不同龋敏感儿童牙菌斑内微生物群落的分子生态学特点

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.25.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：玻璃离子水门汀充填的儿童牙体仍易发生继发龋现象，与充填材料表面牙菌斑内复杂微生物群落具有密切关系，而传统微生物学方法无法获知牙菌斑微生物的重要信息。
目的：利用先进的现代分子生态学技术解析不同龋敏感儿童玻璃离子水门汀表面牙菌斑内微生物群落结构与重要致龋微生物的数量水平。
方法：选择3-5岁儿童24名，按乳牙龋失补牙面指数不同分为无龋组、中龋组和高龋组，每组8名。采集各组儿童全口牙面菌斑，利用变性梯度凝胶电泳进行微生物群落多样性分析与微生物种群鉴定，利用荧光原位杂交考察致龋微生物Streptococcus spp.的数量分布，利用实时定量PCR考察重要致龋菌Streptococcus mutans占总菌的相对数量。
结果与结论：无龋组牙菌斑内微生物群落的多样性显著高于中龋组和高龋组(P < 0.05)，中龋组和高龋组中大量富集的某些微生物可能在龋病发展过程中起重要作用。3组样本共检出16个微生物菌属，Streptococcus spp.和Actinomyces spp.可能是高龋组中重要的致龋微生物。Streptococcus spp.和Streptococcus mutans在高龋组中所占比例显著高于无龋组和中龋组(P < 0.01)。综合来看，研究采用的分子生态学技术可以较好反映牙菌斑内与致龋过程密切相关的复杂微生物群落。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 儿童龋病, dmfs指数, 变性梯度凝胶电泳, 荧光原位杂交, 实时定量PCR, 群落多样性, 致龋微生物

Abstract:

BACKGROUND: Children teeth filled with glass ionomer cement are still susceptible with secondary caries, which is in close relationship with complex microbial community in dental plaque on the surface of glass ionomer cement. Traditional microbial methods are incapable of getting important information towards dental plaque microbes.
OBJECTIVE: To analyze microbial community structure and numerical level of caries-induced microbes in dental plaque on the surface of glass ionomer cement for different caries-susceptible children.
METHODS: Twenty-four children (age: 3-5 years) were divided into the caries-free, caries-positive, and caries-active children groups by the decayed, missing and filled index. With eight individuals in each group, their dental plaques were sampled for microbial community analysis. Denaturing gradient gel electrophoresis was employed to make clear the microbial community diversity and species identity in dental plaque of the caries-free, caries-positive, and caries-active children groups. Fluorescent in situ hybridization was used to investigate the numerical level of the caries-induced microbe Streptococcus spp. Quantitative PCR was carried out to analyze relative quantity of Streptococcus mutans in total bacteria.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the caries-positive and caries-active children groups, microbial community diversity among samples was significantly higher in the caries-free group. Microbes abound in the caries-positive and caries-active groups might act important roles in the development of caries. Streptococcus spp. and Actinomyces spp. might be important caries-induced microbes in the caries-active group. The ratios of Streptococcus spp. and Streptococcus mutans in total bacteria were significantly higher in the caries-free group than those in the caries-free and caries-positive groups. In summary, molecular ecology technologies can well reflect caries-related complex microbial community in dental plaque.

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Key words: mouth, dental plaque, ecology

中图分类号:

R318

刘莉霞，陈琳. 不同龋敏感儿童牙菌斑内微生物群落的分子生态学特点[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(25): 4043-4050.

Liu Li-xia, Chen Lin. Molecular ecology of microbial communities in dental plaques of different caries-susceptible children[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(25): 4043-4050.

