TOLL样受体4拮抗剂干预周围神经损伤后的瓦勒变性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.012

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (42): 6308-6316.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.012

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TOLL样受体4拮抗剂干预周围神经损伤后的瓦勒变性

熊乐1，张蓓1，沈若武2，季爱玉3，孙广强1，边洪琳3，张凤玉1，王毅1，黄恒4，李华侨1，周善宇5，沈兆康6，王忠1

青岛大学医学院，1免疫学教研室，2解剖教研室，山东省青岛市 266071；3青岛大学附属医院创伤外科，山东省青岛市 266003；4解放军第401医院手外科，山东省青岛市 266072；5青岛大学医学院整形外科，山东省青岛市 266071；6青岛市第五十八中学，山东省青岛市 266100

收稿日期:2016-08-17 出版日期:2016-10-14 发布日期:2016-10-14
通讯作者: 张蓓，博士，副教授，青岛大学医学院免疫学教研室，山东省青岛市 266071
作者简介:熊乐，女，1991年生，湖北省襄阳市人，汉族，青岛大学在读硕士，主要从事神经免疫方面的研究。
基金资助:
山东省高等学校科技计划(J14LK10)

Toll-like receptor 4 antagonist protects against Wallerian degeneration after peripheral nerve injury

Xiong Le1, Zhang Bei1, Shen Ruo-wu2, Ji Ai-yu3, Sun Guang-qiang1, Bian Hong-lin3, Zhang Feng-yu1, Wang Yi1, Huang Heng4, Li Hua-qiao1, Zhou Shan-yu5, Shen Zhao-kang6, Wang Zhong1

1Department of Immunology, 2Department of Anatomy, 5Department of Plastic Surgery, Qingdao University Medical School, Qingdao 266071, Shandong Province, China; 3Department of Traumatic Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China; 4Department of Hand Surgery, the 401st Hospital of Chinese PLA, Qingdao 266072, Shandong Province, China; 6No. 58 High School of Qingdao, Qingdao 266100, Shandong Province, China

Received:2016-08-17 Online:2016-10-14 Published:2016-10-14
Contact: Zang Bei, M.D., Associate professor, Department of Immunology, Qingdao University Medical School, Qingdao 266071, Shandong Province, China
About author:Xiong Le, Studying for master’s degree, Department of Immunology, Qingdao University Medical School, Qingdao 266071, Shandong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Program of High Educations in Shandong Province, No. J14LK10

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
TOLL样受体4(TLR4)：人类发现的第1个TOLL样受体相关蛋白，由TOLL样受体4基因编码的一种蛋白质，参与激活固有免疫。它可以识别许多革兰阴性细菌的脂多糖(LPS)，也可以选择性识别革兰阳性菌，它的配体也包括一些病毒蛋白、多糖及多种内源性蛋白质(如低密度脂蛋白，热休克蛋白等)。
瓦勒变性：即由于各种创伤、牵拉、缺血、高低温、电击等原因，直接使神经纤维受损中断，周围神经损伤后远段发生的轴突坏死、髓鞘分解消失和神经鞘膜增生等一系列蜕变和细胞吞噬过程。

摘要
背景：外周神经损伤后发生瓦勒变性，其机制复杂，从免疫学角度对其进行调控可以影响神经早期修复效果。
目的：分析特异性拮抗Toll样受体4(TLR4)对于大鼠坐骨神经损伤早期瓦勒变性及轴突再生的影响。
方法：将50只Wistar大鼠随机分成3组：处理组及模型组横断大鼠右侧坐骨神经后，行神经外膜端端吻合；假手术组仅游离出坐骨神经，然后关闭切口。术前1 h及术后7 d处理组大鼠每天尾静脉注射0.15 mg/kg Toll样受体4拮抗剂TAK-242，模型组及假手术组大鼠尾静脉注射同等体积生理盐水。于术后24 h、3 d、4 d和7d取术侧坐骨神经。
结果与结论：①实时定量PCR显示，与假手术组相比，术后24 h模型组白细胞介素1β mRNA和单核细胞趋化蛋白1 mRNA的表达均明显升高(P < 0.001，P < 0.001)，与模型组相比，术后24 h处理组白细胞介素1β mRNA和单核细胞趋化蛋白1 mRNA的表达明显降低(P < 0. 001，P < 0. 001)；②免疫荧光可见，与模型组相比，术后3 d处理组中CD68+细胞和iba1+细胞表达均显著下调(P < 0. 01，P < 0.05)；③固兰染色可见，在术后7 d，模型组和处理组坐骨神经断端均出现脱髓鞘反应，但与模型组相比，处理组神经断端髓鞘碎片清除率明显降低(P < 0.05)；④苏木精-伊红染色可见，在术后7 d，模型组坐骨神经断端较多炎性细胞浸润，许旺细胞增殖活跃，神经纤维大量再生通过吻合口，断端修复正常，处理组神经断端炎性细胞较少，纤维组织增生较少，吻合口有缝隙，断端修复能力减弱；⑤免疫组织化学可见，与模型组相比，术后4 d处理组中生长相关蛋白43蛋白表达均显著下调(P < 0.05)；⑥坐骨神经功能指数显示，与模型组相比，处理组大鼠在术后20，30和40 d同期比较明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。⑦结果证实，Toll样受体4拮抗剂导致大鼠坐骨周围神经损伤早期再生延迟，其机制可能是抑制了瓦勒变性过程中的的Toll样受体4信号通路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2714-3637(熊乐)

