内源性骨髓间充质干细胞与骨折微环境中的相关趋化因子

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.019

中国组织工程研究

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内源性骨髓间充质干细胞与骨折微环境中的相关趋化因子

张宪彧1，汪炜2，陈伟3，陈建梅4，徐皓4

1上饶市人民医院骨科，江西省上饶市 334000；2江西医学院上饶分院病理教研室，江西省上饶市 334000；3福州市第二医院骨科，福建省福州市 350007；4解放军南京军区福州总医院骨科，福建省福州市 350002

收稿日期:2012-11-12 修回日期:2012-12-16 出版日期:2013-07-02 发布日期:2013-07-02
通讯作者: 徐皓，主任医师，教授，硕士生导师，解放军南京军区福州总医院骨科，福建省福州市 350025 xiuhao@medmail.com.cn
作者简介:张宪彧★，男，1980年生，江西省上饶市人，汉族，2008年福建医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事骨科方面的研究。50360042@qq.com
基金资助:
福建省自然科学基金计划资助项目“内源性骨间充质干细胞向骨折部位定向迁移机制及调控研究”(基金项目编号：2007J0110)；全军医药卫生科研基金课题“调控基质细胞衍生因子1/CXCR-4 促进神经样BMSCs 定向迁移修复脊髓损伤的实验研究”(课题编号：07Z037)。南京军区“十一﹒五”医药卫生科研基金项目“调控基质细胞衍生因子1/CXCR-4 促进神经样BMSCs 定向迁移修复脊髓损伤的实验研究”(课题编号：06MA145)。

Autologous bone marrow mesenchymal stem cells and related chemokines in
fracture microenvironment

Zhang Xian-yu¹, Wang Wei², Chen Wei³, Chen Jian-mei⁴, Xu Hao⁴

1Department of Orthopedics, People’s Hospital of Shangrao, Shangrao 334000, Jiangxi Province, China; 2Department of Pathology, Shangrao Branch of Jiangxi Medical College, Shangrao 334000, Jiangxi Province, China; 3Department of Orthopedics, the Second Hospital of Fuzhou, Fuzhou 350007, Fujian Province, China; 4Department of Orthopedics, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Area Command of PLA, Fuzhou 350002, Fujian Province, China

Received:2012-11-12 Revised:2012-12-16 Online:2013-07-02 Published:2013-07-02
Contact: Xu Hao, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Area Command of PLA, Fuzhou 350002, Fujian Province, China xiuhao@medmail.com.cn
About author:Zhang Xian-yu★, Master, Attending physician, Department of Orthopedics, People’s Hospital of Shangrao, Shangrao 334000, Jiangxi Province, China 50360042@qq.com
Supported by:
the Natural Science Foundation of Fujian Province, No. 2007J0110*; the Military Medicine and Health Science Foundation of China, No. 07Z037*; Medicine and Health Science Foundation of Nanjing Military Area Command of PLA During the Eleventh Five-year Plan, No. 06MA145*