图/表（结果） 3

2.1 不同龋敏感儿童GIC表面牙菌斑内微生物群落结构分析采用变性梯度凝胶电泳技术分析不同龋敏感儿童牙菌斑内的微生物群落结构，结果如图1-3所示。结果表明：无龋组、中龋组和高龋组牙菌斑样品经变性梯度凝胶电泳分析后均分离出数目不等的电泳条带，每个独立分离的条带可认为是一个操作分类单元(operational taxonomy unit，OTU)。无龋组儿童牙菌斑样品分离出的微生物群落优势菌属为37个OTUs，显著高于中龋组(24个OTUs)和高龋组(21个OTUs)，说明无龋组牙菌斑样品中微生物种类显著多于中龋组和高龋组。对这3组牙菌斑样品中，变性梯度凝胶电泳图谱显示均出现了某些微生物的大量富集现象。

2.2 不同龋敏感儿童GIC表面牙菌斑内微生物群落多样性分析为考察不同龋敏感儿童牙菌斑内微生物群落多样性，考察了无龋组、中龋组和高龋组牙菌斑样品变性梯度凝胶电泳图谱的条带数量、Shannon-Wiener多样性指数和Simpson多样性指数，见表2所示。可知无龋组、中龋组和高龋组3个组别中，无龋组具有最多的条带数目，最高的Shannon-Wiener多样性指数和Simpson多样性指数，说明无龋组牙菌斑内微生物群落的多样性最高，微生物菌群种类最为丰富。高龋组的条带数目最少，Shannon-Wiener多样性指数和Simpson多样性指数在3组中最低。统计学分析表明3组间条带数量、Shannon-Wiener多样性指数和Simpson多样性指数的差异均有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 不同龋敏感儿童GIC表面牙菌斑内微生物功能菌群鉴定通过将变性梯度凝胶电泳图谱上条带的测序结果提交至Genbank进行Blastn比对，得到了变性梯度凝胶电泳图谱上各个条带所对应的微生物菌属信息，见表3所示。如表可知，所有条带的比对结果与数据库中序列的相似度不低于94%，因此可以确定这些条带代表的微生物菌属。3组样本的变性梯度凝胶电泳条带共检出16个微生物菌属，这些菌属在无龋组中均有检出。中龋组和高龋组分别检出13个和12个微生物菌属。在无龋组中检出较多的微生物菌属为Rothia spp.，Megasphaera spp.，Haemophilus spp.和Neisseria spp.，中龋组中检出较多的微生物菌属为Gemella spp.，Campylobacter spp.和Neisseria spp.，高龋组中检出较多的微生物菌属为Streptococcus spp.，Actinomyces spp.和Neisseria spp.。

2.4 不同龋敏感儿童GIC表面牙菌斑内链球菌属数量分布图4分别显示无龋组、中龋组和高龋组中某一样本牙菌斑微生物群落的荧光原位杂交图谱，如图可知，高龋组中Streptococcus spp.占总菌的比例最高，之后为中龋组，无龋组中Streptococcus spp.占总菌的比例较低。通过分析荧光原位杂交图谱上不同颜色的荧光面积，得到Streptococcus spp.占总菌的数量比例，高龋组Streptococcus spp.占总菌比例达到(37.60±7.85)%，之后是中龋组的(18.40±4.64)%，无龋组Streptococcus spp.占总菌比例仅为(11.30±2.68)%，统计学分析表明Streptococcus spp.占总菌比例的组间差异有显著性意义(P < 0.01)。

2.5 不同龋敏感儿童牙菌斑内Streptococcus mutans占总菌相对数量无龋组中Streptococcus mutans占总菌的相对数量最为(2.38±1.24)%，之后为中龋组(5.35±0.97)%，高龋组中Streptococcus mutans占总菌的数量可达(11.92±5.63)%，统计学分析表明Streptococcus mutans占总菌比例的组间差异有显著性意义(P < 0.01)。

