偏磷酸钙纳米粒子的细胞相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.015

中国组织工程研究

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偏磷酸钙纳米粒子的细胞相容性

吴岳恒¹，麦丽萍¹，陈鹏²，张灵敏²，黄焕雷¹，曾祥君¹，汤顺清²，肖学钧¹，余细勇¹

1广东省医学科学院广东省心血管病研究所、广东省人民医院医学研究部，广东省广州市 510100；2暨南大学生物医学工程研究所，广东省广州市 510632

收稿日期:2013-01-22 修回日期:2013-06-25 出版日期:2013-09-17 发布日期:2013-09-17
通讯作者: 余细勇，教授，博士生导师，广东省医学科学院、广东省人民医院医学研究部，广东省广州市 510100 yuxycn@hotmail.com
作者简介:吴岳恒★，男，1980年生，湖南省株洲市人，汉族，2005年暨南大学毕业，硕士，助理研究员，主要从事心室辅助装置研究，生物材料和组织工程研究。 edgar_wu@yahoo.com.cn
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(30901468)*

Cytocompatibility of calcium metaphosphate nanoparticles

Wu Yue-heng¹, Mai Li-ping¹, Chen Peng², Zhang Ling-min², Huang Huan-lei¹, Zeng Xiang-jun¹, Tang Shun-qing², Xiao Xue-jun¹, Yu Xi-yong¹

1Medical Research Center of Guangdong General Hospital, Guangdong Provincial Cardiovascular Institute, Guangdong Academy of Medical Science, Guangzhou 510100, Guangdong Province, China; 2Institute of Biomedical Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China

Received:2013-01-22 Revised:2013-06-25 Online:2013-09-17 Published:2013-09-17
Contact: Yu Xi-yong, Professor, Doctoral supervisor, Medical Research Center of Guangdong General Hospital, Guangdong Provincial Cardiovascular Institute, Guangdong Academy of Medical Science, Guangzhou 510100, Guangdong Province, China yuxycn@hotmail.com
About author:Wu Yue-heng★, Master, Assistant researcher, Medical Research Center of Guangdong General Hospital, Guangdong Provincial Cardiovascular Institute, Guangdong Academy of Medical Science, Guangzhou 510100, Guangdong Province, China edgar_wu@yahoo.com.cn
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30901468*

摘要/Abstract

摘要：

背景：偏磷酸钙具有优异的细胞相容性能和降解性能及细胞亲和性，人骨髓间充质干细胞可以在多孔偏磷酸钙孔洞内生长和增殖，但有关偏磷酸钙纳米粒子的研究较少。
目的：制备纳米级偏磷酸钙微粒，通过流式细胞术快速检测不同浓度纳米级偏磷酸钙微粒对人骨髓间充质干细胞凋亡的影响。
方法：采用湿法球磨法制备偏磷酸钙纳米粒子，通过扫描电镜和透射电镜观察纳米粒子的形貌，通过X射线衍射分析确定纳米粒子的晶体结构。将偏磷酸钙纳米粒子混入CYAGON OricellTM 基础培养基，使得偏磷酸钙纳米粒子的质量浓度分别为10，1，0.1 mg/L，将其与人骨髓间充质干细胞共培养7 d，通过流式细胞术分析偏磷酸钙纳米粒子质量浓度与细胞凋亡的关系。
结果与结论：采用湿法球磨法成功制备了偏磷酸钙纳米粒子，直径为10-30 nm，粒径分布较均匀，分散性较好，但晶体形状不规则；X射线衍射分析晶相检测其主晶相为β-Ca(PO3)2晶体。10 mg/L质量浓度组细胞G0/G1和G2/M比例高于1，0.1 mg/L质量浓度组(P < 0.01)；10 mg/L质量浓度组细胞早期、中晚期、总细胞凋亡率高于1，0.1 mg/L质量浓度组(P < 0.01)；说明偏磷酸钙纳米粒子对人骨髓间充质干细胞的增殖有影响，当其质量浓度从1 mg/L增加至10 mg/L后，细胞凋亡率显著增加。