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明，骨髓间充质干细胞定向迁移依赖于损伤局部表达趋化因子与细胞表面相应受体的相互作用。然而，哪些趋化因子在介导骨髓间充质干细胞向骨折部位定向迁移过程中起关键作用，目前尚不清楚。
目的：对内源性骨髓间充质干细胞进行示踪，观察其在骨修复中的作用；检测并筛选出骨折微环境中表达量高且与骨髓间充质干细胞趋化规律相关的因子。
方法：建立C57BL/6小鼠荧光/普通骨髓嵌合体，利用嵌合体动物模型制造胫骨骨折模型，在不同时相点检测骨折部位组织绿色荧光蛋白阳性细胞占所有细胞的比例、来源于骨髓间充质干细胞的成骨细胞占全部成骨细胞的比例，判断来源于骨髓的骨髓间充质干细胞在骨折修复中的作用；利用免疫组化等方法检测骨折部位不同时相点趋化因子的蛋白表达水平。
结果与结论：骨折局部绿色荧光蛋白阳性细胞占所有细胞比例在术后1，5，14 d分别为(3.011±0.911)%，(9.031±0.145)%，(12.064±0.145)%；来源于骨髓间充质干细胞的成骨细胞占全部成骨细胞的50%以上；骨折后各时相点微环境中基质细胞衍生因子1、集落刺激因子、肝细胞生长因子、单核细胞趋化蛋白1、间质金属蛋白酶9有不同程度的表达，粒细胞集落刺激因子无明显表达。基质细胞衍生因子1的表达量相对最高。经相关分析认为：基质细胞衍生因子1在骨折微环境中的表达与骨髓间充质干细胞趋化规律具有相关关系。结果表明骨髓内的骨髓间充质干细胞参与骨折修复并在其中起到了重要作用；基质细胞衍生因子1促进骨髓间充质干细胞的定向趋化并参与骨组织的修复。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 绿色荧光蛋白, 骨髓间充质干细胞, 嵌合体, 骨折, 趋化因子, 基质细胞衍生因子1, 集落刺激因子, 肝细胞生长因子, 单核细胞趋化蛋白1, 间质金属蛋白酶9, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The oriented migration of bone marrow mesenchymal stem cells may depend on the interaction between local chemotactic factors and cell surface receptors. However, which chemotactic factors may mediate the oriented migration of bone marrow mesenchymal stem cells towards the fracture site remains unclear.
OBJECTIVE: To tag autologous bone marrow mesenchymal stem cells, evaluate its role in bone healing, and detect the highly expressed factors associated with migration of bone marrow mesenchymal stem cells in the microenvironment.
METHODS: The fluorescence/chimeric C57BL/6 mouse models were established, then left shankbone fracture models were also produced. The percentages of green fluorescent protein positive cells to all cells at the fracture site and the percentage of osteoblasts differentiated from bone marrow mesenchymal stem cells to all the osteoblasts were detected at different time points. The role of bone marrow mesenchymal stem cells in the fracture repairing was evaluated. The levels of chemotactic factors protein expression at the fracture site in different time points were detected with immunohistochemistry technology.
RESULTS AND CONCLUSION: The percentage of green fluorescent protein positive cells to all cells at the fracture site was (3.011±0.911)%, (9.031±0.145)%, (12.064±0.145)% at 1, 5, 14 days postoperatively; and osteoblasts differentiated from bone marrow mesenchymal stem cells accounted for 50% of all the osteoblasts. After fracture, the stromal cell derived factor-1, colony stimulating factor, hepatocyte growth factor, monocyte chemoattractant protein-1, and matrix metalloproteinases-9 were expressed to varying degrees in the microenvironment, while the expression of granulocyte colony-stimulating factor was negative. The expression of stromal cell derived factor-1 in the fracture microenvironment was the highest, mainly due to the migration of bone marrow mesenchymal stem cells. Experimental findings indicate that, autologous bone marrow mesenchymal stem cells participate in and play an important role in bone healing. The stromal cell derived factor-1 plays an important role in promoting bone marrow mesenchymal stem cells migration and promoting bone healing.

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, green fluorescence protein, bone marrow mesenchymal stem cells, chimera, fracture, chemokine, stromal cell derived factor-1, colony stimulating factor, hepatocyte growth factor, monocyte chemoattractant protein-1, matrix metalloproteinases-9, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

张宪彧，汪炜，陈伟，陈建梅，徐皓. 内源性骨髓间充质干细胞与骨折微环境中的相关趋化因子[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.019.

Zhang Xian-yu, Wang Wei, Chen Wei, Chen Jian-mei, Xu Hao . Autologous bone marrow mesenchymal stem cells and related chemokines in
fracture microenvironment[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.019.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析成功建立荧光/普通C57BL/6小鼠嵌合体70只，3个月后存活63只。随机取42只建立荧光/普通C57BL/6小鼠嵌合体骨折模型；随机取7只检测正常骨组织内与骨髓间充质干细胞定向相关趋化因子表达水平。
2.2 骨髓间充质干细胞在骨折修复中的作用正常骨组织内，未观察到明显的绿色荧蛋白阳性信号，提示骨髓间充质干细胞并未参与正常骨组织更新，见图1。