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引言

20世纪70年代以来，玻璃离子水门汀(glass ionomer cement，GIC)的发明使口腔充填修复材料进入了一个高速发展时期。与磷酸锌水门汀、聚羧酸锌水门汀等传统口腔充填材料相比，GIC具有良好的生物相容性和较小的牙体刺激性。此外，GIC中具有较高的含氟量，可与牙齿中羟基磷灰石发生置换反应生成氟磷灰石，从而使其能够在黏结充填后长期释放氟离子，提高牙齿的抗酸性并抑制继发龋的产生与发展^[1]。但另一方面，GIC释放的氟离子仅能被动增加牙齿的抗龋能力，难以对致龋微生物产生直接抑制作用，导致经GIC充填后的牙体仍易发生继发龋现象^[2]。从根本上看，这是由于口腔微生物对充填材料具有一定的黏附作用，一段时间后在GIC材料表面形成了牙菌斑生物膜所造成。解析口腔充填材料(如GIC)表面牙菌斑生物膜内的微生物，对理解龋病的发生发展过程具有重要意义。以分布最广泛、发病率最高、危害最严重的儿童龋病为例，牙菌斑内微生物菌群组成及存在水平与儿童龋病的发展过程有密切关系^[3-5]。牙菌斑生物膜的微生物复杂性导致基于纯培养技术仅能鉴定其中极少数的可培养微生物。近年来，现代分子生态学在揭示复杂微生物群落的行为机制方面显示出巨大的技术优势，应用较多的技术包括变性梯度凝胶电泳、荧光原位杂交、实时定量PCR等^[8-10]。在本实验中，以上几种分子生态学技术被用于揭示儿童GIC表面牙菌斑内微生物群落结构和致龋微生物的数量变化趋势，对探明儿童龋病的微生物致病因素具有重要意义。

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材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

设计：体外检测实验。

时间及地点：于2013年2至11月在深圳市第二人民医院口腔内科实验室完成。

对象：在深圳民办幼儿园选择3-5岁儿童24名，其中男13名，女11名，口腔内均有GIC充填材料。根据WHO口腔健康调查基本方法第4版龋病诊断标准^[11]，按乳牙龋失补牙面指数(decayed, missing and filled，dmfs)不同分为无龋组(dmfs=0，n=8)、中龋组(dmfs=4-6，n=8)和高龋组(dmfs > 6，n=8)，所选儿童基本情况见表1所示。

所有入选儿童除龋外均无其他口腔疾病，全身健康，无全身系统性疾病及长期服药史(包括使用氟剂等)，取样前2周内未全身使用抗生素，2 h内未进食。在样品采集过程中，采用灭菌的滤纸纸尖采集GIC表面全口牙面菌斑，利用1 mL PBS反复冲洗滤纸纸尖后分别在15 000 r/min下离心5 min(离心半径10 cm)，收集沉淀。利用1 mL PBS清洗沉淀，在15 000 r/min下离心5 min(离心半径10 cm)，弃上清后将得到的牙菌斑样本分成2份，置于-80 ℃冻存。

实验方法：

GIC表面牙菌斑微生物基因组DNA的提取：将每名儿童的1份牙菌斑样本自然融化后，采用小量细菌基因组DNA快速抽提纯化试剂盒提取牙菌斑微生物的基因组DNA，具体操作方法依据试剂盒的使用说明书。采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测牙菌斑内微生物基因组DNA的提取效果。

16s rDNA基因片段的PCR扩增：采用大多数细菌16s rDNA V6-V8区的通用引物进行PCR扩增。引物BSF968GC

(5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3’)和BSR1401 (5’-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3’)^[12]，分别对应16s rDNA 968-984位和1 385-1 401位的核苷酸序列，扩增片段长度约470 bp。PCR反应体系(30 μL)如下：10×Ex Taq buffer (Mg²⁺) 3 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL，20 pmol/L正反引物各0.6 μL，模板DNA 100 ng，Ex Taq 0.2 μL，加水补足至30 μL。PCR反应程序采用降落PCR：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s， 72 ℃延伸30 s，每个循环退火温度降低0.1 ℃直至 51.5 ℃，35个循环，72 ℃最终延伸10 min。采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增效果。

