2.1  实验动物数量分析  实验选用C57BL/6小鼠6只，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2  骨关节炎动物模型中实验侧关节较对照侧关节有更高的OARSI评分  见图2。镜下可见手术诱导膝骨关节炎4周后，实验侧与对照侧相比，关节软骨层明显变薄，粘合线崎岖不平，局部出现裂隙。根据OARSI对小鼠骨关节炎模型建立后关节炎严重程度的评分体系^[10]，OARSI评分较高则证明骨关节炎较严重，反之则证明骨关节炎病变程度较轻。对甲苯胺蓝染色后的小鼠双侧关节组织切片进行评分及统计，结果发现对照侧与实验侧关节评分有明显差异，实验侧的评分明显高于对照侧，说明膝关节前交叉韧带切断术可以有效诱导小鼠膝骨关节炎，并出现明显的骨关节炎表型。

2.3  Cx43在小鼠骨关节炎软骨组织中的表达  正常关节软骨中Cx43阳性染色细胞比例较低，骨关节炎软骨组织中Cx43阳性染色细胞比例明显增多，全层分布于软骨组织中，在表层及中层软骨细胞中相对集中。见图3。

2.4  SW1353细胞的培养及嘌呤霉素耐药浓度的筛选  提取第3代SW1353软骨细胞用于实验，结果显示：SW1353细胞培养24 h后逐渐贴壁，细胞呈梭形或多边形，表面光滑，细胞体积变大，胞浆增多，细胞数量多增殖旺盛，见图4。SW1353细胞对嘌呤霉素耐药浓度的筛选结果显示：SW1353细胞对嘌呤霉素的耐受浓度为1 mg/L。

2.5  Cx43、Cx37、Cx40、Cx45、Cx46在SW1353细胞中的表达  使用RT-PCR检测软骨细胞SW1353细胞株中Cx43、Cx37、Cx40、Cx45、Cx46基因的表达水平，结果显示SW1353细胞中Cx43基因的表达水平较Cx37、Cx40、Cx45、Cx46基因的表达水平高。见图5。实验结果显示：在基因水平上，SW1353细胞中编码Cx43的Gja1基因的表达水平较编码Cx37、Cx40、Cx45、Cx46的基因表达水平高(P < 0.01)。结果表明：与连接蛋白家族的其他缝隙连接蛋白的基因表达水平对比，Cx43在SW1353细胞中的表达水平较高，验证了SW1353细胞中Cx43的表达在连接蛋白家族中具有主导地位。

2.6  Cx43-shRNA慢病毒载体构建结果  慢病毒载体的测序鉴定结果显示：阳性克隆测序结果与目标序列完全一致，质粒构建成功。转染293T细胞36 h后，荧光显微镜下观察，质粒转染组各组均可见荧光蛋白表达，4个Cx43-shRNA慢病毒质粒Cx43-shRNA-1，Cx43-shRNA-2，Cx43-shRNA-3，Cx43-shRNA-4中，Cx43-shRNA-1荧光表达率最高，见图6。将转染36 h后的细胞进行裂解，获取RNA，反转录成cDNA，通过RT-PCR分析Cx43的相对表达量。相对于空载对照组Cx43-CON，其他组Cx43的表达量均明显下降，Cx43-shRNA-1组的Cx43表达量最低，表明Cx43-shRNA-1的抑制效率最高，其抑制率>75%，见图7。

2.7  SW1353细胞稳转细胞株的筛选及鉴定结果  用转染后抑制效率最高Cx43-shRNA-1慢病毒质粒转染SW1353细胞。转染48 h后，未转染的SW1353作为空白组，对照组和实验组分别取自复苏后的6株SW1353细胞样本，并在转染前后做自身对照，对照组为：SW1353-sh-con-1，SW1353-sh-con-2，SW1353-sh-con-3，SW1353-sh-con-4，SW1353-sh-con-5，SW1353-sh-con-6，感染了Cx43-shRNA-1慢病毒载体的SW1353细胞作为实验组：SW1353-sh-1-1，SW1353-sh-1-2，SW1353-sh-1-3，SW1353-sh-1-4，SW1353-sh-1-5，SW1353-sh-1-6。对上述细胞进行裂解，获取RNA，反转录成cDNA，通过RT-PCR分析Cx43在各组细胞中的的相对表达量，见图8；SW1353细胞稳转细胞株中Cx43蛋白的表达见图9。根据结果筛选出良好的稳转株为后续研究做准备。