关键词: 组织构建, 组织工程, 周围神经, 瓦勒变性, TAK-242, Toll样受体4, 巨噬细胞, 许旺细胞, 神经再生

Abstract:

BACKGROUND: The mechanism underlying Wallerian degeneration following peripheral nerve injury is complex. Immune regulation on Wallerian degeneration is beneficial for early repair of perpheral nerve injury.
OBJECTIVE: To investigate the effects of Toll-like receptor 4 (TLR4) antagonist on Wallerian degeneration and axonal regeneration after early peripheral nerve injury in rats.
METHODS: Fifty male Wistar rats were recruited and randomly divided into treatment group (n=20), model group (n=20) and sham group (n=10). The right sciatic nerves of rats in treatment and model groups were cut and sutured end-to-end, while the sciatic nerves of rats in sham group were only exposed. In the treatment group rats were intravenously injected with 0.15 mg/kg TAK-242 via tail vein 1 hour preoperatively and 7 days postoperatively, and the rats in the other two groups were given intravenous injection of the same volume of normal saline. The sciatic nerves were removed at 24 hours, 3, 4 and 7 days after surgery.
RESULTS AND CONCLUSION: Real-time PCR indicated that the mRNA expressions of interleukin-1β and monocyte chemoattractant-1 were significantly increased in the model group compared with the sham group at 24 hours after surgery (both P < 0.001), while the expressions were significantly decreased after TAK-242 injection (both P < 0.001). Immunofluorescence showed that compared with the model group, down-regulated expression of CD68+ and iba1+ cells appeared in the treatment group at 3 days after surgery (P < 0.01, P < 0.05). Luxol fast blue staining revealed that demyelination at the sciatic nerve stump appeared in both model and treatment groups at postoperative 7 days, but myelin debris clearance in the treatment group was significantly reduced compared with the model group (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining showed that a lot of inflammatory cells, Schwann cells and regenerated nerve fibers at the sciatic nerve stump were found in the model group, while there were few inflammatory cells, Schwann cells and regenerated nerve fibers in the treatment group at 7 days after surgery. Immunohistochemistry found that the expression of growth-associated protein-43 in the treatment group was significantly lower than that in the model group at 4 days postoperatively (P < 0.05). Besides, compared with the model group, a significantly decreased sciatic functional index was found in the treatment group at 20, 30 and 40 days after surgery (P < 0.05). These results show that TLR4 antagonists delay early nerve regeneration in rats after sciatic nerve injury probably by inhibiting the TLR4 signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Peripheral Nerves, Toll-Like Receptor 4, Myelin Sheath, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

熊乐，张蓓，沈若武，季爱玉，孙广强，边洪琳，张凤玉，王毅，黄恒，李华侨，周善宇，沈兆康，王忠. TOLL样受体4拮抗剂干预周围神经损伤后的瓦勒变性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(42): 6308-6316.

Xiong Le1, Zhang Bei1, Shen Ruo-wu2, Ji Ai-yu3, Sun Guang-qiang1, Bian Hong-lin3, Zhang Feng-yu1, Wang Yi1, Huang Heng4, Li Hua-qiao1, Zhou Shan-yu5, Shen Zhao-kang6, Wang Zhong1 . Toll-like receptor 4 antagonist protects against Wallerian degeneration after peripheral nerve injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(42): 6308-6316.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析实验选用Wistar大鼠50只，分为3组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 大体观察各组大鼠均发育良好，无死亡，切口甲级愈合。术后20 d内，假手术组术后与术前基本无变化，无行动困难、足趾挛缩及足踝部红肿的表现，针刺足部反应灵敏；处理组和模型组大鼠术后均出现右下肢功能活动受限，术侧腿部肌肉均有萎缩现象，足趾挛缩不能伸展，呈拖曳步态，并出现不同程度右足踝部皮肤红肿，足趾溃疡，针刺反应消失。术后40 d，处理组和模型组大鼠开始出现溃疡干燥，部分大鼠溃疡愈合。术后50 d，模型组大鼠溃疡全部愈合，针刺反应灵敏；处理组仍有2只大鼠足趾未完全愈合，针刺反应迟钝。

2.3 实时定量PCR测坐骨神经组织白细胞介素1β和单核细胞趋化蛋白1 mRNA的表达熔解曲线分析显示2组基因扩增均呈单峰，退火温度一致，无非特异性扩增。与假手术组相比，在术后24 h，模型组的白细胞介素1β和单核细胞趋化蛋白1 mRNA表达水平均显著升高(P < 0.001)。与模型组相比，处理组的白细胞介素1β和单核细胞趋化蛋白1 mRNA表达水平均差异降低(P < 0.001)。结果见图2。