PCR扩增产物的变性梯度凝胶电泳：采用Dcode^TM基因突变检测系统对PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳电泳检测。其中配制的聚丙烯酰凝胶浓度为6%。变性剂浓度梯度为30%到60%(100%的变性剂为7 mol/L尿素和40%去离子甲酰胺的混合物)。取PCR扩增产物5 μL和等量上样缓冲液混合后加入上样孔，在电泳温度60 ℃条件下，150 V电压下电泳6 h，电泳结束后，利用0.1%硝酸银溶液对凝胶进行银染染色，利用透射扫描仪进行染色后的凝胶扫描以获取变性梯度凝胶电泳图谱。

变性梯度凝胶电泳图谱目的条带的克隆测序：切取变性梯度凝胶电泳图谱上的目的条带，提取其中的DNA，作为PCR的模板进行PCR扩增。采用上海华舜生物工程有限公司的小量胶回收试剂盒进行PCR产物纯化，连接到PMD-19T载体上进行克隆测序，测序过程由上海生工生物工程有限公司完成。测序结果提交至GenBank数据库，利用Blastn算法进行测序结果的序列比对，确定各个条带所代表微生物的菌属信息。

GIC表面牙菌斑内微生物群落的荧光原位杂交分析：选取每名儿童的另一份牙菌斑样品，利用Streptococcus spp.特异性探针STR405 (5’-TAC CCG TCC CTT TCT GGT-3’，Cy5标记，红色)和细菌通用探针EUB338 (5’-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3’，FITC标记，绿色)进行牙菌斑内微生物群落的荧光原位杂交分析^[13]。将牙菌斑样品置于含 40 g/L多聚甲醛的PBS中4 ℃固定12 h。在37 ℃条件下，利用5 mg/L蛋白酶K和1.5 g/L溶菌酶将牙菌斑样品处理 30 min，以增加细胞的通透性。将牙菌斑样品移至载玻片上自然干燥，利用-20 ℃预冷的梯度乙醇(体积分数50%，80%，95%，100%)依次脱水。将2种探针各100 ng加入20 μL杂交液中(含0.9 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl、体积分数25%甲酰胺、体积分数0.1% SDS，pH 7.2)，滴于载玻片上牙菌斑样品处。将载玻片放置于湿盒内，在杂交炉内46 ℃杂交2 h。利用洗脱液(含20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA、159 mmol/L NaCl、体积分数0.1% SDS，pH 7.5)洗脱掉多余探针，在荧光显微镜下进行观测。

GIC表面牙菌斑微生物中Streptococcus mutans与总菌的定量PCR分析：利用基于SYBR Green的定量PCR进行牙菌斑微生物中致龋微生物Streptococcus mutans与总菌的相对定量分析。针对变形链球菌的引物为SMF (5’-GCC TAC AGC TCA GAG ATG CTA TTC T-3’)和SMR (5’-GCC ATA CAC CAC TCA TGA ATT GA-3’)，针对总菌的引物为BSF (5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’)和BSR (5’-ATT ACC GCG GCT GCT GGC-3’)^[14]，扩增产物长度分别为118 bp和196 bp。实时PCR过程利用SYBR^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ试剂盒进行，反应体系为：总体积20 μL，包含SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μL，25 μmol/L引物各 0.2 μL，模板DNA 0.5 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL，加灭菌去离子水至20 μL。将上述体系置于96孔板，置于于ABI 7500 FAST实时定量PCR仪上进行自动化扩增反应。PCR扩增标准程序为：95 ℃预变性10 s，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸31 s，共40个循环。每个反应重复3次取荧光强度平均值，进而确定变形链球菌与总菌的相对数量。

