2.1  透钙磷石复合支架材料扫描电镜观察  在100倍扫描电镜下，掺锶10%透钙磷石呈现晶体密集堆积的团块状结构孔隙很少，复合明胶的掺锶10%透钙磷石为晶体疏松排列形成不规律且大小不等的多孔结构；在5 000倍扫描电镜下，掺锶10%透钙磷石呈现短棒状或杆状晶体无序排列的孔较小的支架结构，孔直径平均为100 μm，复合明胶的掺锶10%透钙磷石为杆状晶体疏松排列，形成大小不一孔径的多孔结构，包括10-50 μm的小孔和50-300 μm的大孔，见图2。

2.2  骨缺损修复大体观察结果  术后4周时，缺损区有一层纤维组织覆盖，探针探查空白组有界限清楚的凹陷状骨缺损；对照组材料与骨缺损界限清楚，有少量骨痂形成；明胶组材料与骨缺损界限模糊，有部分骨痂形成；0.04 g/L rhBMP2/7组材料与骨缺损界限模糊，骨痂形成较多；1 g/L rhBMP2/7组骨缺损区减小，表面有纤维骨痂覆盖。术后8周时，空白组较4周时缺损区缩小，边限模糊；对照组缺损区有部分纤维样的瘢痕组织且缺损区缩小；明胶组缺损区减小，表面有纤维骨痂形成；0.04 g/L rhBMP2/7组缺损区大部分由新生硬组织填充；1 g/L rhBMP2/7组凹陷区基本平整，完成修复。术后12周时，空白组缺损区减小，仍有部分凹陷样结构；其余4组缺损均已完成修复。

2.3  骨缺损修复锥形束CT表现  将兔下颌骨颊面(缺损处)朝上摆放进行锥形束CT扫描锥形束CT是三维成像，但只有冠状面图像是清晰的，故选择冠状面进行观察，选择测量位置时结合矢状面和横断面，选择缺损区中心的冠状面进行观察，因缺损区中心区域是最后修复的，选取中心位置有助于判断骨修复的效果，避免出现假阳性结果。但有时锥形束CT由于各种原因扫描后的结果不够好，只能在尽量靠近缺损区中心的位置选取断层图片。

    术后4周时，空白组可见缺损区边界稍清楚的低密度影像；对照组可见比空白组缺损区密度稍高的界限较清晰的影像；明胶组缺损区边界模糊，0.04，1 g/L rhBMP2/7组与明胶组差别不明显，见图3。术后8周时，空白组低密度凹陷区缩小；对照组骨缺损区低密度影像减小，有散在高密度影像；明胶组缺损区有为高密度影像，边缘呈现不规则的低密度影像；0.04 g/L rhBMP2/7组和明胶组差别不明显，缺损区大部分修复，新骨修复边缘不平整；1 g/L rhBMP2/7组基本修复，皮质骨影像不连续，见图4。术后12周时，空白组缺损区仍有部分低密度影像；对照组可见骨皮质不连续影像；其余3组缺损区与正常骨组织影像密度一致，见图5。

2.4  骨缺损修复免疫组化分析结果  Ⅰ型胶原存在于新生骨区域，是骨基质的主要成分，在骨修复初期分泌增多，随着骨修复的进行，因胶原酶逐渐增多，Ⅰ型胶原量随之减少。胞浆胞质表达黄色颗粒为阳性，均匀密集的黄色颗粒为强阳性表达，疏松分布的黄色颗粒为弱阳性表达。

术后4周时，5组Ⅰ型胶原均阳性表达，1 g/L rhBMP2/7组表达最多；术后8周时，除空白对照组外，其他4组Ⅰ型胶原表达均比术后4周时减少，1 g/L rhBMP2/7组阳性表达最强，空白对照组Ⅰ型胶原阳性表达面积比术后4周时大；术后12周时，5组阳性表达面积均比术后8周时减小，各组间无明显差异，见图6。