骨关节炎是一种常见的破坏性、退行性关节慢性疾病，可导致患者关节的疼痛、僵硬和功能受限^[1-3]，是骨关节致畸和功能丧失的最主要原因，迄今为止尚无有效的治疗方法。如何阻断骨关节炎的损伤进程并修复已经发生病变的关节组织是骨关节炎治疗领域亟待解决的临床难题。而骨关节炎进程中最先受累的是关节软骨组织，相应地，关节软骨在骨关节炎中的修复与重建一直是骨关节炎基础研究领域的热点。而干细胞疗法可以利用间充质干细胞抑制骨关节炎的发展并间接促进组织修复和再生，成为治疗骨关节炎的新方向。缝隙连接在干细胞与软骨细胞之间的物质传递作用是干细胞疗法得以实现的关键因素之一，如何利用缝隙连接提高干细胞治疗的效率，改善骨关节炎关节软骨细胞的微环境成为骨关节炎干细胞疗法亟待解决的问题。 

缝隙连接是包含细胞内通道的特殊胞膜区域，同时也是一种细胞间连接方式，相邻细胞间可通过缝隙连接所介导的细胞缝隙连接通讯进行信息和能量物质的交换，对细胞内环境稳定、新陈代谢、增殖和分化等生理过程起着重要的调控作用^[4]。处于发育阶段及成熟的骨组织中，缝隙连接蛋白43(connexin 43，Cx43)是表达最丰富的一种缝隙连接蛋白，在软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞及间充质干细胞中均有表达^[5-6]。Cx43缺失可导致以成骨细胞表面标志物减少及骨矿化能力下降为主的功能障碍^[7-8]。Cx43在维持关节软骨代谢稳态中有着重要作用，被认为与骨关节炎发生有着密切关系。Cx43作为软骨细胞之间及细胞与外界物质和能量交换的重要缝隙连接蛋白之一，对分解代谢物质的释放和周围细胞之间的通讯有重要调节作用。

为揭示Cx43在骨关节炎中发挥的作用，及软骨细胞的细胞间通讯中所起的介导作用及其机制，为骨关节炎的干细胞治疗探索新的途径，此次研究构建小鼠膝骨关节炎动物模型，并对膝关节软骨样本进行免疫组织化学染色，检测Cx43表达水平；同时通过RT-PCR检测软骨细胞(SW1353)中Cx43的表达水平，并构建其shRNA慢病毒载体，转染SW1353细胞后鉴定，筛选出稳定转染的软骨细胞(SW1353)细胞株，为骨关节炎治疗提供新的研究方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  小鼠自身对照、体外细胞实验。

1.2   时间及地点 于2017年4月至2019年6月在首都医科大学北京口腔医学研究所进行。

1.3   材料

1.3.1  实验动物  实验选取6只10周龄的SPF级C57BL/6小鼠，体质量平均(20±3)g，动物来源：国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心，许可证号：SCXK(川)2015-030。

1.3.2  软骨细胞(SW1353)细胞株  由亚太恒信生物科技(北京)有限公司提供。

1.3.3  主要实验仪器和试剂  Leica石蜡包埋机；CO₂培养箱(Panasonic SANYO MCO-15AC)；离心机(瑞江 RT-TDL-40B)；显微镜(COIC XDS-1B)；MEM Alpha、胰酶、嘌呤霉素(Puromycin)(均为Gibco)；胎牛血清(康源生物)；DMSO(Sigma)；10 cm Cell Culture Dish，6/24/96 Well Cell Culture Plate(均为NEST)；冻存管(AXYGEN)；293T细胞(上海生博生物医药科技有限公司)；Vectastain Elite ABC试剂盒和DAB过氧化物酶底物试剂盒(均为Vector Labs；Burlingame，CA)；兔抗Cx43抗体(1∶1 000)(sigma，Cat. Number C6219, St Louis, MO)；兔IgG(Cat. Number 31235, Thermo Scientific, Waltham, MA)。

