精后24 h斑马鱼胚胎中细胞周期蛋白D1的表达。