2.4 免疫荧光法测坐骨神经组织CD68⁺巨噬细胞细胞和iba1⁺许旺细胞的表达术后3 d神经组织切片免疫特异性巨噬细胞 CD68 抗体和许旺细胞iba1抗体染色可见，模型组神经断端有大量CD68⁺巨噬细胞和iba1⁺许旺细胞浸润，而与模型组相比，处理组CD68⁺巨噬细胞和iba1⁺许旺细胞均明显减少。通过定量，分析距离损伤中心2 mm内远端免疫阳性细胞面积所占比值显示，处理组CD68⁺巨噬细胞明显减少(P < 0.01)，处理组iba1⁺许旺细胞也明显减少(P < 0.05)。结果见图3。

2.5 大鼠坐骨神经髓鞘固兰染色术后7 d坐骨神经固兰染色可见，髓鞘呈天蓝色，轴突不着色，背景为白色,反映在坐骨神经损伤远端崩解的髓鞘碎片被巨噬细胞清除的情况。假手术组大鼠坐骨神经髓鞘结构完整，排列规则，厚度均一，模型组和处理组神经断端可见髓鞘淡染，均为变性崩解的髓鞘，与模型组相比，处理组残余髓鞘碎片较多(方框内表示两组残余髓鞘差异)，通过定量分析，计算距离损伤中心2 mm内远端被染色髓鞘的积分吸光度平均值，可见与模型组相比，处理组残余髓鞘碎片较多，差异有显著性意义(P < 0.05)，反映了处理组的崩解髓鞘碎片清除速率明显降低模型组。结果见图4。

2.6 大鼠坐骨神经组织苏木精-伊红染色术后7d苏木精-伊红染色可见，假手术组大鼠坐骨神经组织结构完整，纤维排列整齐，无炎性细胞浸润，模型组和处理组轴突完全断裂，髓鞘崩解，模型组较多炎性细胞浸润，许旺细胞增殖活跃，纤维组织增生明显，有神经纤维生长通过吻合口，显示了正常的神经断端修复状态；处理组可见有炎性细胞浸润，少量许旺细胞增生，吻合口间仍有缝隙，神经断端修复较差。结果见图5。

2.7 免疫组织化学法测坐骨神经组织生长相关蛋白43(GAP-43)蛋白的表达用距离神经断端4 mm处坐骨神经横切片的生长相关蛋白43表达水平来衡量轴突再生情况。术后4 d免疫组织化学检测可见，免疫组织化学图片背景洁净，几乎无非特异性染色。生长相关蛋白43免疫阳性产物，均呈深褐色，主要分布于轴突内，生长相关蛋白43主要定位于细胞浆、细胞膜及细胞外基质。通过定量分析，计算免疫阳性细胞的积分吸光度平均值可见，与模型组相比，处理组中生长相关蛋白43蛋白表达均显著降低(P < 0.05) 。结果见图6。

2.8 大鼠坐骨神经功能指数(SFI)测定模型组和处理组大鼠在术后10，20，30，40和50 d，行足迹实验分析坐骨神经功能指数，评价大鼠运动功能的恢复情况。各组大鼠行走时步态稳定，足迹清晰。结果显示，在坐骨神经损伤后10 d，两组大鼠的坐骨神经功能指数均为最低值，之后开始逐步上升。处理组在损伤后20，30和40 d，坐骨神经功能指数均分别明显低于模型组(P < 0.05)。结果见图7。

