在磁场作用下载硫酸软骨素酶ABC纳米微粒可影响许旺细胞的迁移

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2069

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (28): 4526-4532.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2069

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在磁场作用下载硫酸软骨素酶ABC纳米微粒可影响许旺细胞的迁移

高楗勃¹，夏冰¹，李胜友¹，杨雨洁¹，马腾¹，于芃²，罗卓荆¹，黄景辉¹

空军军医大学西京医院，¹骨科，²心内科，陕西省西安市 710032

收稿日期:2019-09-11 修回日期:2019-09-16 接受日期:2019-10-15 出版日期:2020-10-08 发布日期:2020-09-01
通讯作者: 黄景辉，博士，副教授，空军军医大学西京医院骨科，陕西省西安市 710032 罗卓荆，博士，教授，空军军医大学西京医院骨科，陕西省西安市 710032
作者简介:高楗勃，男，1989年生，吉林省镇赉县人，汉族，2013年解放军第四军医大学毕业，主要从事神经再生方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81672148)

Effect of nanoparticles carrying chondroitin sulfate ABC on the migration of Schwann cells in a magnetic field

Gao Jianbo¹, Xia Bing¹, Li Shengyou¹, Yang Yujie¹, Ma Teng¹, Yu Peng², Luo Zhuojing¹, Huang Jinghui¹

¹Department of Orthopedics, ²Department of Cardiology, Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Received:2019-09-11 Revised:2019-09-16 Accepted:2019-10-15 Online:2020-10-08 Published:2020-09-01
Contact: Huang Jinghui, MD, Associate professor, Department of Orthopedics, Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China Luo Zhuojing, MD, Professor, Department of Orthopedics, Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
About author:Gao Jianbo, Department of Orthopedics, Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81672148

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

超顺磁性：是指纳米粒子的粒径小于30 nm时通常表现出的特性，即当有外部磁场时纳米微粒能够迅速发生磁化而具有磁性特性，在撤去外部磁场后纳米微粒立即消磁并无磁性残留。

硫酸软骨素酶ABC(ChABC)：是一种存在于变形杆菌中的酶，可降解硫酸软骨素，但未经基因修饰的硫酸软骨素酶ABC无法在哺乳动物中表达，需对其进行多达6个选定的N-糖基化位点定向突变修饰后导入到哺乳动物细胞中才能发挥作用。

背景：由于缺乏轴突再生微环境以及神经胶质瘢痕的形成，使脊髓损伤修复的临床效果通常不尽如人意。许旺细胞作为神经再生的支持细胞，因其在星形胶质细胞丰富的中枢神经系统的迁移能力差而限制了其对轴突再生的作用。

目的：将载有硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC，ChABC)的超顺磁性纳米微粒导入许旺细胞，探讨在外部磁场的作用下对许旺细胞在星形胶质细胞区域迁移的影响。

方法：从出生1-3 d的SD大鼠坐骨、臂丛神经和大脑皮质分别提取许旺细胞和星形胶质细胞并纯化，通过免疫荧光染色鉴定其纯度。以超顺磁性纳米微粒(PEI-SPIONs)最佳转染质量浓度2 mg/L且与ChABC最佳质量比为1∶4对许旺细胞进行转染，同时给予外部磁场强度1.4 T作用2 d，用细胞迁移实验评估单纯许旺细胞、PEI-SPIONs/ChABC转染的许旺细胞以及外部磁场作用下PEI-SPIONs/ChABC转染的许旺细胞在星形胶质细胞区域的迁移能力。

结果与结论：①许旺细胞和星形胶质细胞的纯度分别达到(91.7±1.2)%和(93.3±2.2)%；②与许旺细胞组相比，PEI-SPIONs/ChABC转染的许旺细胞进入星形胶质细胞区域的数量明显增加(P < 0.05)；③与许旺细胞组相比，在外部磁场的作用下PEI-SPIONs/ChABC转染的许旺细胞进入星形胶质细胞区域的数量和迁移距离显著增加(P < 0.005)；④结果表明，PEI-SPIONs/ChABC转染可以增强许旺细胞突破胶质瘢痕的能力，且增加了与星形胶质细胞的融合；同时在外部磁场的引导下显著增强了许旺细胞的迁移能力，该方法可能成为治疗脊髓损伤后轴突再生的一种新策略。

