重组人骨形态发生蛋白2调节人脂肪间充质干细胞表达血管内皮生长因子

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.14.007

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (14): 2517-2524.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.14.007

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重组人骨形态发生蛋白2调节人脂肪间充质干细胞表达血管内皮生长因子

曹鑫，金格勒，杨毅，陈慧锦，殷剑

新疆医科大学第一附属医院VIP外二科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

收稿日期:2012-11-02 修回日期:2012-11-20 出版日期:2013-04-02 发布日期:2013-04-02
通讯作者: 金格勒，博士，教授，主任医师，新疆医科大学第一附属医院VIP外二科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000 jingl81@yahoo.com.cn
作者简介:曹鑫★，男，1985年生，山东省东营市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事骨组织工程研究。 demonleaf@163.com
基金资助:
新疆自治区青年自然科学基金资助项目(2012 211B32)；高校博士点基金资助项目(20116517120001)；科技支疆项目基金资助项目(201191262)。

Recombinant human bone morphogenetic protein-2 adjusts expression of vascular endothelial growth factor in human adipose-derived mesenchymal stem cells

Cao Xin, Jin Ge-le, Yang Yi, Chen Hui-jin, Yin Jian

VIP Ward, Second Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2012-11-02 Revised:2012-11-20 Online:2013-04-02 Published:2013-04-02
Contact: Jin Ge-le, Doctor, Professor, Chief physician, VIP Ward, Second Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China jingl81@yahoo.com.cn
About author:Cao Xin★, Studying for master’s degree, VIP Ward, Second Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China demonleaf@163.com
Supported by:
Natural Science Foundation-Funded Youth Project in Xinjiang Autonomous Region, No. 2012211B32; Doctoral Fund of Universities, No. 20116517120001; Project of Supporting Xinxiang with Science and Technology, No. 201191262

摘要/Abstract

摘要：

背景：重组人骨形态发生蛋白2可以促进组织工程骨血管化，但是对于其作用于人体细胞时的生物学规律不明确。目前对于重组人骨形态发生蛋白2调节人体细胞血管内皮生长因子表达的规律国内还未见相关报道。
目的：从基因和蛋白水平观察比较不同时间点重组人骨形态发生蛋白2诱导下人脂肪间充质干细胞血管内皮生长因子的表达。
方法：从成人脂肪组织中分离培养脂肪间充质干细胞，取第3代细胞用于实验，分为诱导组和对照组。诱导组采用终浓度为100 μg/L重组人骨形态发生蛋白2诱导人脂肪间充质干细胞，分别诱导3，6，12，18，24，36，48 h后收集样本，用RT-PCR和ELISA分别从基因水平和蛋白水平检测血管内皮生长因子的表达，并与空白对照组比较。
结果与结论：重组人骨形态发生蛋白2调节人脂肪间充质干细胞表达血管内皮生长因子具有时间依赖性，在不同时间点血管内皮生长因子表达量不同。与空白对照组相比，3-6 h时间段重组人骨形态发生蛋白2抑制血管内皮生长因子表达(P < 0.05)，18-24 h时间段重组人骨形态发生蛋白2促进血管内皮生长因子表达(P < 0.05)，当利用重组人骨形态发生蛋白2促进组织工程骨血管化时这两个时间段应当引起特别关注。

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 脂肪间充质干细胞, 重组人骨形态发生蛋白2, 血管内皮生长因子, 时间依赖性, 基因水平, 蛋白水平, 细胞分离, 细胞培养, RT-PCR, ELISA, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Recombinant bone morphogenetic protein-2 can promote tissue engineering bone vascularization, but its biological rules targeting human cells are not clear. At present, there is in which report on recombinant bone morphogenetic protein-2 adjusts the expression of vascular endothelial growth factor in human cells.
OBJECTIVE: To observe and compare the expression of vascular endothelial growth factor in human adipose-derived mesenchymal stem cells on gene level and protein level at different time points after induced with human recombinant bone morphogenetic protein-2.
METHODS: Adipose-derived mesenchymal stem cells were separated from adult human adipose tissues and cultured until passage 3, then divided into induced group and control group. The cells in the induced group were induced by human recombinant bone morphogenetic protein-2 which final concentration was 100 μg/L, then the samples were collected at 3, 6, 12, 18, 24, 36 and 48 hours after induction. Reverse transcription-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay were used to detect vascular endothelial growth factor expression on gene level and protein level, compared with the control group.
RESULTS AND CONCLUSION: Human recombinant bone morphogenetic protein-2 adjusted vascular endothelial growth factor expression of adipose mesenchymal stem cells in a time-dependent manner, and the expression of vascular endothelial growth factor changed at different time points. Compared with the control group, human recombinant bone morphogenetic protein-2 could suppress vascular endothelial growth factor expression at 3-6 hours (P < 0.05), while at 18-24 hours, human recombinant bone morphogenetic protein-2 could promote vascular endothelial growth factor expression (P < 0.05). These two time periods should be paid attention when using human recombinant bone morphogenetic protein-2 to promote tissue engineering bone vascularization.

