构建能转染人骨髓间充质干细胞的Ad5 GM-CSF-IL-2腺病毒载体

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.14.006

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (14): 2509-2516.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.14.006

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构建能转染人骨髓间充质干细胞的Ad5 GM-CSF-IL-2腺病毒载体

张玉萍¹，张璇^2，3，郭智²，谭晓华²

收稿日期:2012-12-07 修回日期:2012-12-27 出版日期:2013-04-02 发布日期:2013-04-02
通讯作者: 谭晓华，博士后，主任医师，解放军北京军区总医院中心实验科，北京市 100700 xiaohua_t@hotmail.com
作者简介:张玉萍★，女，1987年生，安徽省合肥市人，汉族，2013年安徽医科大学毕业，硕士，主要从事肿瘤的免疫基因治疗方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81172162)，课题名称：NK-92细胞介导溶瘤腺病毒靶向治疗实体瘤的研究。

Construction of an adenoviral vector encoding Ad5GM-CSF-IL-2 in human bone marrow mesenchymal stem cells

Zhang Yu-ping¹, Zhang Xuan^{2, 3}, Guo Zhi², Tan Xiao-hua²

1 The Clinical College of General Hospital of Beijing Military Area Command of Chinese PLA, Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China
2 Central Laboratory, General Hospital of Beijing Military Area Command of Chinese PLA, Beijing 100700, China
3 Second Clinical College, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2012-12-07 Revised:2012-12-27 Online:2013-04-02 Published:2013-04-02
Contact: Tan Xiao-hua, Chief physician, Central Laboratory, General Hospital of Beijing Military Area Command of Chinese PLA Beijing 100700, China xiaohua_t@hotmail.com
About author:Zhang Yu-ping★, Master, the Clinical College of General Hospital of Beijing Military Area Command of Chinese PLA, Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81172162

摘要/Abstract

摘要：

背景：如何将树突状细胞和T细胞活化因子运送至肿瘤局部是有待解决的难题之一。利用人骨髓间充质干细胞具有肿瘤趋向性和低免疫原性的特性，将树突状细胞和T细胞活化因子导入骨髓间充质干细胞后运送至肿瘤局部表达可能是解决上述难题的方案之一。
目的：构建共表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2的5型腺病毒载体(Ad5 GM-CSF-IL-2)，感染人骨髓间充质干细胞，检测粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2的表达水平和持续时间，为体内活化树突状细胞和T细胞提供实验依据。
方法：提取人外周血单个核细胞总RNA，以此为模板用RT-PCR方法扩增粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2基因cDNA，PCR扩增片段分别插入pcDNA3.1/Myc-His(-)B真核表达载体中，再利用脑心肌炎病毒内部核酸进入位点(IRES)序列，构建腺病毒载体穿梭质粒pDC515 GM-CSF-IRES-IL-2。采用AdMax^TM FLP重组腺病毒载体体系，将穿梭质粒pDC515 GM-CSF-IRES-IL-2与pBGHfrt△E1,3 FLP骨架质粒共转染至293细胞，通过重组酶位点特异性重组获得Ad5 GM-CSF-IL-2。Ad5 GM-CSF-IL-2感染人骨髓间充质干细胞后经γ射线照射使其失去增殖能力，分别用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2 ELISA试剂盒在不同的时间点检测细胞上清中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2蛋白的水平。
结果与结论：经测序证实，克隆获得的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素2 的cDNA序列分别与GenBank NM_000758(435 bp)和GenBank NM_000586(462 bp)提供的序列完全一致。用AdMax^TM FLP重组腺病毒载体可高效、快捷地获得所要包装的腺病毒载体，通过IRES连接粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2两个基因，均获得高效表达。Ad5 GM-CSF-IL-2感染人骨髓间充质干细胞后可连续7 d高水平地分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 树突状细胞, 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子, 白细胞介素2, 骨髓间充质干细胞, 腺病毒载体, 肿瘤, 基因治疗, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: A problem needed to be solved is how to deliver activating factors for dendritic cells and T cells into the tumors. Owing to the characteristics of tumor tropism and weak immunogenicity, human bone marrow mensenchymal stem cells are used as a vehicle for transferring the activating factor genes of the dendritic cells and T cells to the tumor, which may be a protocol to solve the problem.
OBJECTIVE: To construct a type 5 adenoviral (Ad) vector encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin-2 (IL-2) genes, and detect the expression levels and duration of GM-CSF and IL-2 after infection of human bone marrow mesenchymal stem cells, providing experimental evidence for in vivo activation of dendritic cells and T cells.
METHODS: GM-CSF and IL-2 cDNAs from the total RNA extracted by human peripheral blood mononuclear cells were cloned by RT-PCR and inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1/Myc-His(-)B. GM-CSF and IL-2 cDNAs linked by the internal ribosomal entry sites (IRES) from encephalomyocarditis virus were subcloned into the shuttle vector pDC515 for the construction of pDC515 GM-CSF-IRES-IL-2. By using AdMax^TM adenovirus vector system, the shuttle vector pDC515 GM-CSF-IRES-IL-2 and the backbone vector pBGHfrt△E1,3 FLP were cotransfected into 293 cells, and Ad5 GM-CSF-IL-2 was obtained by FLP recombinase-mediated site-specific recombination. The amounts of GM-CSF and IL-2 in the culture supernatants at different time points were measured by enzyme-linked immunosorbent assay after human bone marrow mesenchymal stem cells were infected by Ad5 GM-CSF-IL-2 and irradiated with γ-ray to lose proliferative activity.
RESULTS AND CONCLUSION: The sequences of GM-CSF and IL-2 cDNAs were identical with those provided by GenBank NM_000758 (435 bp) and GenBank NM_000586 (462 bp) by sequencing, respectively. AdMax^TM was an efficient and quick packaging system of adenoviral vectors. The GM-CSF and IL-2 linked by IRES in the adenovirus can efficiently be expressed in the human bone marrow mesenchymal stem cells at a high level for 7 days, suggesting a potential application to the tumor immunotherapy taking human bone marrow mesenchymal stem cells as a carrier expressing the activating factors for dendritic cells and T cells.