采用Image-Pro Plus 6.0测得各组Ⅰ型胶原表达部位的吸光度值，术后4，8，12周间比较差异有显著性意义(F=74.568，P < 0.01)，5组间吸光度值比较差异有显著性意义(F=72.607，P < 0.01)，但明胶组和0.04 g/L rhBMP2/7组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

创伤、感染、肿瘤切除等引起的大面积骨缺损修复成为临床常见和亟需解决的问题。植骨是常用的修复方式，自体骨移植以良好的骨传导、骨诱导和骨生成作用被广泛视为骨移植的金标准^[1]，但因骨源有限，且会对供体造成新的损伤，应用受限；异体骨移植虽可缓解骨源问题，却存在免疫排斥、感染疾病、骨愈合不良等缺点^[2]。骨组织工程的不断发展给为其治疗提供了新思路。种子细胞、支架材料和生长因子是组织工程学3要素^[3]。有学者将骨髓间充质干细胞等作为种子细胞接种于支架材料中，构建细胞-材料复合体并植入动物模型体内，种子细胞通过支架材料的孔结构进行物质交换，促进骨修复^[4]。但种子细胞来源不可靠，有发生肿瘤的风险，且存在异质性，诱导其为成骨细胞的过程太复杂，限制了这类材料的应用。透钙磷石因具有良好的生物相容性和骨传导性备受关注^[5]，但其降解速度快、抗压强度差。有学者同时引入柠檬酸钠和聚乳酸可有效提高透钙磷石的机械强度和生物相容性^[6]。VAHABZADEH 等^[7]报道了在透钙磷石中掺入硅可以提高机械强度，但硅在早期对血管量的生成并无上调作用。通过体内外实验现在普遍认为锶具有促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞生成的作用^[8]。有研究表明，在β-磷酸钙中加入锶(Sr)离子可以使透钙磷石抗压强度提高10%-20%^[9-12]。课题组前期的研究表明，10%锶-透钙磷石的成骨能力比透钙磷石和5%锶-透钙磷石更高，但也发现掺锶透钙磷石的孔结构不够理想，前期成骨效果不佳^[13-16]。

支架材料不仅要具备生物相容性、骨传导性、支撑骨缺损区的力学性能^[17]，还要为细胞的种植和新生组织的生长提供输送营养物质的场所，这就需要支架材料有三维互相连通、适当大小的孔径结构。ROY等^[18]在磷酸钙骨水泥中引入聚乳酸微球，在聚乳酸微球降解后形成高度互联的大孔支架，但聚乳酸降解后会产生大量的酸性物质。KIKUCHI等^[19]在羟基磷灰石中加入明胶，通过与戊二醛交联形成多孔复合材料，结果显示复合材料具有良好的骨传导性，无毒性，无破骨细胞吸收。与聚乳酸相比，明胶不会降低缺损区域的pH值，因其与戊二醛交联的产物是水；明胶是胶原的衍生物，无免疫原性，具有优异的生物降解性、细胞相容性^[20]。RAMMELT等^[21]通过在Wistar大鼠胫骨内植入含明胶和不含明胶包封膜的针发现，明胶具有生物相容性和良好的骨传导性。生长因子可以调节细胞的生长，诱导骨细胞的分化，是骨组织工程中重要的因素。在骨组织工程中常用的生长因子有骨形态发生蛋白^[22]、碱性成纤维细胞生长因子^[23]、血管内皮生长因子等^[24]。骨形态发生蛋白相关研究最为广泛，骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7都可以吸附于支架材料促进骨细胞的分化，形成新生骨组织，完成骨修复^[25-26]。但骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7存在有效剂量高、价格昂贵等缺点^[27]。体内、外研究均可证明骨形态发生蛋白2/7异源二聚体促进骨细胞分化增殖的阈值浓度低于同源二聚体，且在同等浓度时异源二聚体的成骨质量更好、速度更快^[28-29]，但并无文献报导异源二聚体的有效浓度范围。