关键词: 生物材料, 纳米生物材料, 偏磷酸钙, 纳米粒子, 流式细胞术, 凋亡率, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Calcium metaphosphate has excellent biocompatibility, degradability, and cell affinity. Human bone marrow mesenchymal stem cells can grow and proliferate in the pores of the porous calcium metaphosphate, but less is known about calcium metaphosphate nanoparticles.
OBJECTIVE: To prepare calcium metaphosphate nanoparticles, and to analyze the effect of calcium metaphosphate nanoparticles at different concentrations on apoptosis of human bone marrow mesenchymal stem cells by flow cytometry.
METHODS: The calcium metaphosphate nanoparticles were prepared by wet ball milling. Scanning electron microscopy and transmission electron microscopy were used to observe the morphology of the calcium metaphosphate nanoparticles, and the crystal structure of nanoparticles was analyzed by X-ray diffraction. Calcium metaphosphate nanoparticles were mixed in the CYAGON OricellTM basal medium, and the ncentrations of calcium metaphosphate nanoparticles in the medium were 10, 1, 0.1 mg/L. Human bone marrow mesenchymal stem cells were cultured for 7 days in the above-mentioned media, and apoptosis of human bone marrow mesenchymal stem cells was analyzed by flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: Calcium metaphosphate nanoparticles were successfully prepared by wet ball milling, irregular in shape, and the mean diameter was 10-30 nm. X-ray diffraction results showed the crystal structure of nonaparticles was mainly β-Ca(PO3)2. The cell ratio of G0/G1 phase and G2/M phase in 10 mg/L group was obviously higher than that in 1, 0.1 mg/L groups (P < 0.01). The cell apoptosis rates during the early, middle, late stages in 10 mg/L group were obviously higher than those in 1, 0.1 mg/L groups (P < 0.01), and the total cell apoptosis was also significantly increased in 10 mg/L group (P < 0.01). These findings indicate that human bone marrow mesenchymal stem cells proliferation can be inhibited by calcium metaphosphate nanoparticles, and apoptosis rate is increased significantly when the concentration of calcium metaphosphate nanoparticles increases from 1 mg/L to 10 mg/L.

Key words: biocompatible materials, nanoparticles, calcium phosphates, histocompatibility

中图分类号:

R318

吴岳恒，麦丽萍，陈鹏，张灵敏，黄焕雷，曾祥君，汤顺清，肖学钧，余细勇. 偏磷酸钙纳米粒子的细胞相容性[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.015.

Wu Yue-heng1, Mai Li-ping1, Chen Peng2, Zhang Ling-min, Huang Huan-lei, Zeng Xiang-jun,Tang Shun-qing, Xiao Xue-jun, Yu Xi-yong. Cytocompatibility of calcium metaphosphate nanoparticles[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.38.015.

图/表（结果） 6

2.1 扫描电镜下偏磷酸钙材料的表面形貌观察图1为偏磷酸钙纳米粒子的表面形貌，可见粒子已达纳米级，但扫描电镜无法清楚的观察到偏磷酸钙纳米粒子的粒径。

2.2 透射电镜下纳米粒子的表面形貌图2为偏磷酸钙纳米粒子的透射电镜表面形貌，由图可知，其纳米直径主要由10-30 nm构成，粒径分布较均匀，且其分散性较好；晶体形状不规则，提示偏磷酸钙纳米粒子结晶度较差。

2.3 偏磷酸钙纳米粒子X射线衍射晶相检测结果样品的X射线衍射图见图3，其三强线的d1，d2，d3值(晶面间距)均分别为0.352，0.313，0.372 nm。查PCPDFWIN数据库可知其主晶相为β-Ca(PO3)2晶体。

2.4 偏磷酸钙纳米粒子的细胞相容性检测结果倒置相差显微镜下观察人骨髓间充质干细胞，接种1 d即贴壁，去除悬浮细胞后继续培养3 d贴壁细胞开始增殖。原代细胞呈椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等。第3-5代细胞呈均匀一致的长梭型，排列成旋涡状或放射状，细胞生长状态良好。
图4为人骨髓间充质干细胞的流式细胞鉴定结果，CD44、CD90、CD105和 CD73的阳性率分别为(97.41±0.52)%，(7.18±0.25)%，(93.24±1.01)%和(99.14±0.22)%；CD45和CD34的阳性率分别为(0.45±0.09)%和(0.31±0.12)%。