数据分析：采用quantity one 4.6软件进行变性梯度凝胶电泳图谱条带和荧光原位杂交图谱的数字化处理，采用Shannon-Wiener多样性指数和Simpson多样性指数表征牙菌斑内微生物的菌群丰度。利用SPSS 17.0软件对不同龋敏感儿童微生物指标的组间比较进行Newman-Keuls 检验，检验水准a=0. 05，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

龋病是一种由牙菌斑内包括致龋菌在内的多种细菌共同作用而导致的慢性感染性疾病。口腔内具有适宜的温度、湿度和丰富的营养来源，为口腔内多种微生物的生长繁殖提供了适宜环境，造成了口腔微生物的多样性与复杂性^[15-17]。研究表明口腔中大约寄居着700多种细菌，这些微生物在口腔不同部位生长、发育、衰亡，并进行复杂的物质代谢与能量代谢活动，其微生物群落结构演替与致龋菌的数量变化导致了龋病的发生和发展过程^[18-20]。在进行龋病预防、治疗、病因分析及疗效巩固时，准确快速地检测牙菌斑内微生物群落的多样性和动态性，进而探明导致龋病发生发展并影响预后转归的微生物特性成为预防及治疗龋病的重中之重^[21-22]。传统上采用的微生物检测分析方法一般依据细菌形态、生理生化特性及免疫血清分型，不但准确性差、费时费力，而且由于牙菌斑内能够被培养、分离和纯化的细菌不到50%，若以此来代表牙菌斑内的复杂微生物群落将导致极大的误差。近年来，现代分子生态学逐步发展，并被引入到口腔微生态学研究中，通过有效解析口腔内复杂微生物群落与重要的功能微生物菌群，将口腔微生物学研究领域带入了一个革命性的新时代^[23-30]。

在龋病形成的病因机制方面，目前存在3个学说，即菌斑特异性假说，非菌斑特异性假说和菌斑生态假说^[31]。菌斑特异性假说提出只有少数特异性菌种，如Streptococcusmutans和Streptococcus sobrinus在龋病发展中起积极的作用，非菌斑特异性假说主张龋是多种较活跃的细菌共同作用的结果，而菌斑生态假说则认为与龋相关的细菌基本都是口腔正常菌群, 因局部口腔环境变化致使微生态失衡, 从而成为条件致病菌而引起龋病^[32-33]。本实验通过分子生态学技术发现：在牙菌斑中不是单独一种特异细菌，而是一组微生物功能菌群与龋病的发生有显著性关系。牙菌斑中多种细菌相互作用，使整个微环境从平衡向生态失调发展，最终形成龋病。

在本实验中，通过对不同龋敏感儿童牙菌斑内微生物群落的变性梯度凝胶电泳分析，以及基于变性梯度凝胶电泳图谱的条带数量，Shannon-Wiener多样性指数和Simpson多样性指数分析，可以发现无龋组儿童牙菌斑样品内微生物群落结构最为复杂，具体表现为微生物多样性丰富，大多数菌群在微生物群落中的相对数量较少，而中龋组和高龋组的微生物群落较为简单，这个研究与之前研究结论相一致，Li等^[34]采用变性梯度凝胶电泳技术研究了重症早期龋患儿口腔中微生物群落结构，结果表明相对于重症早期龋患儿，无龋儿童菌斑中微生物群落结构更加复杂。刘怡然等^[35]采用变性梯度凝胶电泳技术检测早期儿童龋治疗前后口腔菌群多样性。结果表明治疗前唾液样本变性梯度凝胶电泳条带数显著少于治疗后，且该差异有非常显著性意义(P < 0.01) 。以上研究表明，种群类型丰富的牙菌斑微生物群落往往不会导致龋病的发生。