基于骨组织工程支架材料和生长因子的考虑，为了优化10%锶-透钙磷石孔结构，促进成骨细胞的分化，实验将明胶和重组人骨形态发生蛋白2/7(recombinant human bone morphogenetic proteins 2/7，rhBMP2/7)引入10% 锶-透钙磷石中，以期得到更好的成骨效果，为临床应用提供依据。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年3至12月在华北理工大学实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验用主要试剂  磷酸氢钙二水合物(CaHPO₄•2H₂O，98%，美仑生物)；磷酸氢锶(SrHPO₄，99%，Adamas- beta)；碳酸钙(CaCO₃，99%，GENERAL-REAGEN)；一水磷酸二氢钙[Ca(H₂PO₄)₂•H₂O，95%，美仑生物]；焦磷酸钠(Na₄P₂O₇，美国Sigma 公司)；明胶(Geltain，Adamas- beta)；一水柠檬酸(C₆H₈O₇•H₂O，99.5%，美仑生物)；rhBMP2/7(美国R&D公司)。

1.3.2  实验用主要仪器  双数显恒温水浴箱(金坛市城东新瑞仪器有限公司)；真空冷冻干燥机(上海比朗仪器有限公司)；马弗炉(上海星诺有限公司)；扫描电镜(日本Hitachi公司)；Newtom 锥形束 CT(cone beam computed tomography，Aperio Services，Italy)。

1.3.3  实验动物  健康雌性家兔45只，三四月龄，体质量2.3-2.5 kg，由华北理工大学实验中心提供，许可证号：SCXK(京)2004-0004。按随机数字表法分为5组，即空白对照组、对照组、明胶组、0.04 g/L rhBMP2/7组和1 g/L rhBMP2/7组，每组9只。实验经华北理工大学实验动物伦理委员会审议批准。

1.4  实验方法  

1.4.1  骨水泥的制备  将(CaHPO₄•2H₂O+SrHPO₄)和CaCO₃按摩尔比2∶1置于马沸炉中1 100 ℃烧结12 h^[30]，制备掺锶β-磷酸三钙，Sr/(Sr+Ca)摩尔百分数为10%，(Sr+Ca)/P摩尔比为3∶2，此为对照组植入材料。把掺锶β-磷酸三钙、Ca(H₂PO₄)₂•H₂O、焦磷酸钠3种粉末与50 g/L明胶、柠檬酸溶液按5∶2均匀混合，放入模具常温2 h初凝，脱模后在无水乙醇中固化2 h，在30 ℃恒温箱干燥24 h，放入1 g/L戊二醛化学交联24 h，真空冷冻干燥24 h，制备明  胶-10%锶-透钙磷石材料，此为明胶组植入材料。将rhBMP2/7稀释为0.04，1 g/L两种质量浓度，稀释液为含体积分数0.1%胎牛血清蛋白的4 mmol HCl溶液。在10 mm×  4 mm×3 mm明胶-10%锶-透钙磷石材料滴加100 µL质量浓度0.04 g/L或1 g/L的rhBMP2/7，于-80 ℃下冷冻2 h，再用真空冷冻干燥机负压抽吸5 h，制成rhBMP2/7-胶原-10% 锶-透钙磷石材料，此为0.04，1 g/L rhBMP2/7组植入材料，于-80 ℃下保存。扫描电镜观察复合支架材料的微观结构。

1.4.2  骨缺损模型制备与骨水泥植入  家兔术前禁水、禁食12 h，器械高温高压消毒，植入材料进行环氧乙烷消毒。采用3 mL/kg耳缘静脉注射10%水合氯醛进行麻醉家兔，在距兔双侧下颌骨下缘5 mm处做1 cm的手术切口，在颏孔前1 mm处制成长10 mm、宽4 mm、深3 mm的骨缺损，缺损为凹槽状，保留舌侧骨板，见图1。术程一直伴有无菌生理盐水喷入降温，避免骨坏死^[31]。植入骨水泥，空白对照组不植入材料，分层缝合。术后3 d早晚各肌注20 U青霉素。