纳米粒子的细胞毒性检测主要考察了偏磷酸钙纳米粒子对人骨髓间充质干细胞凋亡和细胞周期的影响。图5是人骨髓间充质干细胞分别在含高(10 mg/L)、中 (1 mg/L)和低(0.1 mg/L)质量浓度纳米粒子的培养基中培养7 d后，细胞凋亡的测量结果。

对图5的数据进行方差分析发现，高、中、低质量浓度组及空白对照组间的细胞中晚期凋亡率、早期凋亡率和总凋亡率的比较差异有显著性意义(P < 0.01)。进一步采用S-N-K检验对高、中、低质量浓度组及空白对照组之间分别进行两两比较，结果发现高质量浓度组细胞中晚期凋亡率、早期凋亡率和总凋亡率与空白对照组、低质量浓度组和中质量浓度组之间的比较差异有显著性意义(P < 0.01)，空白对照组、低质量浓度组和中质量浓度组之间比较差异无显著性意义。
图6是人骨髓间充质干细胞分别在含高(10 mg/L)、中(1 mg/L) 和低(0.1 mg/L)质量浓度偏磷酸钙纳米粒子的培养基中培养7 d后，细胞周期的测量结果。对图6的数据进行方差分析发现，高、中、低质量浓度组及空白对照组的细胞G0/G1和G2/M期比例比较差异有显著性意义(P < 0.01)，高、中、低质量浓度组及空白对照组细胞S期比例的比较差异无显著性意义(P=0.503)。进一步采用S-N-K检验对高、中、低质量浓度组及空白对照组之间细胞G0/G1、G2/M期的比例分别进行两两比较，结果发现，高质量浓度组与空白对照组、低质量浓度组、中质量浓度组之间的细胞G0/G1比例比较差异有显著性意义(P < 0.01)，空白对照组、低质量浓度组和中质量浓度组两两之间的G0/G1比例比较差异无显著性意义。高质量浓度组细胞G2/M比例与空白对照组、低质量浓度组、中质量浓度组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，空白对照组、低质量浓度组和中质量浓度组两两之间的细胞G2/M比例比较差异无显著性意义。

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引言

纳米生物技术是国际生物技术领域的前沿和热点问题，但其安全问题也是当今限制其医疗应用的瓶颈，故非常有必要研究纳米粒子的细胞相容性及机制^[1-3]。无机纳米颗粒具有独特的结构和性能，以及良好的稳定性、单分散性、产量高、成本低等优势^[4]。常见的无机纳米粒子主要包括纳米氧化物、纳米复合氧化物、纳米金属及合金，以及其他无机纳米材料等，在药物载体研发领域具有以下作用：靶向分布于病变组织；对治疗性药物进行持续性控释；通过各种给药途径进入体内。如有研究设计出具有独特中空、介孔结构的夹心二氧化硅纳米材料作为抗肿瘤药物的载体，用于包裹多烯紫杉醇、盐酸阿霉素、米托蒽醌等十几种抗肿瘤药物，所制备的药物载体不良反应小，肿瘤抑制率得到提高，可望在肝癌、乳腺癌、脑胶质瘤等多种恶性肿瘤的治疗上取得重大疗效^[5]。

此外，无机纳米颗粒还可应用于诸多方面，例如药物转运、疾病诊断和探索生物标记等^[6-8]。如Fan等^[9]设计了一种铁蛋白纳米粒用于恶性肿瘤的早期诊断，这种铁蛋白纳米粒是由氧化铁纳米内核及铁蛋白外壳两部分组成的双功能纳米小体，蛋白壳能够特异识别肿瘤细胞，氧化铁纳米内核能够催化底物使肿瘤显色，区分正常细胞和肿瘤细胞。也有大量文献报道无机纳米粒子作为非病毒载体用于基因转染，能包裹、浓缩、保护核酸避免核酸酶的降解，并可介导目的基因在靶细胞内表达等^{[7, 10]}。应用于基因转运的无机纳米粒子主要包括硅、铁氧化物、碳纳米管、磷酸钙、层状双氢氧化物、金属纳米粒子等^[11-12]，应用最广泛的是磷酸钙纳米粒子^[13]，如Yang等^[14]用磷酸钙纳米粒子作为基因载体，诱导了鼠牙髓干细胞中骨成形素蛋白2的转染，实验结果表明结合了质粒DNA的磷酸钙纳米粒子转染率很高。

