多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素-淫羊藿素微球复合支架促进骨髓间充质干细胞的募集

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2347

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (34): 5532-5537.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2347

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多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素-淫羊藿素微球复合支架促进骨髓间充质干细胞的募集

刘锌¹，杜斌¹，孙光权¹，曹金星²，江晓红²

¹南京中医药大学附属医院，江苏省中医院，江苏省南京市 210029；²南京理工大学化工学院，江苏省南京市 210094

收稿日期:2020-02-10 修回日期:2020-02-13 接受日期:2020-03-09 出版日期:2020-11-08 发布日期:2020-09-11
通讯作者: 杜斌，博士，主任医师，南京中医药大学附属医院，江苏省中医院，江苏省南京市210029
作者简介:刘锌，男，1990年生，2016年南京中医药大学毕业，硕士，医师，主要从事股骨头坏死的中西医结合治疗研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年基金(81804117)

Porous beta-tricalcium phosphate-polypyrrole-biotin-icariin composite scaffold promotes recruitment of bone marrow mesenchymal stem cells

Liu Xin¹, Du Bin¹, Sun Guangquan¹, Cao Jinxing², Jiang Xiaohong²

¹Jiangsu Hospital of Chinese Medicine, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China; ²Institute of Chemical Industry, Nanjing University of Science and Technology, Nanjing 210094, Jiangsu Province, China

Received:2020-02-10 Revised:2020-02-13 Accepted:2020-03-09 Online:2020-11-08 Published:2020-09-11
Contact: Du Bin, MD, Chief physician, Jiangsu Hospital of Chinese Medicine, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
About author:Liu Xin, Master, Physician, Jiangsu Hospital of Chinese Medicine, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81804117

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

β磷酸三钙-聚吡咯-生物素：亲和素-生物素复合物是目前已知的最强非共价结合物，其结合不受温度、pH值及蛋白变性剂等影响，聚吡咯与磷酸三钙混合可赋予支架整体存在导电特性，其表面适合多种细胞黏附与生长。通过化学反应合成方法，以聚吡咯为亲和素，形成β磷酸三钙-聚吡咯-生物素结构，利用生物素多靶点结合能力提高支架与骨诱导因子的结合能力。

载药支架：骨组织工程支架负载药物能有效提高其修复性能。淫羊藿素是中药有效单体，其类似于雌激素的化学结构，易于与生物素产生非共价结合，从而达到更好地控释，且能保持成骨诱导作用。因此该载药方式可能将支架性能进一步理想化。

背景：淫羊藿素作为成骨诱导活性物质已被广泛负载于骨科支架材料中，然而现有研究基本均以淫羊藿素聚合微球形式直接放置于支架孔隙中，导致其释放与支架降解难以同步，且局部有效利用率较低。

目的：制备多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素-淫羊藿素微球复合支架，初步探索该支架与骨髓间充质干细胞共培养的生物学特点。

方法：以FeCl₃为氧化剂，通过氧化化学合成聚吡咯，将聚吡咯、生物素与β磷酸三钙共混合并进行电化学合成，此后采用3D打印技术制备多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架，运用HDDD反应制备淫羊藿素-生物素-聚乳酸微球，并将二者组合。将同样3D打印制备的负载淫羊藿素-聚乳酸微球的多孔β磷酸三钙支架设置为对照组。检测并对比两组支架的抗压强度、孔隙率、载药量、药物结合力及药物缓释性能，绘制淫羊藿素释放曲线，扫描电镜观察两组支架对骨髓间充质干细胞的生物学作用。

结果与结论：多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架的载药量、药物结合力及药物缓释性能显著优于对照组(P < 0.05)，扫描电镜下支架表面贴壁生长的骨髓间充质干细胞数量显著高于对照组(P < 0.05)，两组支架抗压强度及孔隙率差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明，多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架较传统缓释支架进一步提高了载药能力及缓释性能，并具有良好的力学强度，同时可能具有更好的募集骨髓间充质干细胞参与支架周围骨修复的作用。

ORCID: 0000-0001-8284-1994(刘锌)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞">, , 磷酸三钙">, , 聚吡咯-生物素">, , 淫羊藿素">, , 支架">, , 骨">, , 微球

Abstract:

BACKGROUND: Icaritin, as an osteogenic inducible active substance, has been widely loaded in orthopedic scaffold materials. However, in most of the existing studies, it is mainly placed in the pores of the scaffold directly in the form of polymerized microspheres, which makes it difficult to release icaritin in step with scaffold degradation, and the local effective utilization rate is low.