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, dendritic cells, granulocyte-macrophage colony stimulating factor, interleukin-2, bone marrow mesenchymal stem cells, adenoviral vector, tumor, gene therapy, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

张玉萍，张璇，郭智，谭晓华. 构建能转染人骨髓间充质干细胞的Ad5 GM-CSF-IL-2腺病毒载体[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(14): 2509-2516.

Zhang Yu-ping, Zhang Xuan, Guo Zhi, Tan Xiao-hua. Construction of an adenoviral vector encoding Ad5GM-CSF-IL-2 in human bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(14): 2509-2516.

图/表（结果） 3

2.1 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2基因的克隆 从健康人外周血单个核细胞获取总RNA，反转录合成第一链cDNA，再利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2克隆引物PCR扩增可获得2条大小约450 bp左右的片段，经限制性内切酶酶切后插入真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(-)B相应的位点中，经用相应的引物鉴定，阳性克隆送生工(北京)生物科技有限公司测序证实，克隆获得的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子片段序列与GenBank NM_000758(435 bp)提供的序列完全一致，获得的白细胞介素2片段序列与GenBank NM_000586(462 bp)提供的序列完全一致。

2.2 Ad5 GM-CSF-IL-2的构建 见图2。

用脂质体Lipofectamine 2000^TM将pDC515 GM-CSF-IL-2与pBGHfrt△E1，3 FLP腺病毒骨架质粒共转染至293细胞后，10 d左右可见293细胞空斑形成，14 d左右挑出明显的空斑转移至新的293细胞中。正确克隆经两三轮扩增后，PCR鉴定获得两条与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2基因片段大小一致的片段(图2A泳道和B泳道)，而单纯从293细胞提取的DNA用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2特异性引物PCR扩增没见任何条带(图2C泳道和D泳道)，表明粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2片段来自Ad5 GM-CSF-IL-2。通过反复扩增并用CsCl纯化Ad5 GM-CSF-IL-2后，通过TCID50法鉴定可获得10¹⁰-10¹¹ pfu的病毒滴度。

2.3 人骨髓间充质干细胞的形态特征 见图3。

骨髓来源的单个核细胞在8-10 h开始逐渐贴壁，培养48-72 h后可见细胞基本贴壁，数量较少，呈梭形，散在分布。以后贴壁细胞逐渐增多，换液移除未贴壁细胞，7 d左右见大部分贴壁细胞呈纤维束状排列，细胞质饱满，细胞生长迅速。也有少量圆形细胞散在。约14 d时细胞达70%-80%融合，呈放射状，旋涡状走行。每次待贴壁细胞生长至70%-80%融合时传代，连续传8代，细胞形态无明显变化。