1.4  实验方法

1.4.1  实验动物及分组  实验选用C57BL/6小鼠6只，采取自身对照，以小鼠右侧后肢为实验侧手术诱导骨关节炎，左侧后肢为对照侧行假手术，术后4周收样。

1.4.2  建立小鼠膝骨关节炎模型  使用前交叉韧带横切术(anterior cruciate ligament transection，ACLT)构建小鼠关节不稳定模型^[9]。具体方法如下：水合氯醛腹腔注射麻醉后消毒双侧后肢，备皮，于双侧膝关节前方的皮肤处作约3 mm长的纵行切口后行膝关节内侧切口。直视下分离膑腱(见图1A)，将膑腱轻柔拨向外侧(见图1B)，用手术刀尖划断实验侧前交叉韧带(见图1C)。经抽屉试验确认前交叉韧带完全切断后缝合关节腔软组织和皮肤。对照侧仅做膝关节内侧切口，不予切断前交叉韧带，直接缝合关节腔软组织和皮肤。术后给予正常饮食。建模后4周麻醉后处死小鼠，取双侧膝关节及相应的股骨及胫骨，固定于40 g/L多聚甲醛溶液中过夜后放入5 g/L多聚甲醛溶液中继续保存。

1.4.3  标本及切片制备  双蒸水冲洗12个样本后置入400 mL 10%EDTA溶液中脱钙，每日更换脱钙液，脱钙共计20 d。脱钙完成后使用双蒸水冲洗，之后进行梯度脱水，依次使用体积分数70%，80%，90%，95%，100%的乙醇使组织脱水，每个梯度8 h。将标本置入二甲苯进行透明，直至组织块不漂浮于二甲苯上。组织块浸入融化状态的石蜡液体中，30 min后进行包埋。制备石蜡切片并编号，调整方向使刀片与膝关节的冠状面平行，并作连续切片，每张切片厚4 μm，切片以实验分组的顺序进行编号并作相应标记。切片完成后放入50 ℃烤箱中过夜。

1.4.4  甲苯胺蓝染色  ①脱蜡：将干燥切片放入氢氧化钾的无水乙醇饱和溶液中浸泡10-15 min，无水乙醇清洗3次；②水化：体积分数100%，95%，90%，80%，70%乙醇梯度水化；自来水冲洗3次，每次5 min；浸染于甲苯胺蓝染液中10 min；自来水清洗去多余染液；体积分数70%，80%，90%，95%，100%乙醇梯度脱水；二甲苯透明，中性树胶封固后置于显微镜下观察。

1.4.5  免疫组织化学染色  标本及切片制备同前，用Vectastain Elite ABC试剂盒和DAB过氧化物酶底物试剂盒在石蜡包埋的小鼠膝关节冠状切片上进行免疫组织化学染色，加入兔抗Cx43抗体(1∶1 000)检测小鼠膝关节Cx43的表达；以未免疫兔IgG作阴性对照。

1.4.6  SW1353细胞培养  从液氮中取出SW1353冻存细胞，置37 ℃水浴中振摇使细胞快速融化；细胞冻存液加入10 mL无血清DMEM培养基，1 000 r/min离心5 min后吸弃上清；用新鲜的完全培养液悬浮细胞后，传至培养皿中培养，待细胞长满后传代。细胞长至单层后倾去培养液；用温的1×PBS洗3次；加入适量胰酶，转动培养皿，使胰酶能浸润全部皿底；显微镜下观察，细胞间的胞间连丝蛋白被消化脱落，细胞呈类圆形，加入含血清培养基终止消化；将细胞吹落，收集进10 mL离心管，600 r/min，5 min离心，弃上清，重悬细胞；传代培养。第3代细胞用于实验。