OBJECTIVE: To prepare porous β-tricalcium phosphate-polypyrrole-biotin-icariin microspheres composite scaffolds, and preliminarily explore the biological characteristics of coculture of the scaffolds and bone marrow mesenchymal stem cells.

METHODS: FeCl₃ was used as oxidant, and polypyrrole was synthesized by oxidative chemical synthesis. Polypyrrole, biotin and β-tricalcium phosphate were mixed and electrochemical synthesis was carried out. After that, the porous β-tricalcium phosphate-polypyrrole-biotin composite scaffold was prepared by three-dimensional printing technology. Icariin-biotin-polylactic acid microspheres were prepared by HDDD reaction and loaded on the scaffold above. The ordinary porous β-tricalcium phosphate scaffold prepared by three-dimensional printing was set as the control group and loaded with icaritin-polylactic acid microspheres. The compressive strength, porosity, drug loading, drug binding force and drug sustained release performance of the two groups of scaffolds were detected and compared, and the curve of icaritin release was drawn. The biological effects of the scaffolds on bone marrow mesenchymal stem cells were observed by scanning electron microscopy.

RESULTS AND CONCLUSION: The drug loading capacity, drug binding force and drug sustained release performance of the porous β-tricalcium phosphate-polypyrrole-biotin composite scaffold were significantly better than those in the control group (P < 0.05). The number of bone marrow mesenchymal stem cells growing on the surface of the scaffold under scanning electron microscopy was significantly higher than that of the control group (P < 0.05). There was no significant difference in the compressive strength and porosity of the scaffolds between the two groups (P > 0.05). The results confirmed that compared with the traditional sustained-release scaffolds, the porous β-tricalcium phosphate-polypyrrole-biotin composite scaffold further improves the drug loading capacity and sustained-release performance, and has good mechanical strength. Simultaneously, it may have a better role in recruiting bone marrow mesenchymal stem cells to participate in the bone repair around the scaffolds.

Key words:

stem cells">, , bone marrow mesenchymal stem cells">, , tricalcium phosphate">, , polypyrrole-biotin">, , icariin, scaffolds">, , bone">, , microspheres

中图分类号:

刘锌, 杜斌, 孙光权, 曹金星, 江晓红. 多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素-淫羊藿素微球复合支架促进骨髓间充质干细胞的募集[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(34): 5532-5537.

Liu Xin, Du Bin, Sun Guangquan, Cao Jinxing, Jiang Xiaohong. Porous beta-tricalcium phosphate-polypyrrole-biotin-icariin composite scaffold promotes recruitment of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(34): 5532-5537.

图/表（结果） 8

2.1 多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架的超微结构如图1所示，多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架表面粗糙而形态紧密规则，具有较多高度为50-100 μm的嵴状隆起，孔隙较多，孔隙间连通性好，微观表面积大，孔隙直径为10-50 μm不等，扫描电镜下支架表面可见少量金属样晶体光泽。

2.2 多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架负载淫羊藿素-生物素微球的超微结构如图2所示，微球直径在 2-20 μm范围，包裹规整，能较好的匹配支架形成的孔隙结构，微球与支架形成ABC系统，结合紧密。