参考文献

[1] Takeda K, Kaisho T, Akira S.Toll-like receptors. Annu Rev Immunol. 2003;21:335-376.
[2] Willis D, Li KW, Zheng JQ, et al.Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J Neurosci. 2005 ;25(4):778-791.
[3] Lehnardt S. Innate immunity and neuroinflammation in the CNS: the role of microglia in Toll-like receptor-mediated neuronal injury. Glia.2010;58(3): 253-263.
[4] Vallières N, Berard JL, David S, et al.Systemic injections of lipopolysaccharide accelerates myelin phagocytosis during Wallerian degeneration in the injured mouse spinal cord. Glia.2006;53(1):103-113.
[5] Beuche W, Friede RL.The role of non-resident cells in Wallerian degeneration. J Neurocytol. 1984;13(5): 767-796.
[6] Brück W, Huitinga I, Dijkstra CD. Liposome-mediated monocyte depletion during wallerian degeneration defines the role of hematogenous phagocytes in myelin removal. J Neurosci Res. 1996;46(4): 477-484.
[7] Stoll G, Griffin JW, Li CY. et al.Wallerian degeneration in the peripheral nervous system: participation of both Schwann cells and macrophages in myelin degradation. J Neurocytol. 1989;18(5):671-683.
[8] Perrin FE, Lacroix S, Avilés-Trigueros M, et al. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 2005;128(Pt 4):854-866.
[9] Carroll SL, Frohnert PW.Expression of JE (monocyte chemoattractant protein-1) is induced by sciatic axotomy in wild type rodents but not in C57BL/Wld(s) mice. J Neuropathol Exp Neurol. 1998;57(10):915-930.
[10] Shamash S, Reichert F, Rotshenker S. The cytokine network of Wallerian degeneration: tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1alpha, and interleukin-1beta J Neurosci. 2002;22(8):3052-3060.
[11] Ha GK, Parikh S, Huang Z, et al.Influence of injury severity on the rate and magnitude of the T lymphocyte and neuronal response to facial nerve axotomy. J Neuroimmunol. 2008;199(1-2): 18-23.
[12] Temporin K, Tanaka H, Kuroda Y,et al.Interleukin-1 beta promotes sensory nerve regeneration after sciatic nerve injury. Neurosci lett.2008;440(2): 130-3.
[13] Medzhitov R, Preston-Hurlburt P, Janeway CA Jr.A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature.1997; 388(6640): 394-397.
[14] Blanco AM, Guerri C. Ethanol intake enhances inflammatory mediators in brain: role of glial cells and TLR4/IL-1RI receptors. Front Biosci. 2007;12:2616- 2630.
[15] Zhou H, Lapointe BM, Clark SR, et al. A requirement for microglial TLR4 in leukocyte recruitment into brain in response to lipopolysaccharide. J Immunol. 2006; 177(11):8103-8110.
[16] 李志行,吕敬雷,陈萍,等. 缺血后处理局灶性脑缺血再灌注模型大鼠相关通路以及白细胞介素8的表达[J]. 中国组织工程研究,2015,19(49):7938-7944.
[17] 刘洁,花放. TLR4介导的信号转导通路在新生儿缺血缺氧性脑病中的作用[J]. 解剖科学进展,2015,31(6): 652-654+659.
[18] 王大永,徐翔,孙立倩,等. 亚低温治疗对脑出血大鼠TLR4/NF-κB介导的神经炎症反应的影响[J]. 神经解剖学杂志,2015,31(3):309-314.
[19] 郑为娜,王珊,生晓娜,等. TLR4与神经变性疾病和多发性硬化[J]. 中国神经免疫学和神经病学杂志,2015,22(4): 291-295.
[20] akashima K, Matsunaga N, Yoshimatsu M, et al.Analysis of binding site for the novel small-molecule TLR4 signal transduction inhibitor TAK-242 and its therapeutic effect on mouse sepsis model. Br J Pharmacol. 2009;157(7):1250-1262.
[21] Hua F, Tang H, Wang J, et al.TAK-242, an antagonist for Toll-like receptor 4, protects against acute cerebral ischemia/reperfusion injury in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 2015;35(4):536-542.
[22] Gaudet AD, Popovich PG, Ramer MS.Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 2011 ;8:110.
[23] Taskinen HS, Röyttä M. Increased expression of chemokines (MCP-1, MIP-1alpha, RANTES) after peripheral nerve transection. J Peripher Nerv Syst. 2000;5(2):75-81.
[24] Siebert H, Sachse A, Kuziel WA, et al.The chemokine receptor CCR2 is involved in macrophage recruitment to the injured peripheral nervous system. J Neuroimmunol. 20002;110(1-2):177-185.
[25] Viader A, Chang LW, Fahrner T, et al. MicroRNAs modulate Schwann cell response to nerve injury by reinforcing transcriptional silencing of dedifferentiation-related genes. J Neurosci. 2011; 31(48): 17358-17369.
[26] Behrmann DL, Bresnahan JC, Beattie MS, et al. Spinal cord injury produced by consistent mechanical displacement of the cord in rats: behavioral and histologic analysis. J Neurotrauma. 1992;9(3):197-217.
[27] Aigner L, Arber S, Kapfhammer JP, et al. Overexpression of the neural growth-associated protein GAP-43 induces nerve sprouting in the adult nervous system of transgenic mice. Cell.1995:83(2): 269-278.
[28] Aigner L, Caroni P. Absence of persistent spreading, branching, and adhesion in GAP-43-depleted growth cones. J Cell Biol. 1995;128(4):647-460.
[29] Krekoski CA, Neubauer D, Graham JB,et al. Metalloproteinase-dependent predegeneration in vitro enhances axonal regeneration within acellular peripheral nerve graft . J Neurosci. 2002;22(23): 10408-10415.
[30] Aguayo AJ, Peyronnard JM, Bray GM. A quantitative ultrastructural study of regeneration from isolated proximal stumps of transected unmyelinated nerves. J Neuropathol Exp Neurol. 1973;32(2):256-270.
[31] 高鹏,夏玉军,季爱玉. 巨噬细胞与小鼠周围神经损伤再生的关系[J]. 青岛大学医学院学报,2016,52(1):71-74+77.

引言

周围神经损伤修复治疗是显微外科的难题之一。周围神经损伤后，远端神经发生营养障碍而出现轴突坏死，髓鞘崩解和鞘膜增生等一系列变化，这个过程称为瓦勒变性。瓦勒变性整个过程包括：①轴索变性，主要表现为远端轴索肿胀断裂，吞噬细胞增生活跃吸收坏死组织；近端轴索近向远侧长出许多旁侧和终末侧支芽，并向远端延伸；②轴突脱髓鞘崩解，吞噬细胞增生活跃吸收崩解产物；许旺细胞增殖活跃，向近端内迁延形成Bungner带，接触引导再生轴突向远端生长，分泌因子引导再生纤维，募集血源性巨噬细胞很快聚集到神经残端，吞噬髓鞘碎屑；③神经纤维细胞增生排列。巨噬细胞在瓦勒变性与神经再生过程中发挥吞噬变性组织、为再生神经清除障碍的作用，而许旺细胞的增殖对轴突的再生和髓鞘的形成至关重要，二者对神经再生都起着非常重要作用。近年来，越来越多的研究关注周围神经损伤后，调节瓦勒变性和轴突再生的细胞和分子机制，从分子免疫学角度在损伤早期缩短瓦勒变性和神经再生时间，提高神经修速度及修复质量，具有重要现实意义。