ORCID: 0000-0002-7868-1745(高楗勃)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 许旺细胞, 星形胶质细胞, 磁场, 超顺磁性纳米微粒, 迁移, 硫酸软骨素酶ABC

Abstract:

BACKGROUND: The clinical effect of spinal cord injury is usually unfavorable due to the lack of axon regeneration and the formation of glial scar. Schwann cells, as the support cells for nerve regeneration, have poor migration ability in the central nervous system with abundant astrocytes, which limit its effect on axon regeneration.

OBJECTIVE: To explore the effect on the migration of Schwann cells containing superparamagnetic nanoparticles loaded with chondroitinase ABC (ChABC) in the region of astrocytes in the external magnetic field.

METHODS: Schwann cells and astrocytes were extracted from sciatic nerves and brachial plexus and cerebral cortex of Sprague-Dawley rats of postnatal day 1 to 3. Cell purity was identified by immunofluorescence staining. The toxicity of superparamagnetic nanoparticles (PEI-SPIONs) to Schwann cells was analyzed by live/dead cell staining. Schwann cells were transfected with PEI-SPIONS in an external magnetic field of 1.4Td for 2 days. The optimal transfection concentration of PEI-SPIONS used was 2 mg/L and the optimal mass ratio of PEI-SPIONS to ChABC was 1:4. Cell migration test was used to evaluate the migration ability of not-treated Schwann cells, PEI-SPIONs/ ChABC transfected Schwann cells, and PEI-SPIONs/ChABC transfected Schwann cells in an external magnetic field.

RESULTS AND CONCLUSION: The purity of Schwann cells and astrocytes reached to (91.7±1.2)% and (93.3±2.2)%, respectively. Compared with the Schwann cells group, the number of PEI-SPIONs/ChABC-transfected Schwann cells that entered the region of astrocytes was significantly increased (P < 0.05). Under the external magnetic field, the number of PEI-SPIONs/ChABC-transfected Schwann cells that entered the region of astrocytes and the cell migration distance were significantly increased as compared with the Schwann cells group (P < 0.005). In summary, PEI-SPIONs/ChABC transfection can enhance the ability of Schwann cells to break the glial scar, and increase the fusion of astrocytes. Under the guidance of external magnetic field, the migration ability of Schwann cells is significantly elevated. This method may be a new strategy to promote nerve regeneration after spinal cord injury.

Key words: Schwann cells, astrocytes magnetic field, superparamagnetic iron oxide nanoparticles, migration, chondroitinase ABC

中图分类号:

高楗勃, 夏冰, 李胜友, 杨雨洁, 马腾, 于芃, 罗卓荆, 黄景辉 . 在磁场作用下载硫酸软骨素酶ABC纳米微粒可影响许旺细胞的迁移[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(28): 4526-4532.

Gao Jianbo, Xia Bing, Li Shengyou, Yang Yujie, Ma Teng, Yu Peng, Luo Zhuojing, Huang Jinghui. Effect of nanoparticles carrying chondroitin sulfate ABC on the migration of Schwann cells in a magnetic field[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(28): 4526-4532.