1.4.7  SW1353细胞对嘌呤霉素耐药浓度的筛选  制备SW1353细胞悬液，血球计数板计数；铺板：5 000个细胞/24孔，共10个24孔，37 ℃、CO₂培养箱培养过夜；当细胞汇合度达到30%-40%时，配置如下质量浓度的嘌呤霉素：0，0.5，1，1.5，2，3，4，5，6，7 mg/L；每个24孔加入1 mL上述各质量浓度的嘌呤霉素，37 ℃、CO₂培养箱培养3 d左右，全部细胞死亡的最低质量浓度作为该细胞对嘌呤霉素的最佳耐药质量浓度。

1.4.8  RT-PCR检测SW1353细胞中Cx43、Cx37、Cx40、Cx45、Cx46的mRNA表达  用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA并合成cDNA。使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析。qRT-PCR反应在PTC-220实时荧光定量PCR仪上进行。分别设计Cx43、Cx37、Cx40、Cx45及Cx46的引物序列进行实验。Cx43上游引物为5'-TTT GAT GGA CCT GGA GGA AAT C-3'，下游引物为5'-TGA GCA TCC CCT CCA ATA CC-3'；Cx37上游引物：5'-ATT AAG GAG CAT GGC GAC TTC T -3'，下游引物：5'-CCC AGG AGG AAA AGC ATG AG-3'；Cx40上游引物：5'-ACA CCA CCC CCC GAC TTT A-3'，下游引物：5'-TTA TTG CTG AAG GGA TTG AAG AAT T-3'；Cx45上游引物：5'-AAT GCT AAG ATC GCC TAC AAG CA-3'，下游引物： 5'-CTC CTC ATG GCT GCC ATA CTG-3'；Cx46上游引物：5'-CAA CAC GGT GGA CTG CTT CA-3'，下游引物 5'-AGG CCA CCG CCA GCA T-3'。并设计相应的GAPDH上游引物和下游引物，以GAPDH为内参，并用2^-∆∆Ct方法计算。

1.4.9  构建Cx43 shRNA慢病毒载体  依据Gene Bank小鼠Cx43基因序列(NC_000076.6)，按照RNA干扰序列设计原则，设计4个shRNA干扰靶点Cx43-shRNA-1，Cx43-shRNA-2，Cx43-shRNA-3，Cx43-shRNA-4，并同时设计阴性对照序列。再按照shRNA结构特点，shRNA模板中的loop结构选用了CTCGAG以避免形成终止信号，正义链模板的5'端添加了CCGG，与AgeⅠ酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5'端添加了AATT，与EcoR I酶切后形成的粘端互补，设计对应shRNA的DNA正反义链。取相应的正义链和反义链寡核苷酸，在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95 ℃ 5 min；85 ℃ 5 min；75 ℃ 5 min；70 ℃ 5 min；4 ℃保存。退火处理后得到浓度为10 mol/L的shRNA模板。将所得模板溶液稀释50倍，终浓度为200 μmol/L，用于连接反应。将处理好的的目的片段通过T₄连接酶将其与AgeⅠ和EcoR I双酶切后的载体Pglv2-U6-Puro链接，4 ℃过夜。连接细菌感受态细胞，涂到含50 mg/L Ampicillin LB平板上培养16 h。从每块平板上挑取5个菌落，接种到含50 mg/L Ampicillin的LB培养基中，37 ℃培养16 h。使用碱裂解法抽提质粒，对抽提好的质粒用EcoR I进行单酶切鉴定后送测序。通过测序对比，挑选序列正确的克隆即为成功构建的Cx43-shRNA重组慢病毒载体。

从液氮中取出冻存的293T细胞，置37 ℃水浴中振摇使细胞快速融化；细胞冻存液加入5-10 mL无血清DMEM培养基，1 000 r/min离心5 min后吸弃上清；用新鲜的完全培养液悬浮细胞后，传至培养皿中培养，待细胞长满后传代；细胞长至单层后倾去培养液；用温的1xPBS洗3次；加入适量胰酶，转动培养皿，使胰酶能浸润全部皿底；显微镜下观察，细胞间的胞间连丝蛋白被消化脱落，细胞呈类圆形，加入含血清培养基终止消化；将细胞吹落，收集进10 mL离心管，600 r/min，5 min离心，弃上清，用新的含血清培养基重悬细胞；按适当比例传代培养。经消化、终止、离心后收集的细胞沉淀，用适量冻存液悬起，1 mL/管分装入冻存管；放入细胞冻存盒中于-80 ℃静置过夜，然后迅速移入液氮中长期保存。