骨折后1，3，5，7，14，21 d，骨折部位可以观察到数量不等绿色荧蛋白阳性细胞聚集，数量呈逐渐上升趋势，见图2-4，提示骨折后骨髓间充质干细胞可以趋化到骨折局部。

骨折后7，14，21 d，骨折部位全部成骨细胞中来源于骨髓间充质干细胞的成骨细胞占到了50%以上，见图5，提示骨折后较大部分的骨髓间充质干细胞可以分化为成骨细胞，在骨折修复中起到了重要作用。具体数据见表1。

2.3 正常骨组织内与骨髓间充质干细胞定向相关趋化因子表达水平的检测结果正常骨骨干部位未检出基质细胞衍生因子1、干细胞因子、肝细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、单核细胞趋化蛋白1、间质金属蛋白酶9因子表达，见图6。仅在干骺端软骨组织内的成骨样细胞胞浆内检出有基质细胞衍生因子1的表达，见图7。

2.4 骨折微环境内与骨髓间充质干细胞定向相关趋化因子表达水平的检测结果见图8-13。

不同时相点骨折微环境中基质细胞衍生因子1、干细胞因子、肝细胞生长因子、单核细胞趋化蛋白1、间质金属蛋白酶9有不同程度的表达，粒细胞集落刺激因子未测出有明显表达。阳性切片所测得的阳性面积率、平均吸光度值等参数见表2，3。

数据进行多样本均数间多重比较SNK-q检验(Student-Newman-Keuls检验)分析后认为：SDF-1的表达量相对最高，与其他指标比较差异有显著性意义(P < 0.01)。采用皮尔逊(Pearson)相关分析结果显示：不同时相点骨折部位基质细胞衍生因子1阳性面积率与绿色荧蛋白阳性细胞占所有细胞的比例间存在正相关关系(r=0.992，P < 0.01)；不同时相点骨折部位基质细胞衍生因子1组切片平均吸光度值与绿色荧蛋白阳性细胞占所有细胞的比例间存在正相关关系(r=0.986，P < 0.01)。提示基质细胞衍生因子1在骨折微环境中的表达与骨髓间充质干细胞趋化到骨折部位之间存在关联。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物观察实验。

时间及地点：实验于2007年8月至2008年3月在解放军南京军区福州总医院实验科、比较医学科、放疗中心完成。

材料：

实验动物：清洁级4周龄普通雌性C57BL/6小鼠70只，体质量(16.11±0.05) g；清洁级4周龄普通雄性C57BL/6小鼠45只，体质量(16.23±0.06) g；清洁级4周龄雄性绿色荧蛋白阳性C57BL/6小鼠45只，体质量(14.59±0.03) g，均由上海实验动物中心提供，许可证号SCXK(沪)2007-0005。饲养于解放军南京军区福州总医院比较医学中心。

主要试剂：DMEM/F12培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(PAA公司)；淋巴细胞分离液(ρ=1.077)(上海生化试剂三厂)；碘化丙啶(Sigma公司)；SABC-Cy3荧光免疫组化试剂盒、兔抗小鼠成骨细胞特异性抗体、兔抗小鼠基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)抗体、兔抗小鼠干细胞因子(stem cell factor，SCF)抗体、兔抗小鼠肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)抗体、兔抗小鼠粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)抗体、兔抗小鼠单核细胞趋化蛋白1 (monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)抗体、兔抗小鼠间质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)抗体、SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)。

实验方法：

荧光/普通C57BL/6小鼠嵌合体的建立：

携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因的C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞的获取及传代培养：将4周龄C57BL/6 绿色荧蛋白转基因雄性小鼠，用氯胺酮行腹腔麻醉，脱颈处死，体积分数为75%乙醇浸泡消毒10 min。在超净工作台中，无菌条件下，分离出双侧股骨、胫骨。剪除骨骺端。用注射针吸取DMEM培养基冲出髓腔骨髓于无菌培养皿中，轻吹打，200目细胞筛过滤，制成单细胞悬液。利用淋巴细胞分离液(ρ=1.077)行密度梯度离心，贴壁培养，胰酶消化传代，分离、扩增、纯化骨髓间充质干细胞。流式细胞仪检测培养细胞中CD44阳性和CD34阴性细胞的构成比，经向成骨、成脂肪、神经样细胞诱导证实其多向分化潜能后传代备用。