2.4 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2在人骨髓间充质干细胞的表达 用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2 ELISA试剂盒检测人骨髓间充质干细胞上清中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2的分泌量。感染Ad5 GM-CSF-IL-2的人骨髓间充质干细胞的检测结果如图4所示。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2表达趋势基本一致，即感染12 h即可在上清中检测到两种细胞因子的表达，至48-96 h表达达到高峰，以后表达逐步缓慢地下降，至7 d两种细胞因子仍然有较高的表达量。感染Ad5 GM-CSF-IL-2的人骨髓间充质干细胞粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2的分泌量均较高，24 h时，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2表达量分别为(2 627.28±255.38) pg/10⁶细胞和(1 432.11±158.49) pg/10⁶细胞。而在未感染Ad5 GM-CSF-IL-2的骨髓间充质干细胞上清中仅有很低水平的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2表达，24 h时，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2表达量分别为(46.28±12.03)，(78.3±23.01) pg/10⁶细胞。表明被Ad5 GM-CSF-IL-2感染的人骨髓间充质干细胞可持续长时间地高表达细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2。

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引言

材料方法

设计：以细胞为对象的开放性实验。
时间及地点：实验于2011年10月至2012年10月在解放军北京军区总医院生物治疗中心实验室完成。
材料：健康人外周血来自解放军北京军区总医院输血科，骨髓来源于解放军北京军区总医院血液科异基因造血干细胞移植中健康供者，供者均无造血系统疾病，实验均征得供者及家属同意。
研究腺病毒载体的构建及在人骨髓间充质干细胞的表达的主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments:

实验方法：
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2的克隆：用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞后再用RNA提取试剂盒提取总RNA。按ThermoScript^TM试剂盒说明书合成第一链cDNA。基因克隆引物由生工(北京)生物科技有限公司合成，引物序列见表1。分别用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子克隆引物(引物 1/2)和白细胞介素2克隆引物(引物3/4)，以第一链cDNA为模板，用Deep vent高保真PCR酶PCR扩增粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2的cDNA，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的扩增条件为变性：94 ℃ 30 s，退火：64 ℃ 30 s，延伸：72 ℃ 30 s，共30循环；白细胞介素2的扩增条件为变性：94 ℃ 30 s，退火：58 ℃ 30 s，延伸：72 ℃ 30 s，共30循环。扩增的cDNA PCR片段分别插入pcDNA3.1/Myc-His(-)B真核表达载体相应的酶切位点中，分别构建pcDNA3.1(-) GM-CSF和 pcDNA3.1(-) IL-2，送生工(北京)生物科技有限公司测序证明粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2序列的正确性。