293T细胞感染慢病毒H6373/H145，并筛选稳定表达细胞株。制备293T细胞悬液，血球计数板计数；5 000个细胞/ 24孔，共10个24孔，37 ℃、CO₂培养箱培养过夜；当细胞汇合度达到70%时，从-20 ℃冰箱取出Cx43-shRNA质粒(4种)于冰上融化；分别吸取0.8 μg质粒溶于250 μL无抗无血清DMEM，室温放置5 min；吸取20 μL lipo2000溶于2.5 mL无抗无血清DMEM，室温放置5 min；抽取250 μL的lipo2000稀释液加入质粒稀释液中，室温放置30 min；将24孔板中的293T细胞用无抗无血清DMEM 3次；将lipo2000与质粒稀释液加入细胞中，500 μL/孔，37 ℃、CO₂培养箱培养4-6 h；换成完全培养基(体积分数10%FBS+DMEM)，37 ℃、CO₂培养箱培养36 h；荧光显微镜下观察感染效率并拍照，筛选出转染效率高且荧光强的质粒。

将上一步构建出的4段干扰质粒中最有效的shRNA重组到慢病毒表达载体中，进行慢病毒包装。取对数生长期的293T细胞，按照每个10 cm的细胞培养皿5×10⁶细胞接种于细胞培养皿中，于37 ℃、体积分数5% CO₂的培养箱中培养过夜。转染前2 h，将细胞培养基更换为Opti-MEM    5 mL。取25 μL Lenti-Easy Packaging Mix加入1 455 μL Opti-MEM (37 ℃预热)中，取60 μL LipofectAMINE^TM2000 加入1440 μL Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5 min。制备质粒和LipofectAMINE^TM2000混合物，于37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中孵育。将3 mL质粒脂质体复合物加入到细胞培养皿中，轻轻混匀，于37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中孵育6 h后，将培养基更换为5 mL含50 μL丁酸钠 (110 g/L)的完全培养基，继续于培养箱中孵育6 h后，将培养基更换为10 mL正常完全培养基，继续于培养箱中孵育48 h后，荧光显微镜下观察并拍照，收集细胞培养上清液，离心半径10 cm，1 000 r/min离心5 min，去除细胞残余，留取上清液过滤后，置于-80 ℃保存备用。

选取细胞生长状态良好的293T细胞进行慢病毒滴度测定。病毒稀释用培养基为含有6 mg/L聚酰胺的体积分数10%胎牛血清的细胞培养基。按照每孔5×10³细胞接种96孔板，培养至30%-50%的融合密度。转染时用含有体积分数10%胎牛血清的细胞培养基进行梯度稀释，从1×10^-1稀释到1×10^-7。吸去培养基，混匀各管慢病毒稀释液，各取100 μL加入每孔细胞中，于37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中过夜培养。72 h后，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，用SYBR Green I Real Time PCR方法检测人细胞样本中目的基因mRNA转录水平的变化情况。病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍数。

1.4.10  Cx43 shRNA慢病毒载体转染SW1353细胞并筛选稳转株  制备SW1353细胞悬液，血球计数板计数；细胞铺板：2次分别铺96孔5 000个细胞/孔，24孔15 000个细胞/孔，37 ℃、CO₂培养箱培养过夜；当细胞汇合度达到50%时，从-80 ℃冰箱取出转染效率最高的病毒于冰上融化；用无抗无血DMEM以1∶10，1∶100，1∶1 000分别稀释以上病毒，每个96孔分别加入各稀释度的病毒100 μL，每个24孔分别加入各稀释度的病毒500 μL，于37 ℃、CO₂培养箱培养过夜后用体积分数10%FBS+DMEM+双抗换液；换液48 h后于荧光显微镜下观察感染效率，选择感染效率高且荧光强的孔，胰酶消化后终止，制备的单细胞悬液600 r/min，离心5 min；配置体积分数10%FBS+DMEM+双抗+嘌呤霉素培养基，用该培养基悬浮细胞沉淀，然后感染96孔的细胞铺96孔板，每个孔的细胞铺半板96孔；感染24孔的细胞铺24孔，每个24孔的细胞铺6个24孔，3-5 d更换新鲜的上述培养基(整个病毒操作过程严格遵照慢病毒操作手册)。挑选荧光强的单克隆孔，胰酶消化，血清终止后，用体积分数10%FBS+DMEM+双抗+嘌呤霉素培养基扩培，直至10 cm培养皿长满，1/3细胞冻存，收1/3细胞沉淀用于Western Blot检测，收1/3细胞沉淀加1 mL trizol混均用于RT-PCR检测，选取检测结果良好的稳转株进行复苏冻存备份。