图/表（结果） 5

2.1 许旺细胞的鉴定结果第3代许旺细胞通过S100、p75和DAPI三标免疫荧光染色，应用共聚焦显微镜进行观察：绿色荧光为许旺细胞的S100免疫标记物，红色荧光为许旺细胞的p75免疫标记物，蓝色为胞核衬染，见图1。许旺细胞形态为双极长梭形，有部分伪足。许旺细胞纯度(%)=S100、p75免疫荧光染色双阳性细胞数/DAPI染色阳性细胞数× 100%，随机选出15个视野，计算许旺细胞纯度为(91.7± 1.2)%，符合下一步实验要求。

2.2 星形胶质细胞的鉴定结果第3代星形胶质细胞通过GFAP和DAPI双标免疫荧光染色，应用共聚焦显微镜进行观察：红色荧光为星形胶质细胞的GFAP免疫标记物，蓝色为胞核衬染，见图2。星形胶质细胞形态为星形，从胞体分出多条突起。星形胶质细胞纯度(%)=GFAP免疫荧光染色阳性细胞数/DAPI染色阳性细胞数×100%，随机选出15个视野，计算星形胶质细胞纯度为(93.3±2.2)%，符合下一步实验要求。

2.3 PEI-SPIONs的毒性检测结果磁转染后24 h，在PEI-SPIONs质量浓度为0-4 mg/L范围内死亡细胞百分比为2.3%-5.8%，当质量浓度增加至8 mg/L时，死细胞百分比增加至(17.83±1.39)%。磁转染后72 h，在PEI-SPIONs质量浓度为0-2 mg/L范围内死细胞的百分比为3.7%- 6.4%，当质量浓度增加至4 mg/L和8 mg/L时，死细胞百分比增加至(12.77±1.46)%和(18.27±0.45)%，见图3A-J。这些结果表明PEI-SPION在质量浓度<4 mg/L时是安全的，PEI-SPIONs除了有浓度依赖性还具有时间依赖性，安全质量浓度为1 mg/L和2 mg/L。因此，该研究选择2 mg/L PEI-SPIONs进行相关实验。

2.4 ChABC的mRNA和蛋白的表达在安全剂量为 1 mg/L和2 mg/L时，PEI-SPIONs与ChABC质粒的质量比在1∶4比1∶2时表达量高，随着PEI-SPIONs与ChABC质粒的质量比从1∶2增加到1∶4时，ChABC的mRNA水平在1 mg/L和2 mg/L时分别提高了30.10倍和18.4倍。值得注意的是，含有2 mg/L PEI-SPIONs(质量比为1∶4)的PEP-SPONE/ChABC的mRNA水平比正常对照组高出223.73倍，见图4A。

许旺细胞组和PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞组的ChABC蛋白表达，见图4B。结果显示ChABC仅在PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞组分布，证明转染效果较好。

2.5 迁移实验与许旺细胞组、PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞组相比，PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞+外部磁场组的许旺细胞与星形胶质细胞融合和迁移距离显著增加(P < 0.005)，其最大迁移距离和迁移细胞数显著增加。PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞+外部磁场组的最大迁移距离最高(1 127.50±56.63) μm，其次是PEI-SPIONs/ ChABC/许旺细胞组，为(310.2±165.93) μm，许旺细胞组迁移距离最少。由于许旺细胞组中大约90%的细胞在 400 μm范围内，该实验选择100 μm作为单位，超过 400 μm距离用400 μm为一个单位以评估许旺细胞的迁移数量。PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞+外部磁场组细胞数量[(51.71±16.93)/400 μm]明显高于PEI-SPIONs/ ChABC/许旺细胞组[(27.57±5.80)/400 μm]。此外，PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞组和PEI-SPIONs/ ChABC/许旺细胞+外部磁场组在400 μm范围内的细胞数量分别是许旺细胞组的1.33和2.39倍。同样，在800 μm和1 200 μm距离时，PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞组和PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞+外部磁场组的细胞数量分别为许旺细胞组的1.42，2.72倍和1.42，2.94倍。PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞+外部磁场组的细胞迁移距离达1 200 μm，且许旺细胞在单层星形胶质细胞区域分布比其他组更广泛，证明PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞与星形胶质细胞融合良好，见图5。所有结果表明，PEI-SPIONs/ChABC转染可以增加许旺细胞与星形胶质细胞融合，同时在外部磁场的作用下显著增强了许旺细胞的迁移能力。