Toll样受体(TLRs)作为一种模式识别受体，介导天然免疫应答，除了识别病原相关分子模式外，也可识别损伤相关分子模式，如坏死细胞，热休克蛋白(HSP60，HSP70)和细胞外基质成分^[1]，有趣的是，在神经损伤部位存在大量坏死细胞，而坏死轴突表达热休克蛋白60和热休克蛋白70，并且在损伤组织的炎症反应部位产生细胞外基质组分^[2]。在中枢神经系统，特别是小胶质细胞能表达多种Toll样受体^[3]，而对于在外周神经系统，许旺细胞上的Toll样受体近来更受关注。在神经损伤后，表达于胶质细胞及免疫细胞上的Toll样受体能最先感受到损伤轴突的损伤刺激。后续研究发现，在原代细胞培养条件下，取自出生后2到7 d新生大鼠坐骨神经的许旺细胞中Toll样受体4有较高表达，并且已有研究发现脊髓损伤时，脂多糖(Toll样受体激动剂)能促进瓦勒变性过程中的髓鞘碎片的清除^[4]，但目前关于外周神经系统中Toll样受体4作用的研究仍为数不多。因此，本研究着重关注外周神经损伤后瓦勒变性早期，通过调控Toll样受体4信号通路影响巨噬细胞和许旺细胞的活化，从而对变性髓鞘碎片清除以及神经再生产生的影响。

众所周知，周围神经损伤后的瓦勒变性过程中，巨噬细胞(局部和血源)和许旺细胞共同参与髓鞘碎片的清除^[5-7]，已有研究证明神经伤后1-3 d大量的巨噬细胞聚积，许旺细胞则在轴突断裂后3 d达到增殖高峰，脱髓鞘反应于7 d左右达到峰值。而损伤局部的巨噬细胞和许旺细胞可在损伤早期产生白细胞介素1β和单核细胞趋化蛋白1等炎性因子调节髓鞘碎片清除过程^[8]，这些炎性因子在损伤后1 h即可出现，而在24 h表达量最高^[7-10]。实验建立Wistar大鼠坐骨神经损伤模型，通过注射TAK-242(Toll样受体4拮抗剂)抑制大鼠Toll样受体4信号通路,从损伤早期巨噬细胞和许旺细胞募集，变性崩解髓鞘的清除，轴突再生及损伤后期运动功能恢复几个方面探讨Toll样受体4信号通路对外周神经损伤后瓦勒变性的免疫调控，为周围神经损伤修复提供一个新策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年9月至2016年2月在青岛大学免疫教研室完成。

1.3 材料

实验动物：SPF 级 Wistar 雄性大鼠50只，体质量(200±20) g，由青岛市实验动物和动物实验中心提供，动物质量合格证号：SCXK(鲁)20090007。饲养于饲养箱，每箱5只大鼠，通风良好，环境安静，温度为(22±2) ℃ ，相对湿度为60%，自由饮食与进水，买回大鼠适应环境 1周后开始实验。

试剂及仪器：TAK-242(美国Cayman Chemical公司)；Rabbit Anti-CD68，Rabbit Anti-iba1(北京博奥森生物技术公司)；Goat Anti-Rabbit IgG，FITC Conjugated(北京康为世纪生物科技有限公司)；反转录试剂盒、SYBR Green Premix Ex Taq荧光定量试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)；石蜡切片机，冰冻切片机(德国Leica公司)；光学显微镜，荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 50只Wistar大鼠随机分为处理组(20只)，模型组(20只)和假手术组(10只)。处理组大鼠分别在术前1 h及术后7 d连续尾静脉注射0.15 mg/kg TAK-242，模型组及假手术组大鼠尾静脉注射同等体积生理盐水。

1.4.2 周围神经损伤动物模型制备体积分数10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，用8%硫化钠脱毛术区皮肤，消毒后将动物俯卧位固定，无菌条件下显露右侧坐骨神经。处理组及模型组于梨状肌下缘0.8 cm处用利刀横行切断坐骨神经，以神经外膜上走行的血管为标记，用8-0无损伤缝合线行神经外膜端端吻合，吻合口缝合4针(见图1，箭头表示吻合口)，逐层关闭切口，分别于建模成功后24 h、3 d、4 d和7 d处死；假手术组仅游离出坐骨神经，然后关闭切口，于24 h处死。各组大鼠于术后24 h取下大鼠右侧坐骨神经，迅速放入冻存管中在液氮中保存备用；对于处理组和模型组，于术后3 d处死后取出坐骨神经，置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h后，再依次放入20%和30%蔗糖中脱水，待脱水完全后包埋进行冰冻切片；处理组和模型组大鼠分别于术后4 d和7 d，用40 g/L多聚甲醛全身灌注后，取坐骨神经置于40 g/L多聚甲醛中固定待检。