Key words: stem cells, adipose-derived stem cells, adipose-derived mesenchymal stem cells, human recombinant bone morphogenetic protein-2, vascular endothelial growth factor, time-dependent, gene level, protein level, cell isolation, cell culture, reverse transcription-PCR, enzyme-linked immunosorbent assay, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

曹鑫，金格勒，杨毅，陈慧锦，殷剑. 重组人骨形态发生蛋白2调节人脂肪间充质干细胞表达血管内皮生长因子[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(14): 2517-2524.

Cao Xin, Jin Ge-le, Yang Yi, Chen Hui-jin, Yin Jian. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 adjusts expression of vascular endothelial growth factor in human adipose-derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(14): 2517-2524.

图/表（结果） 5

2.1 细胞形态学观察结果 原代细胞培养48 h后，倒置显微镜下可以观察到少量细胞贴壁生长，成梭型或短棒状。随着培养时间延长，细胞集落逐渐增大，呈漩涡状排列，高倍镜下观察细胞呈长梭形。大约培养12 d后细胞融合达到80%，传代后细胞形态大小没有发生变化。传至第5代时细胞形态无明显变化，见图1。

2.2 流式细胞仪鉴定结果 流式细胞检测可见CD29，CD44，CD105阳性表达，CD31、CD45阴性表达，见图2。

2.3 成骨诱导及鉴定结果 见图3。

如图3所示，细胞成骨诱导5 d左右，细胞形态逐渐由长梭形变为方形、鳞片形或三角形。高倍镜下细胞内可见颗粒样物质。14 d后形成明显的圆形或卵圆形钙化结节，进行碱性磷酸酶染色可见大多数细胞胞质中有浅棕色至棕黑色细小颗粒或是大片黑色沉淀。

2.4 成脂诱导及鉴定结果 细胞成脂诱导5 d左右，生长明显减慢，细胞由长梭形变成短棒状。14 d后细胞大部分成短棒梭形，倒置显微镜观察下细胞内出现折光性强的脂肪小滴，进行油红O染色可见胞质内有红色脂滴，见图4。

2.5 RT-PCR以及ELISA检测不同时间重组人骨形态发生蛋白2诱导下血管内皮生长因子表达 在基因水平和蛋白水平均证实重组人骨形态发生蛋白2调节脂肪间充质干细胞表达血管内皮生长因子具有时间依赖性。RT-PCR结果显示，重组人骨形态发生蛋白2诱导组在3，6 h血管内皮生长因子的表达量低于对照组(P < 0.05)，12 h的血管内皮生长因子表达出现下降，18- 24 h表达重新上升并达到高峰，36，48 h血管内皮生长因子表达明显减少。对照组3，6 h血管内皮生长因子处于较高水平，12 h表达下降，18-24 h表达上升但是低于重组人骨形态发生蛋白2诱导组(P < 0.05)，36，48 h表达明显减少。