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引言

由创伤、肿瘤、感染等因素引起的脊髓损伤常常导致脊髓结构或功能受损，严重影响患者的生活质量^[1-4]。与中枢神经系统的轴突相比，周围神经系统的轴突在损伤后具有较高的再生能力。许旺细胞作为周围神经系统髓鞘胶质细胞，可以为轴突再生提供营养因子和物理基础，有利于营造轴突再生的微环境^[5]。许旺细胞移植被认为是目前修复神经损伤和功能重建的一种可行方法^[6-7]。然而在中枢神经损伤后，活化的星形胶质细胞形成胶质瘢痕^[8-9]，限制了许旺细胞与星形胶质细胞的融合以及在星形胶质细胞区域的迁移^[10]，进而限制了许旺细胞引导再生轴突进入远端脊髓，其中硫酸软骨素是胶质瘢痕的主要成分，为主要的抑制因子^[11-13]。因此，许旺细胞在中枢神经系统中的迁移能力可能成为修复受损神经的关键。该研究对许旺细胞进行基因修饰以增强其降解硫酸软骨素的能力，进而促进其与星形胶质细胞的融合。已有相关研究将基因修饰的硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC，ChABC)基因导入许旺细胞^[14]，ChABC通过切割硫酸软骨素的GAG链来降低其抑制作用^[15]。研究表明，ChABC的持续表达增强了许旺细胞与星形胶质细胞的融合及在星形胶质细胞区域的迁移，这就增加了中枢神经损伤后轴突再生的效率。

超顺磁性纳米微粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)被认为是一种高效的基因转染载体^[16-17]。它可以在磁场作用下促进细胞迁移^[18]。SPIONs与其他基因载体相比具有许多优势，例如转染效率较高、低免疫原性，同时保护转染基因免于核酸酶的消化等^[19]。在外部磁场的作用下，SPIONs/DNA复合物迅速沉淀并与细胞接触，提高转染效率，增加DNA内吞作用，达到理想的转染效果^[19]。应用聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)包被在SPIONs表面上以产生阳离子表面，这更有利于载体的细胞内化^[20]。此外，外部磁场可以促进吞噬SPIONs许旺细胞的迁移^[18]。

该研究创造性地将PEI-SPIONs作为ChABC的基因载体，使许旺细胞过表达ChABC来降解硫酸软骨素，促进许旺细胞与星形胶质细胞融合。与此同时，外部磁场作用于内化的SPIONs协同促进许旺细胞的迁移。该研究的目的是建立一种新策略，通过增强许旺细胞在星形胶质细胞区域的迁移，使许旺细胞在中枢神经系统损伤治疗中发挥作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2018年7月至2019年3月在解放军空军军医大学全军骨科研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级出生1-3 d的SD大鼠200只，购于解放军空军军医大学实验动物中心。该实验经解放军空军军医大学动物实验伦理委员会批准(KY20172005-1)。动物护理和实验程序均严格按照美国国立卫生研究院指南进行。

1.3.2 实验主要试剂 PEI-SPIONs(Chemicell)；DMEM/F12(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；0.25%胰酶(Solarbio)；青-链霉素(Solarbio)；毛喉素(Sigma-Aldrich)；Ⅱ型胶原酶(Gibco)；Ⅳ型胶原酶(Gibco)；牛垂体提取物(Biomedical Technologies Inc.)；磷酸盐缓冲盐水(HyClone)；Triton X-100(Solarbio)；进口山羊血清工作液(中杉金桥)；ChABC质粒(Genomeditech)；反转录试剂盒PrimeScript^TM RT Master Mix (TaKaRa)；实时定量PCR FastStart Essential DNA Green Master(Roche)；RAPI裂解缓冲液(碧云天)；BCA蛋白定量试剂盒(碧云天)；显影液(BIO-RAD)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(Sigma)；鼠抗ChABC(Novus Biologicals)；兔抗β-actin(康为世纪)；兔抗S100、鼠抗p75、鸡抗GFAP(Abcam)；山羊抗兔绿色荧光二抗、山羊抗鼠红色荧光二抗、山羊抗鸡红色荧光二抗(康为世纪)；山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(康为世纪)。