偏磷酸钙β-Ca(PO₃)₂是一种组织工程支架材料，大量研究均证明其具有非常优异的细胞相容性能和降解性能。Park 等^[15]在其自制的偏磷酸钙块表面接种人骨髓间充质干细胞细胞，并进行了细胞毒性实验、增殖实验、形态学分析和基因表达监测，实验结果表明细胞与材料表面结合紧密。Lee 等^[16]研究了多孔偏磷酸钙的降解速率，其植入无胸腺小鼠皮下8周后即可降解完全。这些研究均肯定了偏磷酸钙优异的生物相容性、降解性能和力学性能，故偏磷酸钙常被应用于现有生物材料的细胞亲和性改性。如Cho等^[17]以偏磷酸钙改性牙种植体，1年的评价实验证明其种植效果与传统的可吸收性研磨介质法相似。

作者所在课题组也证明偏磷酸钙具有优异的细胞相容性能和降解性能，制备了不同粒度大小200 nm-50 μm的偏磷酸钙微粒和偏磷酸钙块，并率先研究了细胞在多孔偏磷酸钙和羟基磷灰石孔洞内外生长增殖的差异。研究结果显示：①体外降解性能^[18]：在静态和不同流场下，偏磷酸钙的降解形为显示巨大的差异，如静态下28 d失重率仅为9.2%，而流速为0.17 m/s下，3 d失重率即为12.5%。②细胞毒性^[19]：利用ICP分析偏磷酸钙降解产物的组成元素，同时采用MTT、碱性磷酸酶活性检测及茜素红染色对降解产物的毒性效应进行检测，验证了偏磷酸钙降解产物的生物相容性。③细胞亲和性^[20]：将人骨髓间充质干细胞等细胞种植在多孔偏磷酸钙和羟基磷灰石表面，扫描电镜结果证实人骨髓间充质干细胞在偏磷酸钙和羟基磷灰石表面生长良好，且人骨髓间充质干细胞能在偏磷酸钙孔洞(直径约200 nm)里大量生长，羟基磷灰石孔洞内未发现，这显示出偏磷酸钙具有非常优异的细胞亲和性。

但有关偏磷酸钙纳米粒子的研究较少，普通球磨法无法获得低于100 nm的纳米粒子，制约了偏磷酸钙的应用研究。实验通过湿法球磨法制备了偏磷酸钙纳米粒子，并初步考察了其质量浓度与人骨髓间充质干细胞凋亡和细胞增殖的关系，探讨其细胞相容性。

材料方法

设计：生物相容性材料的制备及对比观察实验。

时间及地点：于2012年3至5月在广东省人民医院医学研究中心和暨南大学生物医学工程研究所完成。

材料：偏磷酸钙纳米粒子在暨南大学生物医学工程研究所制备，人骨髓间充质干细胞在广东省人民医院医学研究部分离、鉴定和培养。

偏磷酸钙纳米粒子细胞相容性实验的主要试剂与仪器：

实验方法：

人骨髓间充质干细胞的制备：经患者知情同意，于骨折患者健康椎体取得骨髓2 mL，接种于25 cm²培养瓶，以成人骨髓间质干细胞完全培养基培养48 h换液，以后隔天换液；待细胞生长至约80%融合后，0.25%胰蛋白酶消化传代。倒置显微镜下观察细胞生长状态；取第3代进行流式细胞术检测细胞表面标记。

偏磷酸钙玻璃陶瓷的制备：原料由CaO、P₂O₅和添加剂按一定比例构成，混匀后于1 000 ℃下熔融，于蒸馏水中淬冷成玻璃颗粒，干燥后转移至XQM行星球磨仪中磨成细粉，即得偏磷酸钙玻璃原粉。将偏磷酸钙玻璃原粉与水混匀至黏稠浆状后转移至马福炉中，以10 ℃/min的升温速度升至650 ℃恒温4 h，冷却至室温后即为偏磷酸钙玻璃陶瓷。