2.3 支架表征测定结果

2.3.1 最大抗压强度多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架的最大抗压强度为(3.09±0.35) MPa，普通多孔β磷酸三钙支架的最大抗压强度为(3.00±0.24) MPa，两者坍塌0.5，1.0，1.5，2.0 mm时测得的最大抗压强度差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.3.2 支架孔隙率及载药量多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架的孔隙率为(62.12±3.97)%，载药量为(56.75±6.28) mg。普通多孔β磷酸三钙支架的孔隙率为(63.45±5.09)%，载药量为(31.77±5.83) mg。两组孔隙率差异无显著性意义(P > 0.05)，多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架载药量显著优于普通多孔β磷酸三钙支架(P < 0.05)，见图4。

2.3.3 药物结合力及绘制药物释放曲线多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架的药物结合力显著优于普通多孔β磷酸三钙支架(P < 0.05)，各时间点药物释放均较普通多孔β磷酸三钙支架缓慢，曲线平稳近似控释效果，直至 60 d时仍有(30.51±4.80)%以上药物尚未释放，而普通多孔β磷酸三钙支架在48 d时药物已基本释放完毕，见图5。

2.4 支架表面骨髓间充质干细胞数量支架与骨髓间充质干细胞共培养后3，7，15 d，两组支架周围骨髓间充质干细胞均能正常存活并增殖，提示两组支架均无细胞毒性。骨髓间充质干细胞呈黏附样附着于支架表面，部分呈团簇样聚集，通过扫描电镜下计数，如表1及图6，7所示，与普通多孔β磷酸三钙支架比较，多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架表面附着的骨髓间充质干细胞数量显著增多，差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

股骨头坏死的保髋治疗一直是骨科研究的热点。在过去的10年，有很多类型内植物材料被用于股骨头坏死死骨清理后的填充植骨，并经过了一定时间的随访，例如钽金属块、钛网架、磷酸三钙和聚乳酸支架等，但遗憾的是均未能取得一致性满意的结果^[1-3]。据临床报道，与自体松质骨相比，使用人工支架保髋疗效相对较差^[4]。在2019年5月进行的国际骨循环学会大会(ARCO 2019)中，与会专家认为目前运用具有良好力学强度的组织工程材料同时负载高效生物活性因子以促进支架周围骨修复，是进一步提高保髋临床疗效的可行方案。

课题组前期制备了3D打印β磷酸三钙淫羊藿苷微球缓释支架，该支架具有较理想的孔隙率、载药量及药物缓释特性^[5]，在动物实验中发现，相对于普通磷酸三钙支架，该支架能促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，有效降低破骨细胞活性，诱导支架区域附近的血管新生^[6]。然而与自体骨相比，其在各方面仍存在明显不足。

亲和素-生物素复合物(avidin-biotin complex，ABC)是目前已知的最强非共价结合物，且其结合不受温度、pH值及蛋白变性剂等影响，绝大多数核酸、蛋白质、多糖或脂类均可被耦联亲和^[7]。聚吡咯(Ppy)是一种高分子导电聚合物，由吡咯(Py)单体聚合，与磷酸三钙混合可赋予支架整体存在导电特性，其表面适合多种细胞黏附与生长^[8]。课题组尝试将两者混合后以聚吡咯为亲和素形成β磷酸三钙-聚吡咯-生物素结构，利用生物素(Biotin)的多靶点结合能力，期望能提高支架的载药量和缓释性能，此外有研究证明聚吡咯-生物素能有效捕获骨髓间充质干细胞外囊泡^[9]，有望同时提高支架对骨髓间充质干细胞的募集能力，进一步提高支架的生物学效能。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2019年7月至2020年1月在南京理工大学化工实验室及南京中医药大学附属医院中心实验室完成。

1.3 材料淫羊藿素(中国江苏艾康生物医药研发有限公司)；β磷酸三钙(中国昆山华侨科技新材料公司)；聚乳酸-羟基乙酸共聚物(中国武汉海山科技有限公司)；生物素(美国Sigma公司)；吡咯(中国上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；十二烷基苯磺酸钠(NaDBS)(中国上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；1-羟基苯并三唑(HOBT)(中国苏州昊帆生物科技有限公司)；4-二甲氨基吡啶(DMAP)(中国苏州昊帆生物科技有限公司)；甲酰胺(DMF)(中国苏州昊帆生物科技有限公司)；二环己基碳二亚胺(DCC)(中国苏州昊帆生物科技有限公司)；Percoll(国药集团化学试剂有限公司)；电化学工作站(南京理工大学化工学院)；电子万能试验机UTM4102S型(南京理工大学化工学院)；恒温恒湿孵育箱(Heraeus公司)；高效液相色谱仪Agilent1200型(南京理工大学化工学院)；扫描电子显微镜(日本HITACHI公司)；3D打印机Bio-Architect-Pro型(中国杭州捷诺飞生物科技公司)。