1.5 主要观察指标

1.5.1 大体观察观察并记录大鼠术后的存活情况，步态，术侧肢体远端有无红肿和溃疡，肌肉有无萎缩，切口有无感染及下肢感觉的变化。

1.5.2 实时定量PCR测坐骨神经白细胞介素1β和单核细胞趋化蛋白1mRNA的表达用Trizol法提取各组大鼠坐骨神经总RNA。由TaKaRa公司生产的反转录试剂盒进行cDNA合成，按照TaKaRa公司SYBR^® Premix Ex Taq™(Tli RNaseH Plus)(no.RR420A)荧光定量试剂盒说明进行real-time PCR反应。管家基因β-actin是用来规范的总RNA量。

引物序列：
白细胞介素1β	上游引物：5’-GCC AAC AAG TGG TAT TCT CCA-3’ 下游引物：5’-CCG TCT TTC ATC ACA CAG GA-3’ 扩增片段为118 bp；
单核细胞趋化蛋白1	上游引物：5’-AGG ACT TCA GCA CCT TTG A-3’ 下游引物：5’-TTC TCT GTC ATA CTG GTC ACT TC-3’ 扩增片段为116 bp；
β-actin	上游引物：5’-CAC CCG CGA GTA CAA CCT TC-3’ 下游引物：5’-CCC ATA CCC ACC ATC ACA CC-3 ’ 扩增片段为206 bp。

反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 45 s，40个循环。每份RNA样本均进行3次重复检测，取其平均Ct值用于结果分析，采用2^-^??Ct方法对白细胞介素1β、单核细胞趋化蛋白1mRNA的表达水平进行相对定量。

1.5.3 免疫荧光法测CD68⁺巨噬细胞和iba1⁺许旺细胞的表达取神经组织冰冻切片，用磷酸盐缓冲液(PBS)水化20 min；体积分数10%羊血清40 ℃封闭1 h；PBS 漂洗3次，每次5 min；加入一抗后，4 ℃孵育过夜；PBS 漂洗3次，每次5 min；加入二抗 FITC山羊抗兔37 ℃孵育2 h；磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5 min；荧光封固剂封固，荧光显微镜观察及照片拍摄，其中每一组数据均来源于3只大鼠至少4张切片染色结果，每张切片随机取5个非重叠视野，利用Image-Pro Plus 6.0软件定量分析免疫阳性细胞面积占总面积比值。

1.5.4 坐骨神经髓鞘固兰染色以坐骨神经缝合口为中心切取10 mm长的神经组织，远端缘用9-0无损伤缝线标记方向，40 g/L多聚甲醛中固定24 h，然后经过乙醇梯度脱水、透明、进一步石蜡包埋等过程制成石蜡切块，做纵行切片连续切片，切片厚度为4 μm，切片脱蜡后，然后作固兰(Luxol fast blue，LFB)染色。用固兰液在60 ℃温度浸泡12 h；随后应用体积95%乙醇浸洗5 min；加入0.05%碳酸锂15 s；再应用体积分数70%的乙醇洗涤，蒸馏水漂洗，进行脱水后，透明封固，在光镜下观察坐骨神经的髓鞘改变，其中每一组数据均来源于3只大鼠至少4张切片染色结果，每张切片随机取5个非重叠视野，利用Image-Pro Plus 6.0软件定量分析固兰染色阳性区域的积分吸光度平均值。

1.5.5 坐骨神经病理学观察以坐骨神经缝合口为中心切取10 mm长的神经组织，远端缘用9-0无损伤缝线标记方向，40 g/L多聚甲醛中固定24 h，然后经过乙醇梯度脱水、透明、进一步石蜡包埋等过程制成石蜡切块，做纵行连续切片，切片厚度为4 μm，然后作苏木精-伊红染色，在光镜下观察坐骨神经的基本结构及有无细胞增生、炎细胞浸润等改变。

1.5.6 免疫组织化学法测生长相关蛋白43(GAP-43)蛋白的表达制备蜡块，4 μm切片后进行脱蜡、水化、PBS 冲洗及抗原修复等步骤。用正常的山羊血清和体积分数3%的双氧水各封闭20 min后加一抗4 ℃过夜。次日用磷酸盐缓冲液冲洗，加入生物素标记的羊抗兔 lgG抗体室温条件下孵育，20 min以后用磷酸盐缓冲液洗3遍。用DAB液显色后镜下观察实验结果，适时终止反应。用苏木精复染5 min后，进一步进行脱水、透明及封固等步骤，同时用磷酸盐缓冲液代替一抗做相应的阴性对照。显微镜下观察生长相关蛋白43蛋白的表达，其中每一组数据均来源于3只大鼠至少4张切片染色结果，每张切片随机取5个非重叠视野，利用Image-Pro Plus 6.0软件分析免疫阳性区域的积分吸光度平均值。