ELISA 结果证实血管内皮生长因子在蛋白水平上表达的时间依赖性与RT-PCR所检测的血管内皮生长因子在基因水平上的时间依赖性相一致，见图5及表1。

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引言

血管化是组织工程中研究的重点和难点^[1]，早期血管的生成是决定组织工程骨移植成功的关键。目前有多种方法来促进组织工程骨的血管化，其中单独使用生长因子或是联合干细胞共同作用可能是促进组织工程骨血管化十分有效的方法^[2]。脂肪间充质干细胞因取材方便、储存丰富，受到越来越多学者的关注。大量的实验研究证实，脂肪间充质干细胞可以作为组织工程新的细胞来源^[3-4]。骨形态发生蛋白2是目前刺激骨组织修复最强的生长因子并且美国食品和药物管理局(FDA)已批准其可以在临床上用于促进脊柱融合和治疗骨不连。本课题组以往在研究重组人骨形态发生蛋白2诱导成骨作用的过程中发现重组人骨形态发生蛋白2在促进成骨的同时也通过上调血管内皮生长因子的表达促进了血管生成，由于同时具有成骨、成血管这种特性，因此重组人骨形态发生蛋白2具有很好的骨修复效果^[5]，国内外的一些学者也得到了相似的结论^[6-7]。然而近年来也有学者对骨形态发生蛋白2促进骨修复的效果提出了质疑^[8-9]，认为骨形态发生蛋白2不仅修复效果不理想还有很严重的不良作用。本课题组认为造成这个争论的原因是由于目前对于骨形态发生蛋白2的生物学特性还不清楚，从而无法制定出统一、合理的使用方法，因此研究骨形态发生蛋白2作用于人体细胞时实际生物学效果及规律对于指导合理使用骨形态发生蛋白2十分必要。实验通过从基因水平和蛋白水平观察不同时间点重组人骨形态发生蛋白2作用下人脂肪间充质干细胞血管内皮生长因子的表达，分析重组人骨形态发生蛋白2促进组织工程骨血管化的时间规律，寻找重组人骨形态发生蛋白2联合脂肪间充质干细胞构建组织工程骨可能的最佳作用时间。

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。
时间及地点：于2011年9月至2012年4月在新疆医科大学第一附属医院干细胞实验室和新疆医科大学基础医学院分子生物学实验室完成。
材料：新鲜人脂肪组织来源于新疆医科大学第一附属医院进行骨科手术治疗无其他疾病的3例患者，平均年龄29岁。供者术前均签署知情同意书，自愿参与本实验研究。
重组人骨形态发生蛋白2调节人脂肪间充质干细胞表达血管内皮生长因子时间依赖性实验的主要试剂和仪器：
Main reagents and instruments:

实验方法：
人脂肪间充质干细胞分离、培养：无菌条件下取术中志愿者脂肪组织放入无菌离心管中，PBS冲洗3遍，仔细剔除血管、筋膜组织后剪碎脂肪组织，0.1%的Ⅰ型胶原酶37 ℃震荡消化45 min，含体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM培养液终止消化，2 000 r/min离心10 min后弃上清液，并以红细胞裂解液处理5 min，除去掺杂的红细胞，用直径为100 μm的筛网过滤，再用含体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM培养液重悬细胞，将细胞接种于直径100 mm的无菌培养皿中。置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中孵育，48 h后首次换液，以后每3 d换1次培养液。待细胞长到80%-90%融合时按1∶3比例进行传代^[10-11]。
细胞形态学观察：倒置显微镜下观察细胞的生长情况。
流式细胞学鉴定：用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化细胞后，1 200 r/min离心6 min，用冷PBS重悬计数，保证每个EP管中细胞的数量为1.0×10⁶，加入抗体，避光，4 ℃孵育30 min后加入二抗，上流式细胞仪检测CD29、CD31、CD44、CD45、CD105。
人脂肪间充质干细胞成骨诱导及鉴定：取第3代细胞以3×10⁴/cm²的浓度接种到6孔板中，24 h后将生长培养液更换为成骨诱导液(DMEM培养基，体积分数10%胎牛血清，0.1 μmol/L地塞米松，200 μmol/L抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸钠)。诱导3周后进行碱性磷酸酶染色，并在倒置显微镜下观察染色情况^[12]。
人脂肪间充质干细胞成脂诱导及鉴定：取第3代细胞以3×10⁴/cm²的浓度接种到6孔板中，24 h后将生长培养液更换为成脂诱导液(DMEM，体积分数10%胎牛血清，1 μmol/L地塞米松，200 μmol/L吲哚美辛，0.5 mmol/L IMBX，10 mg/L胰岛素)。诱导两周后进行油红O染色，并在倒置显微镜下观察染色情况^[13]。
重组人骨形态发生蛋白2诱导人脂肪间充质干细胞：取第3代细胞，按8×10³/cm²的浓度接种到培养皿中，待细胞长到70%-80%融合时，用终浓度为100 μg/L的重组人骨形态发生蛋白2浓度诱导细胞3，6，12，18，24，36，48 h，同时设置空白对照组。
RT-PCR半定量检测血管内皮生长因子表达：每份收集的细胞加入1 mL TRIZOL试剂反复吹打，提取细胞总RNA，按照说明书的步骤将提取的总RNA反转录成cDNA。对反转录的cDNA进行PCR扩增，反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s进行35个循环；72 ℃ 7 min延长。取5 μL PCR扩增产物加入1 μL loading buffer，100 V电压下在20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳。采用凝胶分析系统拍摄，并对各条带的灰度值进行分析。
引物信息：