1.5  主要观察指标  术后4，8，12周，采用耳缘静脉空气栓塞法处死家兔，立刻分离标本，置于体积分数10%甲醛磷酸缓冲液中固定12 h，进行锥形束CT扫描观察骨修复情况。将标本置于10%EDTA中脱钙12周，常规石蜡包埋、切片，免疫组织化学观察Ⅰ型胶原的表达，每张图片中选6个视野(×200)，用Image-Pro Plus 6.0软件测量各组的吸光度值，进行比较。

1.6  统计学分析  采用SPSS 22.0进行统计学分析，采用双因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，P < 0.05差异有显著性意义。

兔是比较常用的骨缺损模型动物^[32]，因其具备与人体相似的骨哈弗系统，骨架大小合适，手术操作方便，是比较理想的实验动物^[33]。研究报道在兔下颌骨颏孔前做   10 mm×4 mm×3 mm的缺损，12周后未自然愈合，这符合极限骨缺损模型的概念^[34]。极限骨缺损模型最早由Hollinger和Schmitz定义：即单凭动物自身修复不能达到完全新骨修复的骨缺损^[35-36]。实验在制备兔下颌骨缺损模型时骨缺损为凹槽状，保留舌侧骨板，因兔牙槽骨区域股厚度约6 mm^[37]。

支架材料不仅要具备大小孔结构，这些孔结构也要相互连通，便于运输营养物质、交换代谢产物，便于细胞生长，也为生长中的血管提供足够的空间^[38]。有文献报道直径为15-40 µm孔结构适合纤维组织的生长，40-100 µm的孔结构适合骨组织的生长，只有在孔结构大于100 µm时血管组织才能长入^[39]。而血管只有长入支架材料中才可以为细胞输送营养物质，带走代谢废物，所以支架材料的大孔结构尤为关键。虽然课题组前期将锶掺入透钙磷石提高了抗压强度，但透钙磷石孔结构没有明显改善，因此将明胶引入掺锶透钙磷石中优化孔结构。明胶溶液与戊二醛交联后形成的水凝胶中的水可作为致孔剂，增加材料的孔隙率，改变材料中孔结构的大小。明胶可与多种化学交联剂交联，其中戊二醛是迄今为止使用最普遍的一种醛类交联剂^[19]，其反应机制为2个活性醛基与明胶中赖氨酸或羟赖氨酸残基上的ε-氨基发生交联反应，形成席夫碱(Schiff碱)的过  程^[40]。实验成功将明胶加入掺锶10%透钙磷石骨水泥中，改善材料的细胞亲和性，增加孔隙率，利于成骨细胞的迁移和生长，提高材料的成骨能力。术后12周时，明胶组修复完成，而对照组骨皮质不连续、空白对照组仍有浅凹型缺损，说明明胶的引入加快了骨缺损的修复速度，缩短了成骨时间。

骨形态发生蛋白是一组能够诱导和促进骨形成的细胞因子，属于转化生长因子超家族成员(骨形态发生蛋白1除外)，是骨组织工程中最重要的骨诱导生长因子，分为同源二聚体和异源二聚体。其中骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7在动物实验中和在人体试验中已被证实具有最强的促进骨形成的能力^[41]。临床上已经将骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7用于骨修复^[42]，但由于临床应用剂量高、价格昂贵、不良反应多^[43-44]，限制了骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7的使用。骨形态发生蛋白异二聚体的形式可有效避免这些问题^[45-47]。ZHENG等^[28]在体外通过rhBMP2、rhBMP7、rhBMP2/7诱导MC3T3-E1分化为成骨细胞的生物学特征实验发现，与rhBMP2、rhBMP7相比，rhBMP2/7异源二聚体诱导骨细胞分化的阈值浓度明显降低。在体内实验中，WANG等^[29]发现与同源二聚体骨形态发生蛋白相比，低剂量骨形态发生蛋白2/7异二聚体在种植体周围骨缺损中成骨质量更好、骨再生速度更快。有研究发现在支架材料加入0.04 g/L rhBMP2/7就可在组织学上观察到成骨现象^[48]，但尚无报道其在兔下颌骨缺损修复实验中有效剂量。实验选用0.04，1 g/L两个剂量尝试性探索其在兔下颌骨缺损修复中的成骨效果。术后第8周时，1 g/L rhBMP2/7组骨修复基本完成，新生骨组织与周围组织几乎融合；0.04 g/L rhBMP2/7组和明胶组可见骨修复大部分完成，新骨修复边缘不平整，对照组和空白对照组未完全修复，说明加入rhBMP2/7促进了成骨，缩短了骨缺损修复时间。