普通C57BL/6小鼠不含骨髓间充质干细胞的骨髓细胞的获取：同前法将4周龄正常C57BL/6雄性小鼠双侧股骨、胫骨骨髓细胞制成单细胞悬液。用含体积分数为15%胎牛血清的DMEM/F12培养基将细胞浓度调整成1×10⁹ L^-¹，置培养瓶内，37 ℃、体积分数为5% CO₂、饱和湿度培养箱内培养48 h后，收集非贴壁细胞，备用。

普通C57BL/6小鼠X射线照射：4周龄普通雌性C57BL/6小鼠70只，在照射前5 d小鼠的饮水中加入阿奇霉素和庆大霉素，进行肠道准备。在无菌条件下，用美国VARIAN2100C型直线加速器对其进行 X射线照射，照射率0.5 Gy/min，照射量5 Gy，2 h后重复1次。

骨髓移植：取1 000个携带绿色荧蛋白的骨髓间充质干细胞与正常雄性C57BL/6小鼠不含骨髓间充质干细胞的骨髓细胞按1∶1 000，用DMEM/F12制成混合细胞悬液0.3 mL，用1 mL注射器从尾静脉缓慢注入接受X射线照射后4 h内的受体小鼠。移植后重新置入铺有无菌垫料和灭菌饲料、饮水的IVC动物饲养系统。

荧光/普通C57BL/6小鼠嵌合体骨折模型的建立：成功建立荧光/普通C57BL/6小鼠嵌合体后3个月，随机取42只，建立嵌合体左胫骨骨折模型，方法如下：无菌条件下，用氯胺酮行腹腔麻醉后，取左小腿中段前内侧切口进入，向上延至膝关节，用钝刀片造成左侧胫骨中段横行骨折，不保留骨膜。然后在胫骨髁间隆起处钻一 0.7 mm的孔，复位骨折断端，以直径0.5 mm、长度较胫骨长度稍短的不锈钢针插入胫骨骨髓腔中，起到髓腔内固定作用。全层严密缝合皮下组织和皮肤。术后予以阿奇霉素和庆大霉素溶液口服3 d。

检测不同时相点骨折部位绿色荧蛋白阳性细胞占所有细胞的比例：将42个嵌合体骨折模型随机平均分成6组，分别在骨折后1，3，5，7，14，21 d取出1组，无菌条件下取出左胫骨拔除内固定。避光条件下，用20% EDTA脱钙后行冰冻纵向切片，片厚10 μm。切片经碘化丙啶标记细胞核后，在激光共聚焦显微镜下，分别利用488 nm波长激光和493 nm波长激光激发绿色荧蛋白信号和碘化丙啶信号，扫描摄片，检测出绿色荧蛋白阳性细胞占所有细胞的比例。

检测不同时相点骨折部位来源于骨髓间充质干细胞的成骨细胞占全部成骨细胞的比例：取胫骨骨折后7，14， 21 d上述冰冻切片各5张，利用成骨细胞特异性抗体osteocalcin荧光免疫组化染色，在激光共聚焦显微镜下，分别利用488 nm波长激光和554 nm波长激光激发绿色荧蛋白信号和Cy3信号，扫描摄片，检测来源于骨髓间充质干细胞的成骨细胞占全部成骨细胞的比例。

检测正常骨组织内与骨髓间充质干细胞定向相关趋化因子表达水平：荧光/普通C57BL/6小鼠嵌合体成功建立3个月后，随机取出7只小鼠。用免疫组化方法检测正常骨组织内基质细胞衍生因子1，干细胞因子，肝细胞生长因子，粒细胞集落刺激因子，单核细胞趋化蛋白1，间质金属蛋白酶9等趋化因子的蛋白表达水平。实验所用兔抗小鼠一抗均以一抗专用稀释液按1∶300稀释。