1.5.7 大鼠坐骨神经功能指数(SFI)测定制作长约50 cm，宽约8.5 cm，高约8 cm的硬纸暗箱，两端均留门，箱底垫上白纸，将大鼠双后足蘸墨水后，在纸箱内从一端到另一端行走，每条纸每侧足留下四五个足印，选实验侧及正常侧足清晰的足印测量3个变量，精确到mm，算出每只鼠各变量的平均值。术后10，20，30，40和50 d检测，测量足印长度(PL)，第1脚趾到第5脚趾的距离(TS)，第2足趾到第4足趾的距离(IT)，E和N分别代表实验侧和正常侧。将上述3个变量带入Bain公式计算出SFI：SFI=-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETS- NTS)/NTS+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8。正常SFI为0，神经功能完全丧失为-100。

1.6 统计学分析应用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计分析，实验中所有数据均以x(_)±s表示，采用方差分析或t 检验分析，P < 0.05的为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

神经系统疾病危害人类健康，周围神经损伤修复过程复杂，显微外科手术可以恢复神经的连续性，但功能的恢复不尽人意。近年来，随着神经损伤修复过程所涉及的分子机制的深入研究，从分子生物学的角度调控神经再生备受关注。

最近的研究表明，在周围神经损伤后，固有免疫系统通过炎性递质参与了瓦勒变性^[11-12]，从而影响神经再生。国外学者利用化学试剂注射以及免疫注射坐骨神经挤压模型大鼠，使其产生局部免疫反应，研究发现利用上述方法处理损伤神经，神经修复时间明显缩短，修复速度和质量有明显提高。而作者实验则从Toll样受体角度，关注调控固有免疫反应对早期瓦勒变性及神经再生的影响。

Toll样受体4属于Toll样受体家族，是Ⅰ型膜受体，Toll样受体家族由Medzhitov等^[13]首次在果蝇体内发现。Toll样受体信号通路除了识别外源性配体，也可识别内源性配体，而神经损伤部位的内源性配体可激活相应的Toll样受体，启动瓦勒变性过程中的先天免疫反应。在中枢神经系统中，小胶质细胞中Toll样受体4表达最为丰富^[14-15]；在外周神经系统中，Toll样受体4主要表达于许旺细胞。Toll样受体4在中枢神经系统疾病中发挥着重要作用，有研究显示Toll样受体4信号通路参与缺血再灌注脑损伤过程^[16]，可能参与新生儿缺血缺氧性脑病的发生发展和继发性脑损伤的免疫炎症反应过程及脑损伤后的神经修复的调控^[17]，亚低温治疗能通过调控Toll样受体4信号通路减轻大鼠脑出血后血肿周围脑组织的炎症反应^[18]，还有研究表明，Toll样受体介导的神经炎性反应参与了阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化等神经变性疾病和多发性硬化的发生发展^[19]，而在外周神经系统疾病的研究仍为数不多。

为探讨Toll样受体4在周围神经损伤修复过程中发挥的作用，实验抑制大鼠体内Toll样受体4信号通路，检测受损神经瓦勒变性及轴突再生修复情况。TAK-242是一种的小分子化合物，可以结合Toll样受体4受体胞内段的 Cys747 位点从而阻断Toll样受体4信号通路^[20]。最近已有研究发现，在中枢神经系统，TAK-242能穿过血脑屏障，阻断Toll样受体4信号通路，调节脑缺血/再灌注损伤^[21]，但目前尚无通过体内注射TAK-242，调控周围神经疾病的相关报道。接下来，研究从周围神经损伤后瓦勒变性过程中炎性因子的产生，巨噬细胞和许旺细胞募集，髓鞘碎片清除，以及轴突再生和运动功能恢复5个方面，来探究TLR4通过调节瓦勒变性对周围神经损伤修复所产生的影响。

作者利用Wistar大鼠建立坐骨神经损伤模型，首先检测尾静脉注射TAK-242后对大鼠坐骨神经上相关炎性因子的表达影响。在周围神经损伤后，许旺细胞活化可分泌白细胞介素1β和单核细胞趋化蛋白1，是Toll样受体4信号通路下游的炎症因子，由核因子?B活化后转位到核内^[15^，^22-23]。并且有研究显示，白细胞介素1β和单核细胞趋化蛋白1对巨噬细胞募集和髓鞘碎片清除必不可少^[22^，^24-25]。Carroll等^[9]的研究表明在坐骨神经损伤后1.5 h已经有单核细胞趋化蛋白1mRNA的早期表达，在24 h表达量最高，因此研究在术后24 h利用实时定量PCR检测大鼠坐骨神经组织上白细胞介素1β和单核细胞趋化蛋白1的基因表达水平，结果显示，在坐骨神经损伤后24 h，与假手术组相比，模型组白细胞介素1β和单核细胞趋化蛋白1 mRNA表达明显升高。而与模型组相比，注射TAK-242后白细胞介素1β和单核细胞趋化蛋白1 mRNA表达明显降低。说明周围神经损伤后，体内注射Toll样受体4拮抗剂可有效减少白细胞介素1β和单核细胞趋化蛋白1的分泌。