pDC515 GM-CSF-IL-2载体的构建：见图1。

为构建共表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2腺病毒载体，先构建共表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2的腺病毒载体穿梭质粒pDC515 GM-CSF-IL-2。用EocR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切将粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子片段从pcDNA3.1(-) GM-CSF切下，插入腺病毒穿梭质粒pDC515相应的酶切位点中，构成pDC515 GM-CSF。为构建内部核酸进入位点(IRES)连接的白细胞介素2，用白细胞介素2片段扩增引物(引物5/6)从pcDNA3.1(-) IL-2质粒中PCR扩增白细胞介素2片段并用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切(见表1)，pmRNA IRES-luc^[7]载体亦用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，电泳胶回收pmRNA IRES片段，将白细胞介素2和pmRNA IRES连接构建pmRNA IRES-IL-2。再用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，胶回收含IRES-IL-2片段，插入pDC515 GM-CSF相应位点，形成pDC515 GM-CSF- IRES-IL-2 (简写成pDC515 GM-CSF-IL-2)。
Ad5 GM-CSF-IL-2腺病毒载体的包装和扩增：方法参照文献^[8]和试剂盒说明书。按AdMax^TM FLP重组腺病毒系统说明书进行。腺病毒穿梭质粒pDC515 GM-CSF-IL-2与pBGHfrt△E1，3 FLP腺病毒骨架质粒通过脂质体Lipofectamine 2000^TM共转染至293细胞中，待空斑形成后挑出空斑，进一步转移至新的293细胞中扩增。如此反复两三轮后，获得Ad5 GM-CSF-IL-2毒种。将含Ad5 GM-CSF-IL-2毒种反复冻融裂解后提取DNA(含293细胞和Ad5 GM-CSF-IL-2的基因组)，分别用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2引物进行PCR鉴定。单纯从293细胞提取的DNA用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2特异性引物PCR扩增进行对照。经CsCl梯度离心获得纯化的Ad5 GM-CSF-IL-2，用TCID50法鉴定病毒滴度。
人骨髓间充质干细胞的分离、纯化和培养：取健康供者骨髓5mL，用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离出人骨髓中单个核细胞，采用黏附贴壁法从中培养获得人骨髓间充质干细胞，详细方法参照文献[9]。
Ad5 GM-CSF-IL-2感染人骨髓间充质干细胞：取培养至第3代的人骨髓间充质干细胞，接种于6孔板中，每孔1×106个细胞，24 h后弃去原培养液，加入新鲜的含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液，3 mL/孔，按100 pfu/细胞的感染复数加入Ad5 GM-CSF-IL-2腺病毒，CO2细胞培养箱37℃孵育2 h，更换培养液并经田 10 Gy的γ射线照射使人骨髓间充质干细胞失去增值能力，12 h首次收集上清并更换培养液，以后每24 h收集和更换一次，连续收集7 d，即收集时间点分别为12，24，48，72，96，120，144，168 h。同时收集未感染Ad5 GM-CSF-IL-2的人骨髓间充质干细胞上清作为对照。将收集的细胞上清冻存在-20 ℃直至ELISA检测。
ELISA检测粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2的表达：将上述收集的各个时间点的培养液解冻，所有样本稀释10倍后，按粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2 ELISA试剂盒的方法测定上清中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2蛋白的水平。
主要观察指标：转染后的骨髓间充质干细胞的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2的表达水平和持续时间。

讨论

以树突状细胞为基础的肿瘤免疫治疗是目前常用的肿瘤免疫治疗策略之一。树突状细胞获得肿瘤相关抗原的刺激后，需对抗原信息进行加工、处理并递呈给T细胞，使初始T淋巴细胞转化成能识别和杀伤相应肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞。从树突状细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞的产生至少需要3个信号^[10-11]，其中肿瘤抗原经树突状细胞的加工、处理后以MHC-抗原肽复合物(第1信号)的形式递呈给T细胞，包括CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞，而树突状细胞表面表达的共刺激分子如CD80、CD86和CD40等作为第2信号与T细胞表面表达的共刺激分子配基相互作用，活化T细胞以及树突状细胞和CD4⁺ T细胞分泌多种细胞因子主要包括白细胞介素2、白细胞介素12和肿瘤坏死因子α等Th1细胞因子(第3信号)促进效应性CD8⁺ T淋巴细胞的大量增殖，从而产生具有肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞。

静脉输注某些免疫调节因子如白细胞介素2和IFN-γ等具有抗肿瘤效应。临床上较为广泛地应用白细胞介素2等治疗诸如肾癌^[12]、黑色素瘤等^[13]，尽管临床上可观察到一定疗效，但客观反应率仍然很低[14-15]，而且全身给药的毒副作用较大，大剂量输注白细胞介素2容易导致毛细血管渗漏综合征^[16-17]。临床疗效欠佳固然有多种原因，但与肿瘤局部免疫微环境密切相关。并不是在体内产生了细胞毒性T淋巴细胞即能发挥有效的抗肿瘤反应，细胞毒性T淋巴细胞必须达到肿瘤所在部位才能发挥作用。肿瘤本身和基质细胞常产生许多抑制免疫应答的因素，形成免疫抑制微环境，常能阻止细胞毒性T淋巴细胞的进入^[18-20]。因此，如何改变肿瘤免疫抑制性微环境，使免疫应答有利于向抗肿瘤的方向发展很值得探讨。

