2.1  原儿茶酸对大鼠软骨细胞增殖抑制作用  MTT检测结果显示，在10-50 mg/L的浓度范围内，原儿茶酸能够明显促进软骨细胞的增殖，其中30 mg/L原儿茶酸的生长刺激作用最强。大于50 mg/L的原儿茶酸可明显抑制软骨细胞的增殖，见图1，因此实验选择10，30，50 mg/L作为后续实验研究的有效浓度。

2.2  原儿茶酸对大鼠软骨细胞DNA含量的影响  Hoechst 33258结果显示，原儿茶酸中剂量组DNA含量接近于空白组，原儿茶酸低剂量组和原儿茶酸高剂量组DNA含量较原儿茶酸剂量组低，说明30 mg/L原儿茶酸能更有效保护软骨细胞，促进软骨细胞的增殖，见图2。

2.3  原儿茶酸对大鼠软骨细胞中糖胺聚糖含量的影响  原儿茶酸中剂量组糖胺聚糖含量较模型组增加，同时接近空白组，见图3，说明原儿茶酸可对抗白细胞介素1β引起的软骨细胞炎性反应。

2.4  原儿茶酸对大鼠软骨细胞中骨关节炎相关基因表达的影响  蛋白聚糖和Ⅱ型胶原A1是软骨特异性基因，基质金属蛋白酶13在骨关节炎发病过程中起着重要的作用，对软骨基质的降解等有较大影响，被认为是最重要的炎症因子^[8-9]。定量反转录PCR结果显示，原儿茶酸低、中、高剂量组Ⅱ型胶原A1及SOX9mRNA表达水平高于模型组，说明药物对软骨细胞具有保护作用，其中以原儿茶酸中剂量组效果最好。而模型组中基质金属蛋白酶13呈高表达，原儿茶酸可抑制基质金属蛋白酶的表达水平，见图4，说明原儿茶酸具有抗炎作用，对软骨细胞具有保护作用。

2.5  原儿茶酸对大鼠软骨细胞形态、存活的影响

2.5.1  苏木精-伊红染色  如图5所示，模型组中软骨细胞部分已裂解，且胞浆有炎症损伤表现。原儿茶酸低、中、高剂量组细胞形态变化较小，说明原儿茶酸可对抗白细胞介素1β引起软骨细胞的损伤，进而能够保持软骨细胞的状态。

2.5.2  钙黄绿素/PI染色  激光共聚焦扫描显微镜可见，空白组少见死细胞，而模型组存在大量死细胞，原儿茶酸中剂量组死细胞数量与空白组接近，但原儿茶酸低、高剂量组仍可见较多的死细胞，见图6。说明原儿茶酸可对抗细胞损伤后凋亡的进程，对软骨细胞具有保护作用。

2.5.3  番红O染色  结果如图7所示，空白组细胞分泌大量蛋白多糖分泌，原儿茶酸低、中、高浓度组分泌的蛋白多糖与剂量成一定浓度的递增而后递减，其中原儿茶酸中剂量组与空白组接近，模型组分泌量最少，说明损伤后的软骨细胞减少蛋白聚糖的分泌，而经原儿茶酸保护后软骨细胞的蛋白聚糖分泌可有效恢复。

2.5.4  细胞免疫学染色  Ⅱ型胶原主要由软骨细胞分泌到细胞外^[10]。如图8所示，各组细胞均表达Ⅱ型胶原，其中空白组呈强阳性表达，实验组阳性表达强度接近空白组，而模型组呈弱阳性表达，说明损伤后的软骨细胞胶原分泌减少。