周围神经损伤后，崩解的髓鞘碎片上可能存在抑制轴突再生的因子，及时清除变性的髓鞘为轴突的再生提供更有利的环境^[4]，研究表明在周围神经损伤后的瓦勒变性过程中，巨噬细胞被认为是清除变性神经髓鞘碎片主要细胞之一^[6-7^，^26]，而以往的研究结果也表明，巨噬细胞和许旺细胞等在神经损伤后发生的瓦勒变性过程中，对促进神经组织修复和再生中发挥着不可替代的作用^[4]。已有研究证明在神经伤后1-3 d大量的巨噬细胞聚积，而损伤后3 d是许旺细胞增殖高峰期，脱髓鞘反应于7 d左右达到峰值。因此研究在术后第3天采用免疫荧光检测巨噬细胞和许旺细胞的募集，结果显示与模型组相比，在神经断端处理组CD68⁺细胞和iba1⁺细胞数均明显降低，说明可能通过抑制Toll样受体4通路，明显减少瓦勒变性过程中巨噬细胞和许旺细胞的募集。同时术后第7 天坐骨神经固兰染色表明，与模型组相比，处理组残余髓鞘碎片明显增加，表明处理组髓鞘碎片清除率明显降低，与上述CD68⁺细胞和iba1⁺细胞数量减少保持一致。而术后第7 天坐骨神经苏木精-伊红染色也看出，模型组许旺细胞增殖活跃，吻合口有神经纤维通过，处于正常的神经断端修复状态，而处理组纤维再生较少，吻合口有明显缝隙，神经断端修复能力明显减弱。这些结果说明了Toll样受体4抑制剂导致受损神经断端巨噬细胞及许旺细胞募集减少，崩解变性的髓鞘碎片清除率降低，从而使神经断端修复能力降低。以上结果都说明，周围神经损伤后，Toll样受体4信号可以通过对瓦勒变性早期的免疫调控影响受损神经断端的修复。

其次，作者验证TAK-242抑制瓦勒变性过程导致巨噬细胞和许旺细胞减少及髓鞘清除延迟后，是否会影响该过程中的轴突再生。生长相关蛋白43是内源性神经元生长依赖蛋白，参与轴突生长和突触形成，被认为参与神经发育密切相关^[27]，可介导再生神经纤维生长锤的黏附、生长及对再生信号的反应^[28]，在神经系统发育过程或突触重建过程中呈高表达状态，发育完成后表达明显降低。作者用距离神经断端4 mm处生长相关蛋白43的表达水平来衡量轴突再生情况，Krekoski等^[26]曾用类似的方法评价轴突再生。神经再生开始于损伤后第4天^[30]，因此实验在术后4 d通过免疫组织化学检测生长相关蛋白43的表达水平，结果显示与模型组相比，处理组生长相关蛋白43的表达水平降低，说明可能通过抑制Toll样受体4通路，导致神经断端巨噬细胞和许旺细胞数量减少，髓鞘碎片清除延迟，在此环境下影响了轴突再生水平。可以推断，周围神经损伤后，Toll样受体4信号通路可以调控瓦勒变性影响早期轴突再生，对神经损伤修复具有重要的意义。

最后探究以上对瓦勒变性过程的干预是否影响后期大鼠运动功能的恢复。坐骨神经功能指数(SFI)反映下肢协调功能和肌力恢复情况，是从行为学的角度评价周围神经功能的可靠指标。研究结果显示，处理组大鼠在20、30和40 d坐骨神经功能指数同期均明显低于模型组，提示抑制Toll样受体4信号通路后最终可能影响运动功能恢复。说明周围神经损伤后，Toll样受体4信号通路调控瓦勒变性和轴突再生，最终可能会影响后期运动功能的恢复。

实验通过大鼠体内注射拮抗剂抑制Toll样受体4信号通路，从对瓦勒变性早期炎性因子产生，巨噬细胞募集，髓鞘碎片清除，以及轴突再生和运动功能恢复5方面的影响，解释了Toll样受体4在周围神经受损后瓦勒变性过程中的重要意义。周围神经损伤后，究竟是哪种内源性配体引起Toll样受体4信号的活化尚不清楚，需要进一步研究。另外有研究初步探讨周围神经损伤修复中巨噬细胞极化状态的变化规律，发现M1型巨噬细胞首先增殖，发挥促进神经再生的作用，M2型巨噬细胞后期增殖，可能抑制神经再生^[31]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

TOLL样受体4拮抗剂干预周围神经损伤后的瓦勒变性

Toll-like receptor 4 antagonist protects against Wallerian degeneration after peripheral nerve injury

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[1]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[3]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[4]	罗选翔, 经历, 潘彬, 冯虎. 甲钴胺联合鼠神经生长因子促进脊髓型颈椎病术后神经功能的恢复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 719-722.
[5]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[6]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[7]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[8]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[9]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[10]	叶海民, 丁凌华, 孔维豪, 黄祖泰, 熊龙. 多级微管结构骨支架载体促进成骨成血管作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 621-625.
[11]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[12]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[13]	陈佳娜, 邱燕玲, 聂敏海, 刘旭倩. 组织工程支架材料修复口腔颌面部软组织缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 644-650.
[14]	宋凯凯, 张锴, 贾龙. 周围神经系统损伤的微环境与修复方式[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 651-656.
[15]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.