ELISA检测血管内皮生长因子表达：①吸取细胞培养液，15 000 r/min离心10 min，取上清液备用。②按照说明书对标准品进行稀释。③分别设置空白孔、标准品孔、样本反应孔，加入样本及标准品，生物标记二抗和酶标试剂，37 ℃反应60 min。④小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。⑤每孔加入显色剂后轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色10 min，加终止液50 μL，终止反应。⑥以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(A)值，再根据样品的A值在回归方程上计算出对应的样品浓度。
统计学分析：由第二作者完成统计处理，每组实验重复3次，各组数据用x±s表示，采用SPSS 18.0进行两独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

在临床上修复骨缺损是一项极大的挑战。骨组织通常可以自行恢复，但是当缺损范围较大时往往会修复失败，最终导致骨折的畸形愈合甚至不愈合。传统治疗骨缺损的方法包括：自体骨移植、异体骨移植、人工合成替代物，但是以上的方法都有各自的缺陷。自体骨来源有限并且可能会导致取骨区疼痛、感染等并发症^[14-15]。异体骨可能传播疾病和引起免疫排斥反应^[16]。人工合成替代物由于生物学上的缺陷，往往导致移植失败^[17-18]。近些年来以生长因子、种子细胞、支架材料为基础的骨组织工程研究取得了很大的成功，为修复骨缺损提供了新的思路和方法^[19-23]。然而组织工程骨在临床应用方面往往效果不理想，究其原因，组织工程骨很大程度上受制于移植物血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失效^[24-25]。早期血管的生成可以为组织工程移植物提供充足的营养物质和氧气并能及时清除组织的代谢废物，因此血管化是保证组织工程骨移植成功的关键。

骨形态发生蛋白2是转化生长因子β超家族的成员，能促进间充质干细胞向成骨和成软骨方向分化，是目前已知的最强的成骨诱导因子^[26-27]。近年来，一些学者发现骨形态发生蛋白2在诱导成骨的同时还有促进血管生成的作用。傅德皓等^[28]的研究发现，骨形态发生蛋白2可以促进鼠胚成骨细胞分泌血管内皮生长因子。金格勒等^[29]将重组人骨形态发生蛋白2的异体骨移植到兔体内后，通过PET-CT、流式细胞等检测手段发现，重组人骨形态发生蛋白2在促进兔腰椎后路融合的同时也促进血管的生成。临床上也有很多使用重组人骨形态发生蛋白2的成功病例^[30]。这些都表明骨形态发生蛋白2有很好地促进成骨和成血管的作用，可以单独或是联合干细胞促进骨及其周围血管的修复和再生。但是也有一些学者对骨形态发生蛋白2的实际使用效果和安全性提出了质疑，认为骨形态发生蛋白2不适合应用于骨修复。Brower等^[31]应用重组人骨形态发生蛋白2促进腰椎融合，3个月后发现患者右侧腰大肌骨化，随访2年后骨化没有重吸收。Perri等^[32]在颈椎融合术时应用重组人骨形态发生蛋白2，术后第5天，患者包括咽喉部在内的颈椎发生了严重的水肿。目前对于重组人骨形态发生蛋白2在临床上应用的剂量、时间及方式都存在着很大的争议，造成这种争议的原因是因为对重组人骨形态发生蛋白2的生物学特点研究还不够充分，使用重组人骨形态发生蛋白2的相关标准还不统一，因此研究重组人骨形态发生蛋白2作用于人体细胞时实际的生物学效果和规律对于以后合理高效的应用骨形态发生蛋白2促进骨修复十分必要，但是目前对于重组人骨形态发生蛋白2调节人体细胞血管内皮生长因子表达的规律国内还没有相关的报道。