偏磷酸钙纳米粒的制备：将所制备的偏磷酸钙玻璃陶瓷置于XQM行星球磨仪中，加入少量的去离子水，球磨12 h。取球磨后的微粒，差速离心(半径15 cm水平转子)，速度分别取1 000，3 000，10 000 r/min，5 min。取 10 000 r/min的溶液置于LGJ-12冷冻干燥机，干燥至成粉状，所得样品即为偏磷酸钙纳米粒子。

纳米粒子的结构与性能表征：取适量偏磷酸钙纳米粒子贴于铜台表面，喷金后在XL-30ESEM扫描电子显微镜下观察；取适量偏磷酸钙纳米粒子仔细研磨，以乙醇作为分散剂超声分散后，吸取悬浮液置于铜网，自然干燥，采用H-7650透射电子显微镜观测粒子的粒径、形貌及分散性；取破碎研磨后的偏磷酸钙纳米粒若干，压片后在MSAL XD-2型X射线衍射仪上进行晶相分析，测试条件：电压40 kV，管流25 mA，Cu靶波长Kα= 0.154 06 nm，扫描范围(2θ)为5°-65°。

纳米粒子的细胞相容性检测：

细胞培养：将偏磷酸钙纳米粒子定量混入到培养基，制备3种具有不同纳米粒子浓度的培养基，分别为高质量浓度10 mg/L、中质量浓度1 mg/L和低质量浓度0.1 mg/L培养基。人骨髓间充质干细胞培养至第3代后，当培养板中细胞铺满至60%-70%时，以上述含不同质量浓度纳米粒子的培养基替代现在培养基，每2 d换液1次，共培养7 d。

流式细胞术检测细胞凋亡和细胞增殖：将需分析的目标细胞制成单细胞悬液，每管细胞量10⁵-10⁶个。①采用AnnexinV/PI复染法检测细胞凋亡：用PBS洗2次，4 ℃、1 000 r/min离心5 min。将细胞重悬于100 µL Binding Buffer，加入rhAnnexin-V FITC 5 µL，室温避光10 min，4 ℃、1 000 r/min离心5 min，将细胞重悬于190 µL Binding Buffer，再加入20 µL PI 10 µL，避光反应5 min后，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1 h)，同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。②采用PI标记法检测细胞周期：体积分数75%乙醇(-20 ℃预冷)固定细胞1 h，加入终质量浓度50 mg/L PI和无DNA酶污染的RNA酶(终浓度 50 mg/L)1 mL染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。

主要观察指标：偏磷酸钙纳米粒子的扫描电镜、透射电镜表面形貌和晶相检测；偏磷酸钙纳米粒子质量浓度与人骨髓间充质干细胞细胞周期和凋亡的关系。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，由第一作者使用SPSS 13.0，组间差异比较采用单因素方差分析和S-N-K检验，P < 0.01为差异有显著性意义。

讨论

偏磷酸钙的主要成分是钙和磷元素，同时含有钙和磷的生物材料主要有磷酸三钙、羟基磷灰石等^[21]。这些生物材料通常不能降解或降解比较慢^[22]，但偏磷酸钙有较好的降解性能，将偏磷酸钙复合至其他生物材料表面，可显著提高其结合细胞的能力。钙磷生物材料可制备成纳米态，已被应用于药物/基因载体、疾病诊断和探索生物标记等领域，但偏磷酸钙的纳米化较困难，研究较少。