1.3.3 实验主要仪器透射电镜(H-600；Hitachi)；扫描电镜(S-3400N；Hitachi)；台式离心机(Xiang Yi)；全自动定量绘图酶标仪(BioTek)；共聚焦显微镜(尼康公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 许旺细胞提取、培养和纯化按照革军等^[21]的操作提取许旺细胞并加以改进，将出生后第1-3天的SD大鼠置入冰冻的体积分数为75%乙醇缸内消毒处死，随后在体视显微镜下取坐骨神经和臂丛神经；去除神经周围组织和神经外膜后用剪刀将神经剪碎至1 mm³小块，然后用0.2%Ⅱ型胶原酶和0.25%胰蛋白酶于37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱中消化26 min，每5 min摇匀1次，加入含体积分数为15%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，细胞沉淀用含青链霉素、体积分数为15%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬；以1×10⁸ L^-1细胞浓度接种于6孔板，差速贴壁纯化后使用10 μmol/L胞嘧啶阿糖胞苷处理细胞48 h来抑制成纤维细胞的增殖，然后用含有毛喉素(2 mmol/L)和牛垂体提取物(20 g/L)的培养液继续培养细胞；传至第3代为下一步实验做好准备。

选择上述细胞的特异性标记物S100、p75做免疫荧光染色进行细胞鉴定。使用第3代细胞，消化后接种于直径 12 mm的圆形载玻片上，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱中培养24 h，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定 15 min，PBS洗涤后加入0.2%Trition打孔液15 min，室温下用进口山羊血清封闭液作用1 h；取出载玻片加入兔抗S100(1∶100)和鼠抗p75(1∶100)在4℃冰箱过夜；复温 1 h后PBS漂洗3次，加入山羊抗兔绿色荧光二抗和山羊抗小鼠红色荧光二抗37 ℃孵育1 h；将DAPI液滴加在玻片上作用5 min，PBS洗涤后用抗荧光淬灭剂封固。

1.4.2 星形胶质细胞提取、培养和纯化按照许德超等^[22]的操作步骤提取星形胶质细胞并加以改进，将出生后1-3 d的SD大鼠置于冰冻的体积分数为75%乙醇缸中处死，随后在体视显微镜下取大脑皮质，置于Hank’s平衡盐溶液中，移除脑膜后将脑切成小块，用0.2%Ⅳ型胶原酶和0.25%胰蛋白酶在37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱中消化30 min，每5 min摇匀1次，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，细胞沉淀用含青链霉素、体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬；将细胞接种于用多聚赖氨酸包被的T75培养瓶中；培养10-12 d后，将原代培养的星形胶质细胞在37 ℃孵箱中以超过200 r/min的频率摇动24 h去除小胶质细胞和少突胶质细胞。将纯化后的星形胶质细胞传至第2，3代，为下一步实验做好准备。

选择星形胶质细胞的特异性标记物GFAP做免疫荧光染色进行细胞鉴定。使用第3代细胞，消化后接种于直径 12 mm的圆形载玻片上，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱中培养24 h，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定 15 min，Trition打孔15 min，山羊血清封闭1 h；取出载玻片加入鸡抗GFAP一抗(1∶1 000)在4 ℃冰箱过夜；加入山羊抗鸡红色荧光二抗在37 ℃孵育1 h；将DAPI液滴加在玻片上作用5 min，PBS洗涤后加抗荧光淬灭剂封固。

1.4.3 活-死细胞染色用活-死细胞试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.)评估PEI-SPIONs的细胞毒性。按照说明书配置染色工作液，将不同质量浓度的PEI-SPIONs (0，1，2，4，8 mg/L)磁转染许旺细胞后培养24 h或72 h，PBS洗涤3次，加入工作液，37 ℃孵育15 min后在共聚焦显微镜下观察活细胞和死细胞数量来分析细胞活力。