另一方面，若多种微生物在牙菌斑内保持的动态平衡被打破，微生物类群之间原有的种间协同或拮抗作用逐渐减弱，此时即会导致微生物菌群失调，使其中的致龋菌等微生物大量富集，从而使此处位点向龋病状态转化^[36]。在本实验中，中龋组和高龋组样品中均出现了某些微生物的大量富集作用，这些微生物可能在龋病的发生发展过程中起关键作用。从口腔微环境改变的角度而言，龋病的进展过程中牙菌斑会逐渐酸化。随着牙菌斑pH值的不断降低，只有能耐受低pH值的细菌能在酸性条件下存活而不断增殖，这些微生物往往具有利用碳水化合物进行产酸的能力，进一步加速了龋病的发展过程^[37]。

通过对变性梯度凝胶电泳图谱的序列测定及比对，可以得知其中与龋病发展过程密切相关的功能微生物。Streptococcus spp.和Actinomyces spp.在高龋组中大量存在，可能是导致龋病的关键微生物种群。而在荧光原位杂交图谱中，Streptococcus spp.在无龋组、中龋组和高龋组中数量比例亦呈现逐渐升高的趋势。研究表明：Streptococcus spp.为革兰阳性产酸菌，能很快酵解糖产酸，由于其产酸速度较口腔中其他细菌快，因而一直以来的研究都认为Streptococcus spp.与龋病关系密切^[38-39]。此外，其中的Streptococcus spp.中的Streptococcus oralis、Streptococcus mitis、Streptococcus sobrinus、Streptococcus mutans等常被认为是口腔中最早定植的“先锋菌”，这些链球菌菌种亦具有相应的致龋能^[40]。在Actinomyces spp.中，Actinomyces viscosus和Actinomyces naeslundii是早已证实的关键致龋菌^[41]。此外，有研究报道认为Actinomyces spp.和Streptococcus spp.一起参与对牙釉质的第一阶段黏附作用，对龋病的发生起重要作用。由于Actinomyces spp.是厌氧性细菌，在菌斑形成后优先选择寄宿到菌斑的深处缺氧层，同时在缺氧的环境下能产生乳酸，因此能作用于牙釉质产生脱矿化作用，进而慢慢腐蚀牙齿^[42]。

此外，Neisseria spp.在3组牙菌斑样本中都大量检出，目前，Neisseria spp.与龋病的关系尚不很清楚，由于一些Neisseria spp.能产酸，其产生的多糖荚膜可以使无荚膜的细菌集聚，有研究表明Neisseria spp.与致龋菌Streptococcus mutans可相互集聚^[43-44]。此外，奈瑟菌还可以促进厌氧菌的生长。因此认为Neisseria spp.可能普遍存在于牙菌斑中，对菌斑的形成和龋病的发生中起了一定作用。无龋组、中龋组和高龋组中还有Veillonella spp.和Lactobacilla spp.检出。研究表明，Veillonella spp.的数量和Streptococcus spp.数量有着非常密切的联系，Veillonella spp.中的一些种，比如Villonella alcalescens可以与Streptococcus mutans相互促进，加速龋病的形成^[45-46]。Lactobacilla spp.和Streptococcus spp.同属于厌氧产酸菌，被认为是引起龋病的主要细菌，在先前一些研究中发现大量Lactobacilla spp.和Streptococcus spp.存在于龋病中^[47]。

此外，本实验采用实时定量PCR考察不同龋敏感儿童牙菌斑样本内Streptococcusmutans占总菌的相对数量，可知高龋组中Streptococcus mutans占总菌的数量最高，其次为中龋组，无龋组中Streptococcus mutans的数量最少。变异链球菌做为龋病的主要致病菌，其致龋机制已基本明确^[48-49]，其存在数量已成为龋齿活跃性评估以及疾病状态检测的指标^[50-58]。梁景平等^[14]利用实时定量PCR对牙菌斑中Streptococcus mutans进行定量检测，发现Streptococcus mutans在高龋组中占总菌的比例高于无龋组(P < 0.01)，说明实时定量PCR可作为一种有效的细菌定量检测手段应用于致龋菌的定量分析过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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