由于关节软骨无神经血管分布，且再生能力较差，软骨缺损的彻底治愈成为骨关节炎临床治疗和基础研究的热点和难点^[1-2]。软骨细胞是软骨组织中惟一存在的细胞类型，其表型及状态是维持软骨组织的形态及功能的重要因素之一。已有研究表明，软骨损伤可刺激基质金属蛋白酶的过表达，并导致关节软骨细胞活性降低，且软骨的致密细胞外基质会阻碍软骨发生器向损伤部位的迁移，导致骨关节炎发生^[3-4]。目前在临床上治疗骨关节炎的方法主要为药物和手术治疗，其中药物有抗炎和镇痛药物，但是这些药物都不能有效阻止和减缓疾病的发展。口服水杨酸虽可使骨关节炎患者的关节软骨蛋白合成减少，但其易导致关节软骨发生表面纤维化，使骨关节炎的损伤加重。所以寻求一种既能够缓解临床症状，也能阻止或缓解疾病的发展的新型的药物是未来研究的方向。

有研究认为关节软骨保护剂对骨关节炎有治疗的潜力^[5]，但是透明质酸、氨基葡萄糖等目前常用的软骨保护剂缺乏抗炎及抗氧化作用。越来越多研究发现，中药单体对多种疾病具有较好的临床治疗作用，其具有独特的活性成分，多靶点和最小不良反应等特点。

原儿茶酸，化学名为3，4-二羟基苯甲酸，是从中药冬青科植物冬青中分离得到的主要黄酮类化合物之一，具有较强的抗氧化能力，对金黄色葡萄球菌、链球菌等具有明显抑制作用，并有收敛和促进伤面愈合的作用，可用于治疗炎症、发热和癌症等^[6-7]。实验拟探索原儿茶酸对软骨的保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  细胞学实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年9月至2018年9月在广西医科大学基础实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  动物  清洁级新生24 h内的雄性SD大鼠2只，由广西医科大学实验中心提供，动物许可证号SCXK桂2014-0002。实验于2017年10月经广西医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号201710008。

1.3.2  主要试剂  原儿茶酸(纯度≥98%，白色结晶粉末)、100×青霉素-链霉素、0.25%胰蛋白酶、苏木精-伊红染色试剂盒购自北京索莱宝有限公司；胎牛血清、DMEM培养基购自Gibeo公司；黄绿素、MTT、碘化丙啶(PI)购自美国Invitrogen公司；Ⅱ型胶原一抗、DAB显色试剂盒购自博士德公司；Ⅱ型胶原酶购自美国Sigma公司；PBS购自迈新公司购；番红染色试剂盒购自基尔顿生物科技(上海)有限公司；总RNA提取试剂盒购自天根公司。

1.3.3  主要仪器  二氧化碳恒温培养箱购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；倒置相差显微镜购自Olympus公司；全波长酶标仪、微量紫外分光光度计购自Themo公司；超净工作台购自上海博迅实业有限公司；荧光实时定量PCR仪购自美国Eppendorf公司。

1.4  方法

1.4.1  软骨细胞的提取与培养  将2只乳鼠拉颈处死，浸泡于体积分数75%乙醇中消毒15 min后，无菌条件下切除两侧股骨，用眼科剪将股骨两端软骨剪下，用含青链霉素双抗液的PBS冲洗数次；将软骨组织剪碎至约1 mm³大小，转移到15 mL离心管中加入0.25%胰蛋白酶消化30 min，弃上清液，PBS清洗3次，加入2 g/L的Ⅱ型胶原酶并置入体积分数5% CO₂的37 ℃恒温培养箱中消化3.0-4.0 h。200目不锈钢筛网过滤后，收集细胞，1 000 r/min离心5 min；弃上清液，加入含体积分数10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的DMEM培养基，用吸管反复吹打重悬细胞，接种于10 cm培养皿中，于37 ℃，体积分数5% CO₂培养箱中培养。24 h后换培养液除去未贴壁细胞，之后每3 d换液，细胞融合后用0.25%胰酶消化3-5 min，含体积分数10%胎牛血清DMEM培养基终止消化，按1∶3的比例传代。取第3代细胞用于后续实验。