检测骨折微环境内与骨髓间充质干细胞定向相关趋化因子表达水平：取胫骨骨折后1，3，5，7，14，21 d上述冰冻切片各18张，随机分成6组，分别进行免疫组化染色检测不同时相点骨折微环境内基质细胞衍生因子1、干细胞因子、肝细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、单核细胞趋化蛋白1、间质金属蛋白酶9等趋化因子的蛋白表达水平。

图像采集与分析方法如下：用日本OLYMPUS BX51型生物正置显微镜及Q-IMAGING/型显微数码照相系统，对每张切片以骨折为中心随机摄取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400倍)。经中国计量科学研究院SMR103型密度片校正定标，运用MOTIC MED6.0数码医学图像分析系统进行图像分析，测定每个视野下阳性反应的平均吸光度值、阳性反应面积和总面积，计算阳性面积率。

阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/

单位面积中的细胞的总面积×100%

以每例5个视野的平均吸光度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

主要观察指标：骨折后1，3，5，7，14，21 d时骨折部位来源于骨髓间充质干细胞的成骨细胞占全部成骨细胞的比例；骨折微环境内与骨髓间充质干细胞定向相关趋化因子阳性反应的平均吸光度值、阳性反应面积和总面积、阳性面积率。

统计学分析：所得数据利用SPSS 13.0软件作方差齐性检验和多样本均数间多重比较SNK-q检验，并进行皮尔逊(Pearson)相关分析。

讨论

目前，利用骨髓间充质干细胞移植在心、肝、肾、肺等组织器官损伤修复中取得了一定的临床效果^[2-6]，得到了极大的关注。要准确、客观、体内评估移植后的骨髓间充质干细胞的存活、迁移及分化，尤其是评估自体内源性骨髓间充质干细胞的作用，需要对骨髓间充质干细胞有效识别。由于目前尚未肯定骨髓间充质干细胞的特异性表面抗原，即使存在也可能在向骨祖细胞、成骨细胞等分化的过程中逐渐丧失，因此需要探索新的细胞标记方法。目前常用的标记细胞的方法包括^[7-8]：①同位素标记植入细胞，植入后行放射自显影。②植入细胞体外培养时添加BrdU，然后鉴定细胞核中BrdU。③植入细胞用荧光染料标记，样本在荧光显微镜下观察。④植入细胞进行特殊基因标记，如β-半乳糖苷酶、增强型绿色荧光蛋白，鉴定细胞产生特殊标记物。上述方法标记的细胞，在其死亡破裂后，标记物污染漂移造成了一些假阳性结果，干扰了对实验指标的正确评估。本课题所用的绿色荧蛋白转基因C57BL/6小鼠，是通过基因工程技术将绿色荧蛋白基因导入了胚胎干细胞内形成的。经检测表明，在该小鼠的心、肺、肝、肾、胃、脑、皮肤、骨髓内等细胞均呈绿色荧蛋白阳性。当其细胞坏死后绿色荧蛋白不会漂移对其他细胞造成污染，可以起良好的标记及示踪作用。因此，本项目中建立荧光/普通C57BL/6小鼠嵌合体模型的办法可以有效解决“准确、客观、体内评估移植后的骨髓间充质干细胞的存活、迁移及分化，尤其是评估自体内源性骨髓间充质干细胞作用”的问题。其原理是^[9-10]：致死量照射方法去除动物的自体骨髓干细胞，包括造血干细胞及基质干细胞。②骨髓间充质干细胞、造血干细胞均具有定向迁移能力，它们之间还具有协同作用^[10-11]：骨髓间充质干细胞不仅分泌白细胞介素6，7，8，11，12，14，15，巨噬细胞集落刺激因子，Flt-3L和干细胞集落因子，而且骨髓间充质干细胞自身白细胞介素11，12表达水平更高，白细胞介素12可诱导骨髓间充质干细胞和骨髓基质细胞产生粒细胞集落刺激因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，从而促进粒系和巨核系细胞的回升，为造血提供了重要的细胞间接触和生长因子。骨髓间充质干细胞还通过诱导归巢受体表达引导造血干细胞归巢并重建被破坏的骨髓组织；骨髓间充质干细胞还可以发挥其免疫调控/抑制作用，减轻对造血干细胞移植的排斥作用及移植物抗宿主病。所以，通过将骨髓间充质干细胞与造血干细胞混合静脉注射，移植的骨髓细胞可以重建受体骨髓组织，建立小鼠骨髓嵌合体。③嵌合体骨髓内的骨髓间充质干细胞携带绿色荧蛋白基因。利用该嵌合体建立各种损伤模型，然后在不同时相点内检测各组织绿色荧蛋白信号，便可对其在各组织创伤修复中的作用作出评估。