本实验采用RT-PCR和ELISA检测方法，通过基因水平和蛋白水平研究重组人骨形态发生蛋白2调节人脂肪间充质干细胞表达血管内皮生长因子的时间规律。RT-PCR和ELISA的检测结果均证实无论是重组人骨形态发生蛋白2诱导组还是对照组人脂肪间充质干细胞表达血管内皮生长因子均呈现出时间依赖性，不同时间点血管内皮生长因子的表达量各不相同，诱导组和对照组血管内皮生长因子的表达均呈现出双时相。诱导组和对照组血管内皮生长因子表达的两个高峰时间段均出现在3-6 h和18-24 h，12 h为两组血管内皮生长因子表达的低谷，两组血管内皮生长因子的表达在36，48 h后均明显下降。通过比较分析诱导组和对照组在相同时间血管内皮生长因子的表达量，可以发现在3-6 h这个阶段重组人骨形态发生蛋白2诱导组血管内皮生长因子的表达量要明显低于对照组，这提示重组人骨形态发生蛋白2在这个阶段没有起到促进人脂肪间充质干细胞表达血管内皮生长因子的作用而是起到抑制作用，说明在骨折损伤的超早期应用重组人骨形态发生蛋白2可能抑制损伤部位血管的形成，最终导致骨缺损修复的失败。在实验中可以发现，重组人骨形态发生蛋白2促进人脂肪间充质干细胞表达血管内皮生长因子主要位于18-24 h这个时间段。重组人骨形态发生蛋白2诱导组血管内皮生长因子的表达量在这个时间段上升的幅度要明显大于对照组，在基因水平上诱导组人脂肪间充质干细胞血管内皮生长因子的表达量高于对照组1.37-1.50倍，蛋白水平上为1.17-1.31倍。本实验在体外证实重组人骨形态发生蛋白2调节人脂肪间充质干细胞表达血管内皮生长因子是一个复杂的调控过程。在3-6 h这个时间段重组人骨形态发生蛋白2主要抑制血管内皮生长因子表达，而当位于18-24 h时重组人骨形态发生蛋白2主要表现为促进作用。国内傅德皓等^[29]的研究重组人骨形态发生蛋白2调节鼠胚成骨细胞表达血管内皮生长因子时，也证实重组人骨形态发生蛋白2调节血管内皮生长因子的表达有着明显的时间依赖性，但是他们认为重组人骨形态发生蛋白2无论在那个时间段都促进血管内皮生长因子的表达，这与本实验的一些结果不同，作者分析造成这种差异的原因，有可能是由于研究种属的不同而造成的。

目前虽然有大量的动物研究证实了重组人骨形态发生蛋白2具有很好成骨和成血管作用^[33-34]，但是对于重组人骨形态发生蛋白2作用于人体时的基础研究却相对较少。对于如何使用重组人骨形态发生蛋白存在着很大的争议，至今尚没有制定出统一、合理的使用方法，很多医生在没有统一标准的情况下使用重组人骨形态发生蛋白2，结果不仅修复效果不佳反而引起了很多不良作用，因此迫切需要大量的基础研究进一步发现重组人骨形态发生蛋白2作用于人体时的规律，以便今后可以在减少不良作用的同时更高效合理的利用重组人骨形态发生蛋白2促进组织工程骨血管化。

实验从基因水平和蛋白水平观察不同时间点重组人骨形态发生蛋白2作用下人脂肪间充质干细胞血管内皮生长因子的表达，不仅证实重组人骨形态发生蛋白2调节人脂肪间充质干细胞血管内皮生长因子的表达具有时间依赖性，通过与对照组相比更找到了对于应用重组人骨形态发生蛋白2促进组织工程骨血管化十分关键的两个可能时间段(3-6 h，18-24 h)，本实验结果为重组人骨形态发生蛋白2单独应用或是联合干细胞共同促进组织工程骨血管化的时间选择提供了一定参考依据。由于经费和伦理的原因，本文尚存在一些不足之处，作者没有研究重组人骨形态发生蛋白2调节血管内皮生长因子表达的信号通路机制以及通过体内实验进一步证实体外的研究结论，这都是今后的研究重点。

重组人骨形态发生蛋白2调节人脂肪间充质干细胞表达血管内皮生长因子

Recombinant human bone morphogenetic protein-2 adjusts expression of vascular endothelial growth factor in human adipose-derived mesenchymal stem cells

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