3.1 偏磷酸钙偏磷酸钙纳米粒子的制备偏磷酸钙晶体主要有两种晶体形式，分别为α型和β型，偏磷酸钙晶体分子式为Ca(PO₃)₂，α型稳定性较差，β型稳室性较好^[23]。偏磷酸钙的常用制备方法非常简单，磷酸二氢钙109 ℃时失去结晶水，203 ℃时则分解成偏磷酸钙，但所制备的β型偏磷酸钙结晶度高，晶体大，可成晶须，强度高，降解性能差，如有人将其制备成晶须作为增强材料应用于生物材料领域。通过粉末烧结法可获得大量有缺陷的微晶(也称玻璃陶瓷)偏磷酸钙^[24]。微晶偏磷酸钙含有大量的β-Ca(PO₃)₂小晶体，小晶体发育有缺陷，可用来制备纳米偏磷酸钙。课题组前期研究发现所制备的微晶偏磷酸钙有一定的韧性，通过普通球磨方法仅可获得直径200 nm以上的微粒。球磨是指利用研磨体(如钢球、锆石等)的冲击作用以及研磨体与球磨内壁的研磨作用将物料粉碎并混合的方法^[25]。通常可分为干法球磨与湿法球磨两种。湿法球磨可提高粉磨效率，使粉体粒径减小，比表面积增加，活性增强，是常用的无机纳米粒子制备方法之一，故实验采用湿法球磨法制备纳米偏磷酸钙。

纳米粒子干燥时易发生团聚^[26]，通常可分为软团聚和硬团聚两种。软团聚主要是粒子间通过范德华力聚集在一起，可以用一些物理化学手段将它们分开；硬团聚主要是粒子间形成共价键而聚集在一起，这种聚集较难分开。偏磷酸钙降解产物主要为磷酸二氢钙及其水合物，为避免纳米偏磷酸钙团聚，故实验采用超声分散和冷冻干燥技术实现纳米偏磷酸钙的分离。从透射电镜图片可以看出所获得的纳米偏磷酸钙直径10-30 nm，偏磷酸钙晶体形状不均匀，表面积大，结晶度较差，这有利于纳米偏磷酸钙的降解和药物(包括基因、蛋白等)的吸附。通过X射线衍射检测证明所得纳米粒子为β-Ca(PO₃)₂晶体。这些结果均证明，通过上述方法成功制备了纳米偏磷酸钙。

3.2 人骨髓间充质干细胞的分离和鉴定人骨髓间充质干细胞是一类非造血干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能，实验证实人骨髓间充质干细胞具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及神经细胞等分化的能力。目前，人骨髓间充质干细胞在增殖过程中主要存在增殖潜力和多向分化潜力逐渐丧失的问题^[27]，尤其对微环境敏感，极易发生自分化现象，而人血清、生长因子、细胞外基质培养基、生物反应器和中药等微环境调节逐渐成为此类研究的热点^[28-29]。故分离培养的人骨髓间充质干细胞通常需要进行一定的鉴定。

鉴定人骨髓间充质干细胞的方法主要有免疫细胞化学法及流式细胞仪法^[30]，实验主要通过流式细胞仪法鉴定人骨髓间充质干细胞。目前人骨髓间充质干细胞表面标记还没有一个比较公认的标准^[31]，CD34、CD45、CD44、CD31、CD80、CD86、CD73、CD105和CD90等是比较常用的细胞表面标志物。通常认为阳性的表面标记有CD44、CD90、CD105和 CD73，阴性的表面标记有CD45、CD31和CD34。结果显示实验所培养的第3代细胞与文献中的人骨髓间充质干细胞表面标记规律一致^[32]，所获得的细胞经鉴定为人骨髓间充质干细胞。

3.3 偏磷酸钙纳米粒子对人骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响纳米生物技术是国际生物技术领域的前沿和热点问题，但其安全问题也是当今限制其医疗应用的瓶颈^[33]。任何新型纳米颗粒应用于人体之前，必须评估它们潜在的毒性。偏磷酸钙玻璃陶瓷虽然有着较好的生物相容性和降解性能^[34-35]，但其纳米状态的细胞毒性仍不清楚。细胞毒性是化学物质(药物、材料、光、热等)作用于细胞基本结构和/或生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖和/或功能的紊乱所引发的不良反应^[36-37]。实验将偏磷酸钙纳米粒子与人骨髓间充质干细胞共培养，考察其细胞毒性，具体通过流式细胞术定量研究偏磷酸钙纳米粒子对人骨髓间充质干细胞增殖及凋亡的影响，为偏磷酸钙纳米粒子的载体应用提供了必要的数据支持。