在骨组织内，尽管正常情况下仅极少量骨髓间充质干细胞参与骨组织内细胞更新。但在骨折后，经本实验证实，随着时间的推移，损伤部位绿色荧蛋白阳性细胞明显逐渐增多，通过荧光免疫组化染色表明，相当部分的绿色荧蛋白阳性细胞具有成骨细胞表型。骨折后7，14，21 d，全部成骨细胞中来源于骨髓间充质干细胞的成骨细胞分别占(55.02±0.95)%、(52.01±0.59)%、(51.05±0.55)%。这表明骨损伤后，由于骨折微环境的吸引，骨髓间充质干细胞可以向损伤部位迁移，并向成骨细胞表型分化，对于骨折修复起到了重要作用。

通过对心、肝、肾、肺、皮肤等组织损伤修复的研究表明，自体骨髓间充质干细胞具有向上述损伤部位迁移并参与相应组织修复的能力^[12-13]。然而，是什么因素

影响骨髓间充质干细胞的定向迁移？这些因素又是如何引起骨髓间充质干细胞的迁移？相关研究表明，骨髓间充质干细胞定向迁移依赖于损伤局部表达的信号分子与细胞表面表达相应受体的相互作用。近年的研究发现下列因子可能与骨髓间充质干细胞的定向迁移参与组织修复有关系密切。

3.1 基质细胞衍生因子1 基质细胞衍生因子1是由骨髓基质细胞(主要是成骨细胞和成纤维细胞等)和内皮细胞产生的CXC类趋化蛋白，它是惟一能与受体CXCR4结合并能激活它的天然趋化因子。研究发现基质细胞衍生因子1具有广泛的生理功能：①基质细胞衍生因子1在免疫系统、循环系统及中枢神经系统的发育中起着至关重要的作用。②研究还发现基质细胞衍生因子1与HIV的感染、炎症反应、血管生成及肿瘤细胞的迁移等密切相关。③越来越多的证据证实基质细胞衍生因子1和它的惟一受体CXCR4与许多炎症过程相关，如：过敏性气道疾病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和其他几种脑部疾病^[14]。④基质细胞衍生因子1还能刺激免疫反应，在体外试验中发现，基质细胞衍生因子1对单核细胞、淋巴细胞均有趋化作用，而对中性粒细胞无作用，体内试验中基质细胞衍生因子1对单核细胞的趋化作用更明显。作者所在课题组同期进行的实验发现，在体外利用Transwell小室培养，基质细胞衍生因子1可以明显增强骨髓间充质干细胞的趋化。基质细胞衍生因子1在心肌、肝脏、肾脏、肺脏、皮肤等多种组织损伤后表达均明显增高，与骨髓之间形成浓度递度，是吸引骨髓间充质干细胞向上述损伤部位迁移的关键信号分子^[15-17]。骨折微环境中，基质细胞衍生因子1是否亦有高表达，其表达骨髓间充质干细胞迁移至损伤区的数量是否相平行是本课题重点要解决的问题。