1.4.4 PEI-SPIONs磁转染许旺细胞用蒸馏水将ChABC质粒稀释至0.08 g/L，PEI-SPIONs与ChABC质粒的质量比为1∶4；将4 μL PEI-SPIONs(1 g/L)溶液加入200 μL稀释的质粒溶液中，剧烈振荡后混合30 min，以形成PEI-SPIONs/ChABC复合物。第3代许旺细胞接种于6孔板，接种细胞浓度为1×10⁸ L^-1，待增殖至70%-80%时，使用无菌PBS或不含血清的培养基洗涤细胞2次，添加1.8 mL无血清培养基，将200 μL PEI-SPIONs/ChABC复合物溶液加入到各孔中。将6孔板置于强度为0.3 T的磁板上(MagnetoFACTOR-96板；Chemicell)，在37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱中转染15 min。磁转染后4 h，更换新鲜培养基。

1.4.5 实时定量PCR检测ChABC mRNA表达细胞转染72 h，提取PEI-SPIONs/ChABC(1 mg/L的PEI-SPIONs∶ChABC=1∶2，1∶4；2 mg/L的PEI-SPIONs∶ChABC=1∶2，1∶4)转染的许旺细胞RNA，反转录为cDNA，最后采用FastStart Essential DNA Green Master混合系统进行实时定量PCR，以actin mRNA作为内参。实验重复3次。引物序列见表1。

1.4.6 Western blot 检测ChABC蛋白表达细胞转染 72 h，使用RAPI裂解液将许旺细胞、PEI-SPIONs/ChABC转染的许旺细胞裂解，提取蛋白后凝胶电泳分离蛋白，随后转印到PVDF膜，37 ℃封闭2 h，加入鼠来源ChABC一抗(1∶1 000) 和兔来源actin一抗4 ℃ 孵育过夜，TBST洗涤3次，加入羊抗小鼠多克隆二抗、羊抗兔多克隆二抗室温孵育1 h，TBST洗涤3次，加入显影液显影成像，采用GE AI600分析系统检测ChABC蛋白表达。

1.4.7 迁移实验使用0.125%胰蛋白酶消化许旺细胞、PEI-SPIONs/ChABC转染的许旺细胞，以2×10⁹ L^-1的密度重悬。将上述细胞接种在多聚赖氨酸包被的方形盖玻片上(5 mm²)培养24 h，PBS洗涤盖玻片3次，然后将细胞面向下倒置到铺满单层星形胶质细胞(1×10⁸ L^-1)的共聚焦皿上。按照XIA等^[¹⁸^]、HUANG等^[⁴^]的实验方法，将磁块(立方体磁体；边长50 mm；磁场强度1.4 T)平行置于PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞+磁场组盖玻片边缘2 d，观察细胞迁移情况；许旺细胞组、PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞组常规培养2 d，观察细胞迁移情况。

应用免疫荧光染色分析3组许旺细胞迁移距离，并记录迁移的最大距离，同时计算迁移距离在1 200 μm范围内的许旺细胞数量。在每个实验中，随机选择超过6个区域，每个区域的许旺细胞平均测量值为30。

1.5 主要观察指标 ①许旺细胞和星形胶质细胞的纯化程度；②选出SPIONs的安全质量浓度；③ChABC进入细胞后的mRNA及蛋白表达；④许旺细胞组、PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞组、PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞+磁场组在星形胶质细胞区域的迁移情况。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0分析(IBM Corporation，SPSS Statistics，Chicago，IL，USA)，所有数据表示为 x(_)±s，组间比较使用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较使用参数Student's t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