骨组织由1/3有机物及2/3无机物构成，Ⅰ型胶原蛋白占有机成分的80%-90%^[49]。Ⅰ型胶原由成骨细胞分泌，是骨基质的主要组分，在骨缺损修复成骨阶段是主要胶原组成，是反映成骨的重要指标，成骨越活跃Ⅰ型胶原表达越高。在术后4周时，5组表达的Ⅰ型胶原量最高，术后8，12周随着骨修复逐渐完成而减少，这提示Ⅰ型胶原主要作用在骨缺损修复初期。与空白组和对照组相比，明胶组表达量较高，是因为经冷冻干燥交联后的水凝胶去除了水分，支架材料由原来平均孔径约100 µm改性为孔径10-50 µm和50-300 µm尺寸、孔洞相互连通的多孔隙支架材料，大孔有利于成骨过程中营养物质的输送和代谢废物的排出，孔隙率提高可以增加成骨细胞的植入量和贴壁量。1 g/L rhBMP2/7组Ⅰ型胶原表达比其他4组高，与骨形态发生蛋白具有诱导未分化间充质细胞分化为成骨、成软骨细胞的作用有关^[50] 。加入1 g/L rhBMP2/7支架材料的成骨作用优于0.04 g/L rhBMP2/7的支架材料，很明显是因为两者添加生长因子质量浓度不同。但0.04 g/L rhBMP2/7组与明胶组的Ⅰ型胶原表达量相差甚微，考虑可能原因有二：一是在材料制备过程中降低了因子的活性，在成骨时具有微弱的成骨细胞诱导作用；二是因子在植入材料时快速释放，未能发挥作用，而剩余因子的浓度太低，不在有效浓度范围内。

在掺锶10%透钙磷石中加入明胶，增加材料孔隙率和细胞亲和性以提高成骨能力。同时在掺锶10%透钙磷石中加入明胶和rhBMP2/7，可在兔下颌骨缺损修复中促进Ⅰ型胶原分泌，缩短骨修复时间。当然，实验仍存在局限性，例如只参照以往的研究结果选取单一的BMP2/7体内应用浓度，欠缺rhBMP2/7与掺锶10%透钙磷石体复合物体内作用效果，锶离子与rhBMP2/7是否有协同作用今后仍需更加深入的研究，以进一步明确rhBMP2/7的最佳作用浓度，探讨锶离子与rhBMP2/7的协同或拮抗关系，以促进其临床转化。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

明胶：是胶原蛋白的水解产物，具有优异的生物降解性、细胞相容性和无免疫原性。在30-40 ℃时，明胶由固态转化为溶液，明胶溶液与戊二醛共价交联后形成水凝胶中的水可作为致孔剂，增加支架材料的孔隙率，改变支架材料中孔结构的大小。

骨形态发生蛋白：是一组能够诱导和促进骨形成的细胞因子，属于转化生长因子超家族成员，是骨组织工程中最重要的骨诱导生长因子，分为同源二聚体和异源二聚体，其中骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7、骨形态发生蛋白2/7的研究最为广泛，骨形态发生蛋白2/7的成骨效果优于骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

明胶可以优化掺锶透钙磷石骨水泥的孔结构，形成大孔与小孔并存且连通的网状孔结构，重组人骨形态发生蛋白2/7能够以低浓度、在短时间内诱导和促进骨形成。基于骨组织工程支架材料和生长因子的考虑，首次将明胶和重组人骨形态发生蛋白2/7引入掺锶透钙磷石骨水泥中研究复合材料修复兔下颌骨缺损的成骨效果，并探索重组人骨形态发生蛋白2/7修复兔下颌骨缺损的浓度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程