实验动物：清洁级SD大鼠6只用于制备骨髓间充质干细胞，6周龄，体质量200-220 g，购自上海西普尔-必凯实验动物中心(动物合格证号：SCXK沪-2019-0031)，饲养于南京中医药大学动物实验中心。该研究经由南京中医药大学附属医院动物伦理委员会批准。

1.4 实验方法

1.4.1 多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架的制备首先使用去离子水、聚丙烯酸钠、β磷酸三钙、羟甲基丙烯、纤维素等材料配制打印浆料，振荡30 min，加入0.1 mol/L吡咯搅拌30 min，滴加0.2 mol/L FeCl₃室温下搅拌5 h，聚合物通过过滤从反应混合物中分离出来，去离子水清洗以去除氧化剂和未反应物质。将上述反应后浆液使用3D打印机进行成型操作，喷头直径设置为500 μm，设置打印速度为100 mm/min，最终完成β磷酸三钙支架半成品模型。将此模型置于真空干燥箱中低温干燥24 h，然后进行烧结获得支架模型。称取一定质量的十二烷基苯磺酸钠、吡咯与生物素，加入一定量的去离子水，配成含有0.01 mol/L十二烷基苯磺酸钠、0.1 mol/L吡咯与0.001 mol/L生物素的电解液，调节pH值至4.1。以钛制作夹具，并将烧结获得的支架模型以夹具固定，将钛夹具作为工作电极，铂片作为对电极，浸入电解液，恒电位模式，电压1.2 V合成2 min，获得多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架。

1.4.2 淫羊藿素-生物素复合物的制备将一定量的生物素、淫羊藿素、1-羟基苯并三唑和4-二甲氨基吡啶置于甲酰胺溶液中，室温搅拌1 h，冰水浴冷却至0 ℃，滴加少量二环己基碳二亚胺，然后缓慢升至室温反应24 h，少量氯仿洗涤，再次蒸馏水洗涤，残余物悬浮于无水乙醇中，加热至80 ℃，过滤，滤饼用热无水乙醇洗涤2次，干燥后获得淫羊藿素-生物素复合物。

1.4.3 淫羊藿素-生物素-聚乳酸微球的制备称取 250 mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物及250 mg甲酰胺，超声条件下，将上述聚乳酸-羟基乙酸共聚物/甲酰胺加入蒸馏水20 mL振荡，加入50 mg淫羊藿素-生物素复合物，继续超声15 min。将10 g/L聚乙烯醇溶液缓慢滴入上述混合溶液进行乳化操作，超声15 min后得到淫羊藿素-生物素/聚乳酸-羟基乙酸共聚物复乳，再透析12 h以去除甲酰胺，最后高速10 000 r/min离心30 min，弃上清，PBS清洗2次，将所得混悬液离心并收集沉淀，放入冷冻干燥机干燥，即可得到淫羊藿素-生物素-聚乳酸微球。

1.4.4 支架负载微球将多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架放入离心管，配平后加入10 mL淫羊藿素-生物素-聚乳酸微球悬液以及5 mL 10%明胶，低速离心10 min，冷冻24 h，复合支架制备完成。共制备负载淫羊藿素-生物素复合物微球的多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架15个，其中3个用于抗压测试，6个用于支架孔隙、载药等测试，6个用于骨髓间充质干细胞共培养。