3.2 干细胞因子干细胞因子又被称为干细胞生长因子、肥大细胞生长因子和c-kit蛋白配体。研究发现SCF能促进干祖细胞增殖分化，与一些可溶性的因子共同作用能促进干细胞的增殖分化^[18]。干细胞因子单独作用刺激干细胞增殖和促进克隆形成能力都微弱,而与其他细胞因子有明显协同促进作用^[19]。干细胞因子亦具有趋化因子的功能，有学者研究发现在心肌梗死局部的巨噬细胞表达干细胞因子，通过骨髓间充质干细胞上的c-kit受体相互作用，促进骨髓间充质干细胞的迁移^[20]。骨折早期损伤部位也有巨噬细胞聚集，是否可以分泌干细胞因子来促进骨髓间充质干细胞定向迁移并参与骨折修复，目前尚不清楚。

3.3 肝细胞生长因子肝细胞生长因子是骨髓微环境分泌的主要细胞因子之一^[21]。骨髓间充质干细胞可以表达肝细胞生长因子的受体c-Met，在肝组织损伤动物模型中，肝组织损伤后损伤局部肝细胞生长因子表达增高，骨髓间充质干细胞相应上调其受体c-Met的表达，促进骨髓间充质干细胞向损伤部位迁移^[22]。肝细胞生长因子的受体C-Met在体内分布广泛^[23]，正常人骨髓间充质干细胞高表达c-Met受体，提示肝细胞生长因子是骨髓间充质干细胞的重要调节因子。刘红军等^[24]的研究结果表明，肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞的增殖和向成骨细胞分化没有明显作用，但能够诱导骨髓间充质干细胞的迁移。这揭示肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞的归巢或动员具有调节作用。

3.4 粒细胞集落刺激因子近年来的研究发现G-CSF可动员骨髓间充质干细胞进入血循环，定向迁移到损伤部位，并分化为相应的细胞促进组织修复。在心肌梗死后G-CSF可动员骨髓干细胞(包括造血干细胞和骨髓间充质干细胞)迁移到心肌梗死部位促使心肌再生和血管生成，恢复部分心脏功能^[25-26]，Fukuda等^[27]进一步证明心肌梗死后G-CSF主要动员骨髓间充质干细胞向心肌迁移并分化为心肌细胞，而不是骨髓的造血干细胞；然而，骨髓干细胞上并没有G-CSF的受体，因此对G-CSF是如何动员骨髓干细胞进入循环的机制目前仍不明确。有学者发现G-CSF刺激骨髓干细胞迁移的作用可被抗CXCR4的抗体所阻断^[28]。骨髓间充质干细胞也表达基质细胞衍生因子1的受体CXCR4，G-CSF是否也是通过类似机制动员骨髓间充质干细胞有待于进一步证实。刘岐焕等^[29]研究证实：重组人粒细胞集落刺激因子对小鼠骨髓间充质干细胞有明显地促进其增殖的作用。骨折部位是否表达G-CSF并对骨髓间充质干细胞趋化起作用，还有待研究。

3.5 单核细胞趋化蛋白1 单核细胞趋化蛋白1是具有多种功能的趋化因子：单核细胞趋化蛋白1在炎症反应^[30]，损伤修复及新血管生成中有重要作用^[31]。近年研究表明单核细胞趋化蛋白1可趋化骨髓间充质干细胞定向迁移，Wang等^[32]在大脑缺血损伤动物模型中发现，单核细胞趋化蛋白1可促进骨髓间充质干细胞迁移到损伤部位。孟玲等^[33]在体外研究单核细胞趋化蛋白1对骨髓间充质干细胞趋化活性，发现骨髓间充质干细胞可被趋化，并且趋化细胞的数量与单核细胞趋化蛋白1的浓度成正比。马胜忠等^[30]的实验证实，单核细胞趋化蛋白1 mRNA在脊髓损伤后表达明显增高，单核细胞趋化蛋白1阳性细胞在脊髓损伤后3 h 就能检测到，以后持续增多，损伤后12 h至3 d为高峰期，在损伤后7 d仍有阳性表达。而巨噬细胞在脊髓损伤局部亦明显增多，其高峰时段在损伤后3-7 d，明显滞后于单核细胞趋化蛋白1阳性细胞出现的高峰期，进一步提示脊髓损伤后单核细胞趋化蛋白1与单核巨噬细胞之间存在级联反应。骨折微环境中是否有单核细胞趋化蛋白1的表达，其作用除了招募单核巨噬细胞细胞参与炎性反应外，是否对于骨髓间充质干细胞的趋化亦起到直接或间接的作用，这有待于进一步的研究。