研究表明，肿瘤原位给予和(或)活化免疫细胞是诱发抗肿瘤免疫的一种有效方式^[21-22]。肿瘤内注射编码免疫调节基因腺病毒载体可在肿瘤局部产生足量的基因产物，有利于改变肿瘤局部免疫微环境向肿瘤免疫应答的方向发展，达到抑制肿瘤生长的目的。肿瘤内注射表达的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，白细胞介素2、白细胞介素12或CD40L的腺病毒载体等可抑制肿瘤的生长，甚至消除已有的肿瘤^[23-26]。这种利用腺病毒载体表达免疫调节基因肿瘤原位激活树突状细胞和(或)T淋巴细胞的策略具有明显的抗肿瘤优势。表现在以下3个方面：①肿瘤放化疗或肿瘤本身的快速生长可导致肿瘤细胞营养匮乏而发生肿瘤的坏死，释放大量的肿瘤抗原，为浸润的免疫细胞提供抗原来源，有利于解决体外制备肿瘤疫苗肿瘤抗原来源困难的问题。②各类促进免疫应答的细胞因子在肿瘤局部中高表达，除有利于拮抗或纠正肿瘤局部的免疫抑制环境，使免疫反应向着抗肿瘤免疫应答的方向发展外，还可以避免全身用药引起的毒副反应。③腺病毒载体本身是一种免疫佐剂，可引起肿瘤内的炎症反应，促进树突状细胞的成熟，有利于肿瘤的免疫应答^[27-29]。此外，腺病毒载体可同时表达2个甚至更多的基因，产生协同的抗肿瘤效应^[30-32]。

然而在临床背景下，肿瘤内注射诱编码免疫调节基因的腺病毒载体导抗肿瘤免疫反应的策略仅仅适合于浅表的肿瘤，对于注射无法达到的深部肿瘤，如何实现这类策略值得探讨。由于腺病毒载体具有很强的免疫原性，难以通过直接静脉注射的方式让腺病毒载体到肿瘤内表达。有一个策略能通过血液循环传送腺病毒载体至肿瘤部位，就是利用细胞载体，即利用细胞载体先在体外感染腺病毒，然后将细胞载体通过静脉注射将病毒载体运送至肿瘤局部。细胞载体需具备一个重要特性即是肿瘤靶向性。目前有许多研究尝试用不同的细胞充当细胞载体，包括免疫细胞，肿瘤细胞和间充质干细胞等^[33-36]。由于骨髓间充质干细胞具有免疫原性低，且取材方便，容易大量扩增等特点，是一种较理想的病毒细胞载体。

本组实验利用骨髓来源的间充质干细胞感染共表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2的腺病毒载体，结果显示间充质干细胞能高效和长时间地表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2，为利用间充质干细胞作为载体传送粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2至肿瘤细胞部位提供依据。此外，本组实验还具有以下特点：①在同一个腺病毒载体编码两个基因，利用内部核酸进入位点(IRES)序列将粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2两个基因连接，受一个启动子CMV调控，两个基因均获得有效表达。尽管IRES是一种常用的双基因表达载体的构成元件^[37-39]，但在不同的体系下，IRES连接的两个基因的表达水平并不完全一致，常常是靠近启动子的基因表达水平高，而IRES下游的基因表达水平较低，甚至不能有效地表达[^40]。而本组实验中证实用IRES连接的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2均能获得高效的表达，可能与利用Nco Ⅰ位点(ccatgg)将连接IRES和白细胞介素2，形成Kozak序列(accatgg)，有利于白细胞介素2的表达。②共表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素2，可能更有利于诱导肿瘤主动性免疫应答反应。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子是树突状细胞前体细胞分化成树突状细胞所必须的细胞因子，肿瘤内高表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子将有利于促进浸润至肿瘤内树突状细胞前体细胞如单核细胞分化成树突状细胞，从而能摄取肿瘤释放的肿瘤抗原；而树突状细胞刺激T淋巴细胞向细胞毒性T淋巴细胞转化后需要淋巴细胞增殖因子如白细胞介素2和白细胞介素12的刺激才能大量的扩增。因此，局部产生白细胞介素2将有利于肿瘤局部细胞毒性T淋巴细胞的扩增，增强其肿瘤杀伤活性。③以人的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素2和人骨髓间充质干细胞以及5型腺病毒载体作为研究对象，更利于研究结果向临床应用转化，先在体外感染细胞载体的方法避免了腺病毒直接体内注射所带来的安全隐患以及异源性基因直接导入所产生的伦理学问题。

构建能转染人骨髓间充质干细胞的Ad5 GM-CSF-IL-2腺病毒载体

Construction of an adenoviral vector encoding Ad5GM-CSF-IL-2 in human bone marrow mesenchymal stem cells

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