1.4.2  细胞毒性测定  以MTT法测量原儿茶酸对关节软骨细胞的细胞毒性作用。将细胞按2 000个/孔接种于96孔培养板中，8 h后更换含有不同浓度原儿茶酸(1-150 mg/L)的DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)，继续培养24 h。每孔加 20 mL MTT(5 g/L)，置于细胞培养箱中4 h；去培养基，每孔加150 μL DMSO，孵育10 min，酶标仪测量570 nm处的吸光度值。

1.4.3  细胞分组与干预  第3代软骨细胞分为5组：空白组、模型组、原儿茶酸低剂量(10 mg/L)组、原儿茶酸中剂量(30 mg/L)组、原儿茶酸高剂量(50 mg/L)组，每组设置3个副孔。其中空白组仅加入培养液；模型组加入含10 mg/L的白细胞介素1β的培养液；原儿茶酸低、中、高剂量组加入含10 mg/L白细胞介素1β的培养液以及10，30，50 mg/L 原儿茶酸。干预时间为24 h。

1.4.4  Hoechst 33258检测DNA含量  细胞干预后，用PBS冲洗3次，滴加500 μL蛋白酶K溶液，56 ℃水浴6 h；再加入1 μL Hoechst 33258避光保存，取上清，以荧光酶标仪检测460 nm处吸光度值。基于小牛胸腺DNA标准曲线，计算出样本中DNA含量。

1.4.5  糖胺聚糖含量检测  细胞干预后，用PBS冲洗3次，滴加500 μL蛋白酶K溶液，56 ℃水浴6 h；分别取4 μL样品，并加入100 μL已配好的DMMB溶液，混合均匀后，转移至96孔板中，每孔200 μL，荧光酶标仪检测525 nm处的吸光度值，根据标准曲线，计算出样本中糖胺聚糖含量。

1.4.7  细胞染色 

苏木精-伊红染色观察细胞形态变化：将各组细胞爬片置于40 g/L多聚甲醛中，固定30 min，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加苏木精染液30 s后放置自来水反蓝3 min；滴加伊红染液1 min。倒置显微镜观察细胞形态。

      细胞活力检测：取出细胞爬片，PBS冲洗3次，滴加钙黄绿素AI/PI混合液，避光染色5 min，将爬片放置载玻片上，激光共聚焦显微镜下观察细胞生存情况。

      细胞免疫学染色观察Ⅱ型胶原的表达情况：将各组细胞爬片置于40 g/L多聚甲醛中固定30 min，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min，PBS冲洗3次；滴加非免疫动物血清室温孵育15 min，勿洗；滴加Ⅱ型胶原一抗置于4 ℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3次；滴加生物素标记的二抗，室温孵育15 min，冲洗3次；滴加SP溶液，室温孵育15 min，冲洗3次；滴加新鲜配制的DAB显色液显色3-5 min，苏木精轻度复染5 min，自来水反蓝3-5 min，倒置显微镜观察细胞Ⅱ胶原表达情况。

      番红O染色观察细胞蛋白多糖的分泌情况：将各组细胞爬片置于40 g/L多聚甲醛中固定30 min，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加番红O染液染色5 min，倒置显微镜观察细胞白多糖分泌情况。

1.5  主要观察指标  软骨细胞的增殖、形态以及骨关节炎相关基因的表达水平的表达情况。

1.6  统计学分析  应用 SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK检验，以α=0.05为检验水准。

      随着社会老龄化程度的进展，退行性骨关节炎病患越来越多。骨性关节炎一般以疼痛、肿胀等临床症状多见，给患者带来巨大的痛苦和经济上的负担。关节软骨由于缺乏神经血管等组织，导致其再生能力较差。已有研究表明关节软骨细胞是维持软骨基质的合成和分解代谢的惟一细胞类型并证明了关节软骨细胞的过度凋亡是骨关节炎发病的主要原因^[11-12]。TSUCHIYA等^[13]证明了细胞介导的SOX9基因治疗可能是透明软骨损伤的新策略。MA等^[14]也证明了蛋白聚糖是软骨细胞外基质的重要组成部分，软骨细胞外基质在维持软骨细胞形态和功能中起到重要的作用。现临床上治疗骨关节炎的主要有药物手术等治疗手段。目前应用药物治疗是最为有效的治疗方法之一。