1.4.5 对照组支架的制备按团队前期制备方式^[5]，制备15个普通负载淫羊藿素微球的多孔β磷酸三钙支架，用法同上。

1.4.6 支架表征测定

(1)最大抗压强度测定：每组随机取3个支架，把支架固定于电子万能试验机上，横杆垂直方向压缩速度 0.1 mm/min，以支架被压缩坍塌2 mm时记录最大负荷值，由P=F/S测得压强并绘制曲线。

(2)支架孔隙率测定：支架载药前根据等体积液体置换法测定支架孔隙体积，孔隙率=支架孔隙体积/支架外骨架表观体积×100%。

(3)支架载药量测定：根据负载微球前后的微球悬液的质量差计算载药量，载药量=负载微球后载药支架质量-负载微球前支架质量。

(4)药物结合力测定：将支架浸泡于去离子水中进行超声振荡(40 kHz，180 W) 2 min，将支架取出，利用高效液相色谱法，对照标准品检测浸泡液体中淫羊藿素含量。色谱：ZorbaxSB-C18，流动相为乙腈-水(体积比1∶2)，流速0.5 mL/min，波长λ=210 nm。药物结合力与色谱结果呈负相关性。

(5)药物释放曲线：将支架浸入20 mL PBS中，在37 ℃条件下120 r/min的速度低速振荡，每3 d定时离心收集上清，共60 d，利用高效液相色谱法(同上)检测上清内淫羊藿素的质量浓度，绘制药物累计释放曲线。

1.4.7 支架与骨髓间充质干细胞共培养体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，按2×10⁴/cm²密度接种于6孔板，每孔加入10 mL L-DMEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)，细胞状态稳定后，将消毒后的两组各6个支架贴壁缓慢放入各孔，每组第3，7，15天各取出2个支架，6面分别行扫描电镜观察，每面随机取3个500倍视野观察支架各表面骨髓间充质干细胞数量。

1.5 主要观察指标多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架的超微结构、力学性能、载药能力、缓释性能及对骨髓间充质干细胞募集的能力。

1.6 统计学分析实验数据均使用SPSS 19.0软件进行统计处理，计量资料用x(_)±s表示，采用重复测量数据的方差分析，LSD法进行比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

由于人工关节假体的使用寿命一般在20年左右，对于中青年来说，在股骨头坏死的较早期阶段采取各种治疗措施保留患者自身股骨头、避免过早的关节置换具有很高的临床和社会价值。目前临床骨科医生尝试了多种手术方式进行保髋治疗，但对于部分股骨头坏死患者保髋疗效并不理想，根据文献报道12%-40%的患者仍在保髋治疗后的5年内进行了关节置换^[10]。

随着对股骨头坏死保髋治疗方面基础和临床研究的深入，学界发现股骨头塌陷是最能指导临床治疗和提示预后的病理改变^[11]。股骨头塌陷是一个动态的过程，病理生理上处于炎症反应、坏死骨吸收和新生骨修复并存的时期，从塌陷起至塌陷后6个月左右时间机体通过炎症反应募集间充质干细胞、趋化成骨细胞，并通过提高骨转化速率、反应性促进血管新生等机制尝试修复股骨头^[12]。因此在该时期股骨头内生物力学尚未完全衰竭且机体修复反应相对积极，是保髋治疗的时间窗，而一旦塌陷过程完成后，股骨头严重形变，力学坍塌导致大量硬化带形成继而血运灌注丧失，炎症反应修复停滞，关节面失去匹配，临床保髋难以成功。有学者认为超过4 mm的塌陷意味着无保髋价值，而仅能行关节置换^[13]。由此可见在股骨头塌陷过程完成前进行坚实有效的支撑，为股骨头修复提供稳定的力学环境，同时动员骨髓间充质干细胞尽快完成骨修复，是保髋成功的希望所在。