1.4.11  Western Blot检测SW1353细胞稳转细胞株中Cx43蛋白的表达  根据RT-PCR结果，对筛选出的稳转株细胞进行Western Blot实验。分别收集转染前和转染后的SW1353细胞，并以同代SW1353细胞为空白组，采用BCA protein assay kit试剂盒，分别提取总蛋白。上样，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束行电转移，一抗孵育：用3%BSA-TBST稀释一抗(Connexin 43兔多抗，abcam，ab11370，1∶5 000)，室温孵育10 min，放4 ℃过夜。二抗孵育：用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG(H+L) HRP， 山羊抗小鼠IgG(H+L) HRP，1∶10 000，室温轻摇40 min。胶片曝光：10 s-5 min，显影2 min，定影。孵育内参：加GAPDH鼠单抗，用3%BSA-TBST稀释抗体，1∶20 000稀释，室温孵育2 h。二抗孵育：用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗小鼠IgG(H+L) HRP，室温轻摇40 min。TBST洗膜6次，每次3 min。ECL加到膜上后反应3-5 min，胶片曝光：10 s-5 min，显影2 min，定影。曝光后的胶片直接扫描，软件Image J转变图片格式JPEG为Tif，TotalLab Quant读取条带的积分吸光度(IA)值。

1.5  主要观察指标  ①骨关节炎动物模型中实验侧关节较对照侧关节有更高的国际骨关节炎协会(OARSI)病理学评分；②Cx43在小鼠骨关节炎软骨组织中的表达；③SW1353细胞的培养及嘌呤霉素耐药浓度的筛选；④Cx43、Cx37、Cx40、Cx45、Cx46在SW1353细胞中的表达；⑤Cx43、Cx37、Cx40、Cx45、Cx46在SW1353细胞中的表达；⑥Cx43-shRNA慢病毒载体构建结果；⑦SW1353细胞稳转细胞株的筛选及鉴定结果。

1.6  统计学分析  采用SPSS 17.0软件进行统计分析，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

骨关节炎的形成过程并不能简单概括为关节随年龄增加而导致的磨损，而是受累关节在炎性递质驱动下的关节组织异常重塑；该过程涉及到关节软骨细胞、滑膜成纤维细胞、骨细胞、成骨细胞和破骨细胞等多种细胞的相互作用^[11-13]。关节软骨作为组成关节的重要部分，其中包含的细胞外基质主要由Ⅱ型胶原和蛋白聚糖构成，保证了关节的无痛、低摩擦运动；软骨细胞则嵌入细胞外基质中保障了软骨的机械性能。随着骨关节炎的发生，软骨的动态平衡遭到破坏，即软骨的合成性因素与分解性因素失衡，体内的体液代谢环境也随之发生改变，而这种变化无疑会影响软骨自我修复的能力。目前，骨关节炎的治疗方法有非药物治疗、药物治疗、物理治疗、手术治疗和基因治疗、骨髓间充质干细胞移植术、生长因子治疗、间充质干细胞来源的外泌体治疗等^[14]，其中干细胞疗法和基因疗法是最有潜力的治疗手段。间充质干细胞具有促进软骨修复的作  用^[15-17]，因此，干细胞疗法成为治疗骨关节炎的新方向^[18]。但前提是间充质干细胞必须克服病变关节的异常代谢环境，而微环境的代谢异常易导致该疗法的失败^{[19- 20]}。基因疗法可通过直接调控分解代谢关键因子的相关基因从而调节骨关节炎的代谢环境^[21]，但基因疗法无法避免靶基因反义核糖核酸在异常代谢环境中的降解，且无法修复已损坏的软骨组织。研究发现，骨关节炎的体液代谢环境中雌激素、细胞因子、蛋白水解酶等在软骨修复过程中具有重要的调节作用。而这些物质的代谢与软骨细胞密不可分。