3.6 间质金属蛋白酶9 在炎症或缺氧时，内皮细胞、成纤维细胞、炎性细胞释放间质金属蛋白酶，研究发现间质金属蛋白酶影响内皮细胞的迁移、增殖等活动，在调节血管生成具有促进和抑制双重作用。近来研究揭示骨髓干细胞通过间质金属蛋白酶9介导释放可溶性的Kit配体(sKitl)调控造血干细胞和内皮干细胞的恢复、增殖、分化。研究表明，间质金属蛋白酶9可以通过动员骨髓间充质干细胞进入外周血，间接促进骨髓间充质干细胞的迁移^[31]。那么骨折微环境中是否表达间质金属蛋白酶9并对骨髓间充质干细胞起到趋化作用，这亦是本课题要解决的问题。

明确上述趋化因子在骨折微环境中是否有表达、表达的规律如何，这是筛选出骨髓间充质干细胞向骨折部位定向迁移的关键趋化因子的基础，亦是调控内源性骨髓间充质干细胞向骨损伤部位定向迁移促进骨修复的基础。通过对实验结果的分析，发现：①随着时间推移，骨折部位绿色荧蛋白阳性细胞所占比例逐渐增高，增高的速率逐渐放缓。②基质细胞衍生因子1在骨折微环境中的表达亦呈先快速增高而后趋于平稳的趋势。经过皮尔逊(Pearson)相关分析结果显示：不同时相点骨折部位基质细胞衍生因子1阳性面积率与绿色荧蛋白阳性细胞占所有细胞的比例间存在正相关关系(r=0.992，P < 0.01)；不同时相点骨折部位基质细胞衍生因子1切片平均吸光度值与绿色荧蛋白阳性细胞占所有细胞的比例间存在正相关关系(r=0.986，P < 0.01)。这初步证实了基质细胞衍生因子1在骨折微环境中的表达与骨髓间充质干细胞趋化到骨折部位之间存在关联。经仔细比对发现基质细胞衍生因子1在骨折微环境中的表达增加高峰出现的时间略早于骨折部位绿色荧蛋白阳性细胞增加高峰的时间，这进一步提示：骨折微环境中，基质细胞衍生因子1与骨髓间充质干细胞存在级联反应，基质细胞衍生因子1对于促进骨髓间充质干细胞的定向趋化并参与骨修复中可能起到了重要作用。然而要判断基质细胞衍生因子1促进骨髓间充质干细胞的定向趋化并参与骨修复此过程起关键或主要作用，还需要进一步研究，例如检测CXCR4是否在相应时相内表达增高、增高/阻断局部基质细胞衍生因子1的表达是否可以增强/阻断骨髓间充质干细胞的迁移水平等等。③骨折微环境中，肝细胞生长因子亦有一定量的表达，而且其表达亦呈逐渐增高的趋势。这可能有利于上调骨髓间充质干细胞相应受体c-Met，进而诱导骨髓间充质干细胞的迁移。骨折早期(前5 d)微环境中，单核细胞趋化蛋白1的表达量亦不小。它的表达可以招募单核巨噬细胞、参与炎症反应，同时似乎亦可以直接或间接地对骨髓间充质干细胞的趋化起到一定作用。因此，如果能够掌握相关趋化因子的表达规律和作用机制，联合调节相关趋化因子的表达将给促进骨髓间充质干细胞向损伤部位趋化带来新的前景。

内源性骨髓间充质干细胞与骨折微环境中的相关趋化因子

Autologous bone marrow mesenchymal stem cells and related chemokines in
fracture microenvironment

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内源性骨髓间充质干细胞与骨折微环境中的相关趋化因子

Autologous bone marrow mesenchymal stem cells and related chemokines in fracture microenvironment

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fracture microenvironment