在保髋手术治疗中将坏死骨取出后股骨头内残存较大的空腔，需要进行填充。填充物至少应当具有以下特点：良好的力学强度、理想的骨传导性和可靠的安全性。理想的填充物还应当具有骨诱导活性，即富含具有成骨诱导活性的因子或干细胞，目前公认最理想的填充物是自体松质骨——尤其是富含红骨髓的髂骨等^[14]，但是自体松质骨移植填充也具有很多缺点，如供区并发症、数量有限、手术时间延长等^[15]，因此使用组织工程材料替代自体松质骨是近年来研究的热点。课题组前期制备了负载淫羊藿苷微球的3D打印多孔β磷酸三钙支架，研究证实该支架相对于普通磷酸三钙支架不仅促进了骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化，还体现了诱导成骨细胞增殖的作用，同时显著降低了破骨细胞的活性，并能诱导支架区域附近的血管新生。然而作者发现除力学性能具有一定优势外，该支架在成骨诱导及降低破骨细胞活性等方面仍明显不如自体骨，尤其是在30 d后，随着淫羊藿苷释放完毕，支架周围成骨诱导能力明显下降。β磷酸三钙的体内降解周期可达6个月左右，与股骨头坏死保髋术后的成骨修复周期近似，因此若能将载药微球与β磷酸三钙形成较稳定结合并同步降解，则可显著提高药物诱导成骨的时间窗。淫羊藿素是淫羊藿苷在机体内的主要代谢产物，是由淫羊藿苷经纤维素酶水解而成，分子质量小，目前已被大量研究证实其具有诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用^[16]，是干预骨质疏松、骨坏死及骨不连的常用有效中药单体成分^[17-19]，临床应用前景良好。文献报道其类似于雌激素的化学结构易于与生物素产生非共价结合，且能完好保持成骨诱导作用^[20]。聚吡咯是生物素的亲和素之一，其可与多种无机材料形成稳定混合物^[21]。该研究基于上述原理，运用电化学合成法制备了多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架，运用HDDD反应制备了淫羊藿素-生物素-聚乳酸微球，并成功组合制备了负载生物素-淫羊藿素-聚乳酸微球的3D打印多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架。

通过表征测试发现3D打印多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架具有与普通磷酸三钙支架近似的多孔结构，但由于聚吡咯的存在，支架上部分区域呈现嵴样改变，孔隙直径与普通磷酸三钙相近似，为10-50 μm不等，孔隙率为60%左右，孔隙形态不规则，具有交错性，上述特征能较好地增大支架表面的粗糙度及表面积，利于骨长入。生物素-淫羊藿素-聚乳酸微球的直径为2-20 μm，较未添加生物素的淫羊藿素-聚乳酸微球(1-5 μm)略大，但由于亲和素-生物素的结合系统存在，因此载药量反而较普通微球有所提高。扫描电镜下观察微球在支架上的负载方式，可见微球与支架间紧密结合，少见游离状态微球。通过高频超声振荡，普通支架负载的淫羊藿素微球大量脱落游离，而多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架上负载的生物素-淫羊藿素-聚乳酸微球仅有少量脱落游离。在低频振荡的模拟体液中第60天时，多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架对药物基本呈现线性释放，较普通β磷酸三钙支架释放周期明显延长，基本与支架外层降解同步，达到了较为理想的缓释和控释效果。体外细胞实验证实，该支架具有较好的募集骨髓间充质干细胞贴壁增殖的能力，为进一步促成骨诱导分化提供了良好的基础条件。

综上所述，多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素复合支架较既往制备的普通β磷酸三钙支架显著提高了支架的载药量，此外该支架能有效亲和新型生物素-淫羊藿素-聚乳酸微球，从而达到药物的控释，并能有效募集骨髓间充质干细胞附着支架表面，为骨修复创造基础环境，具有较好的开发应用前景。

不足与展望：该实验未进行支架的动物体内植入研究，也未进一步对支架表面附着的骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化从而确定其促成骨效果，以上内容结果将在进一步研究中获得。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

多孔β磷酸三钙-聚吡咯-生物素-淫羊藿素微球复合支架促进骨髓间充质干细胞的募集

Porous beta-tricalcium phosphate-polypyrrole-biotin-icariin composite scaffold promotes recruitment of bone marrow mesenchymal stem cells

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