由于神经再生和修复不足，脊髓损伤一直未得到有效解决，纳米技术的应用可能对于脊髓损伤的修复产生积极的作用。研究表明SPIONs已经广泛应用于工业、生物医学、环境科学等领域^[23]。当有外部磁场时，SPIONs能够迅速磁化并产生磁性，在撤去外部磁场后SPIONs立即消磁并无磁性残留^[24]。近年来随着纳米技术与分子生物技术的结合，SPIONs可作为基因载体，以其安全、低毒、高稳定性、高效率等优点得到了广泛的应用^[25-26]。与其他转染方法相比，磁转染具有简单、高效等优点。实验表明，脂质体的表达效率在48 h时急剧下降到40.32%，而在72 h时磁学效率达到76.6%，在磁转染120 h时保持在72.3%的较高水平^[17]。因此，作者选择了PEI-SPIONs介导质粒进入细胞的方法。研究表明，PEI-SPIONs的平均直径为(28.1±3.6) nm，且聚乙烯亚胺包被在SPIONs的表面上以产生阳离子表面，平均电荷为(19.20±3.2) mV^[18]，这种聚合物能够附着在细胞上，进一步增加SPIONs的内化。实验还发现PEI-SPIONS的毒性具有剂量依赖性和时间依赖性。当PEI-SPIONs质量浓度小于4 mg/L时对许旺细胞的毒性可忽略不计，该研究选用2 mg/L用于相关实验。

脊髓损伤后反应性的星形胶质细胞会形成胶质瘢痕，产生神经抑制因子并阻碍神经再生，因此消除抑制因子是增强移植许旺细胞迁移能力的重要环节。研究表明，由于抑制因子的抑制作用和胶质瘢痕的阻碍作用，许旺细胞在星形胶质细胞区域的迁移能力十分有限^[27]，硫酸软骨素作为胶质瘢痕中的主要抑制因子^[14]，可以作为研究神经损伤修复的一个靶点。已有研究显示局部注射ChABC对脊髓损伤后胶质瘢痕中硫酸软骨素的降解有促进作用。然而，ChABC长期注射或重复注射有组织损伤、免疫原性和感染的风险^[14]。在这种情况下，将PEI-SPIONs与经过基因修饰的ChABC结合，通过磁转染的方式导入许旺细胞，结果表明PEI-SPIONS/ChABC/许旺细胞组(2 mg/L PEI-SPIONS；PEI-SPIONs∶ChABC为1∶4) ChABC mRNA水平是许旺细胞组的223.37倍，同时促进ChABC蛋白的表达，通过降解硫酸软骨素进而促进许旺细胞与星形胶质细胞的融合以及在星形胶质细胞区域的迁移。

外部磁场作用于SPIONs指导细胞迁移已有应用^[28-29]，产生的磁力可能与ChABC发挥协同作用促进许旺细胞的迁移。在该研究中，PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞组与许旺细胞组相比，许旺细胞与星形胶质细胞的融合以及在星形胶质细胞区域的迁移增强，但其迁移效果仍然不理想；在给予外部磁场后，许旺细胞与星形胶质细胞融合和迁移能力显著增强，这对许旺细胞在中枢神经损伤修复中的应用具有重要的价值。

结果显示，PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞+磁场组的许旺细胞在星形胶质细胞区域迁移显著增强且与星形胶质细胞融合显著增加，但外部磁场如何作用于SPIONs促进细胞迁移的详细机制尚不明确，不同磁场强度、不同作用距离对细胞迁移的影响未涉及；作者认为，外部磁场对内化的SPIONs直接产生的物理力起到了作用，同时细胞还能感知物理力的机械传导并转化为生化信号^[30-31]，可能激活了细胞某些信号通路如整合素信号通路^[32]；已有相关研究表明，整合素介导了多种细胞的机械传导过程，同时整合素在细胞迁移方面也起到重要作用^[33]。与许旺细胞组相比，虽然PEI-SPIONs/ChABC/许旺细胞组的细胞迁移显著增强，并且Western blot显示经过磁转染导入的ChABC基因能够表达，但表达的ChABC蛋白的生物学活性未得到验证，需要进一步阐明。总而言之，该研究对于促进许旺细胞在星形胶质细胞区域的迁移有一定的指导意义，为进一步促进轴突再生打下良好基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

在磁场作用下载硫酸软骨素酶ABC纳米微粒可影响许旺细胞的迁移

Effect of nanoparticles carrying chondroitin sulfate ABC on the migration of Schwann cells in a magnetic field

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