软骨细胞是关节软骨组织中高度特化的细胞，除参与软骨组织中的物质代谢外，对维持关节软骨的机械性能有重要作用。但是，软骨细胞和参与分解代谢的相关因子在骨关节炎进展过程中的相互作用错综复杂，包括多种信号通路转录水平和转录后水平的调控，其具体机制目前尚不明确。因此，明确如何平衡骨关节炎病变中代谢环境的变化，调控加剧骨关节炎发展的相关细胞因子及蛋白水解酶的基因表达水平，是阻断骨关节炎中软骨组织持续破坏进程和间接修复并重建已损伤组织的突破口。

缝隙连接蛋白是细胞间进行物质交换的重要通道，迄今为止，已发现21种人类和20种鼠类的缝隙连接蛋白基因。每种连接蛋白基因表达都具有组织或细胞特异性，大部分组织或细胞可以表达不止一种连接蛋白，其中Cx43是表达最广泛的一种^[22-24]。SCHWAB等^[25]用免疫荧光的方法检测到在大鼠的膝关节软骨和小鼠的透明软骨及软骨膜中均有Cx43的表达。ZHANG等^[26]用microarray的方法检测到在SD大鼠胫骨生长板的软骨细胞中，有Cx43基因的高表达。MAYAN等^[27]研究发现，软骨细胞在软骨组织中并不是孤立存在于软骨陷窝中，而是由细胞质臂相连接，位于其上的Cx43正是实现软骨细胞之间及其与外界物质和能量交换的关键。可见，Cx43在骨关节炎进展过程中的细胞间通讯和分解代谢物质释放过程中扮演着重要的角色。研究发现一些内源性和外源性的siRNA和miRNA能够直接改变相关基因的表达，在维持软骨完整性和微环境稳态有着重要作用^[28]。这类小分子RNA可以通过Cx43在细胞间发生直接的转运，影响一大群细胞甚至整个软骨的基因表达，从而导致整个关节软骨内的微环境发生改变^[27]。Cx43的过表达常常伴随着细胞间缝隙连接通讯的增加，这种通过缝隙连接通道增加的细胞间通讯被证实与基质金属蛋白酶的分泌有关^[29]。在用连接通道抑制剂处理的滑膜细胞中，白细胞介素1β诱导的基质金属蛋白酶显著减少^[29]。实验发现基质金属蛋白酶这类分解因子对关节软骨的破坏依赖Cx43通道的存在^[30]。Cx43参与形成的半通道是前列腺素E2、ATP等物质释放到细胞基质外的重要途径，GUPTA等^[31]在滑膜成纤维细胞中发现Cx43表达的增加导致基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13、ADAMTS4、ADAMTS5等基因的表达水平也相应升高，增加了细胞培养液中胶原酶的分泌。另外，研究还发现Cx43与炎症状态的形成有着紧密的关系^[32]。在神经系统中，沉默Cx43基因的表达可以显著下调炎症反应^[33-34]。TSUCHIDA等^[35]研究发现在干扰Cx43基因表达的成纤维滑膜细胞中，脂多糖诱导的白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等炎性细胞因子明显减少，此外，在类风湿关节炎大鼠模型中，沉默Cx43蛋白的表达明显减少了炎性因子的表达，关节的损伤也得到显著的改善^[35]。Cx43与炎性细胞因子以及基质金属蛋白酶的紧密关系，使得Cx43在骨关节炎微环境的调节及发病机制中发挥着重要作用^[31]。