原儿茶酸广泛存在中药冬青科植物四季青中^[15]，其化学成分类似于没食子酸，被归类于一种含有抗氧化的多酚结构的化合物，具有抗菌、抗炎和抗氧化作用。WANG等^[16]在他们的研究中证明了原儿茶酸能够通过核因子κB和MAPK信号通路抑制脂多糖刺激的BV2小胶质细胞的炎症反应。GUAN等^[17]发现原儿茶酸具有增强神经干细胞的分化和维持其表型的作用。因此实验通过观察软骨细胞的形态、增殖、细胞外基质合成和检测软骨特异性基因表达来评估原儿茶酸对退变的软骨细胞的修复作用。

软骨细胞表型的维持是软骨组织工程和抑制骨关节炎发展的主要挑战之一^[18-19]。此次实验的结果表明原儿茶酸具有抑制白细胞介素1β所诱导炎症反应并能促进受损的软骨表型及增殖，其中30 mg/L原儿茶酸能更有效保护和促进大鼠软骨细胞增殖的作用，结果与苏木精-伊红和钙黄绿素/PI染色结果相符。骨关节炎细胞中加入30 mg/L原儿茶酸后SOX9与Ⅱ型胶原mRNA的表达水平升高，这与糖胺聚糖表达变化趋势一致。已有大量的文献表明在软骨细胞中通过靶向核因子κB信号通路下调基质金属蛋白酶13基因的表达从而抑制骨关节炎的发生和发展^[20-22]。实验发现原儿茶酸可抑制炎症相关因子基质金属蛋白酶13的表达，证明原儿茶酸在治疗软骨细胞炎症中具有一定的作用。推测原儿茶酸有可能通过靶向核因子κB信号通路下调基质金属蛋白酶13的基因表达从而抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞的炎症反应。通过一定的浓度的原儿茶酸体外对软骨细胞的培养研究，只能从一定的程度上反应原儿茶酸对软骨细胞的作用效果，但是无法模拟原儿茶酸在体能对软骨细胞的保护作用。并且由于存在着物种的不同药物治疗的浓度及作用的程度不同，所以质量浓度为30 mg/L的原儿茶酸对人的骨关节中软骨细胞的保护是否有效还没有被验证。

综上，原儿茶酸在体外能够维持SD大鼠软骨细胞表型和促进细胞增殖的最佳质量浓度为30 mg/L。证明了广泛存在于中药冬青科植物冬青的原儿茶酸在软骨细胞受到破坏的时候可以作为一种潜在的药物保护手段，但是要证明其在骨关节炎治疗中的作用需要进一步的动物实验和更深入研究。 

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程 

文题释义：
原儿茶酸：来源于鳞始蕨科植物乌蕨的叶和冬青科植物冬青的叶，具有抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、抑菌、镇痛等多方面药理活性，是一种重要的天然活性物质。近年来的研究发现了其具有抗氧化、抗癌及介导肿瘤细胞凋亡等许多新的药理作用。
软骨细胞：埋藏在软骨间质内的小腔，俗称软骨陷窝。是软骨组织中惟一存在的细胞，在软骨组织分泌蛋白多糖、Ⅱ型胶原的细胞外基质形成致密的结构。其在维持软骨组织的形态和功能上起到重要的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨性关节炎一般以疼痛，肿胀等临床症状多见，给患者带来巨大的痛苦和经济上的负担。关节软骨由于缺乏神经血管等组织，导致其再生能力较差。已有研究表明关节软骨细胞是维持软骨基质的合成和分解代谢的惟一细胞类型并证明了关节软骨细胞的过度凋亡是骨关节炎发病的主要原因。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程