综合图4和图5数据的统计学结果可以分析出：较低质量浓度的偏磷酸钙纳米粒子(小于1 mg/L)基本不影响人骨髓间充质干细胞增殖及凋亡，当培养基中偏磷酸钙纳米粒子的质量浓度从1 mg/L增加至10 mg/L后，细胞增殖得到了明显抑制，并且主要抑制于G₂期，同时其细胞凋亡率也显著增大，这提示偏磷酸钙纳米粒子对人骨髓间充质干细胞的中毒浓度在1 mg/L至10 mg/L间，可通过进一步实验明确其量效关系和增殖及凋亡机制。实验的开展为其作为基因载体的应用研究提供了必要的数据支持。

从上述实验结果可知制备的偏磷酸钙纳米粒子毒性低，制备简易，保存方便，具有良好的生物相容性和可降解性，有利于基因载体的应用。此外，通过添加无机粒子增强高分子材料是传统的材料改性方法，如二氧化硅增强硅橡胶，生物材料中也常有羟基磷灰石改性可降解材料的报道^[38-39]。实验中所报道的偏磷酸钙可降解，其纳米粒子晶体发育有缺陷，结晶度较差，这有利于其对组织工程支架材料的改性，尤其可改善组织工程支架材料的细胞相容性。此外，生物材料作为一种微环境参数可调节细胞的增殖、分化和凋亡^[40]。综上可知，实验所开发的纳米偏磷酸钙有望在上述领域，尤其在基因载体、干细胞干性维持和定向分化领域起到积极的作用。

实验成功制备了偏磷酸钙纳米粒子；初步获得纳米粒子浓度对人骨髓间充质干细胞的增殖影响，当其纳米粒子质量浓度从1 mg/L增加至10 mg/L后，细胞凋亡率显著增大。

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偏磷酸钙晶体主要有两种晶体形式，分别为α型和β型，偏磷酸钙晶体分子式为Ca(PO₃)₂，α型稳定性较差，β型稳室性较好。偏磷酸钙的常用制备方法非常简单，磷酸二氢钙109℃时失去结晶水，203℃时则分解成偏磷酸钙，但所制备的β型偏磷酸钙结晶度高，晶体大，可成晶须，强度高，降解性能差，如有人将其制备成晶须作为增强材料应用于生物材料领域。通过粉末烧结法可获得大量有缺陷的微晶（也称玻璃陶瓷）偏磷酸钙。微晶偏磷酸钙含有大量的β-Ca(PO₃)₂小晶体，小晶体发育有缺陷，可用来制备纳米偏磷酸钙。课题组前期研究发现所制备的微晶偏磷酸钙有一定的韧性，通过普通球磨方法仅可获得直径200nm以上的微粒。球磨是指利用研磨体（如钢球、锆石等）的冲击作用以及研磨体与球磨内壁的研磨作用将物料粉碎并混合的方法。通常可分为干法球磨与湿法球磨两种。湿法球磨可提高粉磨效率，使粉体粒径减小，比表面积增加，活性增强，是常用的无机纳米粒子制备方法之一，故实验采用湿法球磨法制备纳米偏磷酸钙。纳米粒子干燥时易发生团聚，通常可分为软团聚和硬团聚两种。软团聚主要是粒子间通过范德华力聚集在一起，可以用一些物理化学手段将它们分开；硬团聚主要是粒子间形成共价键而聚集在一起，这种聚集较难分开。偏磷酸钙降解产物主要为磷酸二氢钙及其水合物，为避免纳米偏磷酸钙团聚，故是呀采用超声分散和冷冻干燥技术实现纳米偏磷酸钙的分离。从透射电镜图片可以看出所获得的纳米偏磷酸钙直径10-30nm，偏磷酸钙晶体形状不均匀，表面积大，结晶度较差，这有利于纳米偏磷酸钙的降解和药物（包括基因、蛋白等）的吸附。通过X射线衍射检测证明所得纳米粒子为β-Ca(PO₃)₂晶体。这些结果均证明，通过上述方法成功制备了纳米偏磷酸钙。

偏磷酸钙纳米粒子的细胞相容性

Cytocompatibility of calcium metaphosphate nanoparticles

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