此次研究通过诱导小鼠膝骨关节炎形成，对比膝关节实验侧和对照侧Cx43免疫组织化学染色病理切片结果发现Cx43在关节炎软骨组织中的表达上调，由此推断在骨关节炎的发生发展过程中，Cx43可能扮演着重要的物质传递角色，并可能对骨关节炎的微环境稳态具有重要的调节作用。而Cx43作为一种细胞间的缝隙连接蛋白，在干细胞治疗中，有可能为干细胞治疗中骨髓间充质干细胞与软骨细胞之间的通讯提供有利条件。此外，研究也发现，RT-PCR检测SW1353细胞中Cx43基因的表达水平高于连接蛋白家族的其他缝隙连接蛋白的基因表达水平，提示Cx43相比连接蛋白家族的其他缝隙连接蛋白在SW1353细胞中可能参与重要的分子生物学过程。在干细胞治疗中能否利用这一发现，在进一步揭示骨髓间充质干细胞与软骨细胞之间通讯机制的同时，提升骨关节炎的治疗效果，对干细胞疗法和基因疗法具有重要的现实意义。

慢病毒的特点是可感染分裂期和非分裂期细胞^[36]，有较广的宿主范围，可将外源基因有效整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。慢病毒具有感染效率高、容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小、被浓缩成高滴度等优点^[37-38]。腺病毒相关病毒虽可感染分裂期和非分裂期细胞，抗原性和毒性小，但其不能插入≥4.7 kb的外源基因片段，缺少高效包装细胞，制备复杂，滴度低，且腺病毒不能整合至细胞内，在体内不能稳定表达，反复应用易引起免疫反应。鉴于慢病毒与其他载体相比所具备的优势，是理想的基因转移载体^[39-41]。此次研究建立Cx43基因的shRNA慢病毒载体，测序比对成功，通过293T细胞包装后将其成功转染到目的细胞SW1353细胞中，检测细胞中Cx43的mRNA水平有显著下降，证实了Cx43敲低成功。

综上，此次研究发现Cx43在小鼠骨关节炎软骨组织中的表达较健康关节明显增加。说明在骨关节炎进展过程中，由于软骨细胞微环境的变化，各种细胞因子分泌增加，细胞间缝隙连接的通讯作用加强，导致Cx43的表达量明显升高。另外，Cx43 mRNA在软骨细胞(SW1353)中的表达水平明显高于Cx37、Cx40、Cx45和Cx46的基因表达水平，说明Cx43对各种细胞因子在软骨细胞间的传递起主导作用，也验证了软骨细胞中的Cx43在连接蛋白家族中具有主导地位。此次研究筛选出稳定转染的软骨细胞(SW1353)细胞株，为验证Cx43在骨关节炎中的作用机制奠定了基础。也为下一步研究Cx43对软骨细胞的作用机制，以及骨髓间充质干细胞和SW1353细胞的通讯机制创造了条件。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

缝隙连接蛋白43(connexin43)：在维持关节软骨代谢平衡的稳态中发挥着至关重要的作用， 它所参与形成的半通道(hemichannel)和缝隙连接(gap junction)在细胞与细胞外基质，以及细胞之间建立起直接的物质信号交换通道。同时，缝隙连接蛋白43的高表达和分布的变化都将影响软骨细胞结构和功能的完整性。

小发卡或短发卡RNA(a small hairpin RNA or short hairpin RNA，shRNA)：是一段具有紧密发卡环的RNA序列，常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。利用载体把shRNA导入细胞，载体中的U6 启动子确保shRNA总是表达；这种装载了shRNA的载体可被传递到子代细胞中去，从而使基因的沉默可被遗传。

293T细胞：293细胞是人肾上皮细胞系，有多种衍生株，比如HEK293，293T/17等，来源都是人胚胎肾细胞，其极少表达细胞外配体所需的内生受体，且比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，广泛应用于病毒包装。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

缝隙连接蛋白是细胞间进行物质交换的重要通道，迄今为止，已发现21种人类和20种鼠类的缝隙连接蛋白基因。每种连接蛋白基因表达都具有组织或细胞特异性，大部分组织或细胞可以表达不止一种连接蛋白，其中Cx43是表达最广泛的一种。有研究用免疫荧光的方法检测到在大鼠的膝关节软骨和小鼠的透明软骨及软骨膜中均有Cx43的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程