一种新型光交联鱼胶原蛋白肽-透明质酸水凝胶的性能表征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2284

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (28): 4518-4525.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2284

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一种新型光交联鱼胶原蛋白肽-透明质酸水凝胶的性能表征

郭恩慧，许子桐，梁贻泽，周亮，鲁召翔，尤梁，夏玉军

青岛大学医学部，山东省青岛市 266071

收稿日期:2019-10-21 修回日期:2019-10-25 接受日期:2019-11-25 出版日期:2020-10-08 发布日期:2020-09-01
通讯作者: 夏玉军，博士，教授，博士生导师，青岛大学医学部，山东省青岛市 266071
作者简介:郭恩慧，女，1996年生，山东省高密市人，汉族，青岛大学在读本科生。
基金资助:
青岛市民生科技计划项目(15-9-2-76-nsh)

Properties of a novel photocrosslinked fish collagen peptide-hyaluronic acid hydrogel

Guo Enhui, Xu Zitong, Liang Yize, Zhou Liang, Lu Zhaoxiang, You Liang, Xia Yujun

Medical College, Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China

Received:2019-10-21 Revised:2019-10-25 Accepted:2019-11-25 Online:2020-10-08 Published:2020-09-01
Contact: Xia Yujun, PhD, Professor, Doctoral supervisor, Medical College, Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China
About author:Guo Enhui, Medical College, Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China
Supported by:
the Qingdao Livelihood Science and Technology Program, No. 15-9-2-76-nsh

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

鱼胶原蛋白肽：提取自深海狭鳕鱼鱼皮中，胶原蛋白是一种高分子功能性蛋白质，是皮肤的主要组成部分。通过酸碱、酶切等技术把分子质量控制在6 000 Da以内的胶原蛋白称之为胶原蛋白肽。肽是精准的蛋白质片段，其吸收率要远远高于大分子蛋白质，富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸，在安全性方面没有动物疫病和人工养殖药物残留等风险，且具有多种生物学功能。

光交联：是高分子化合物光化反应的一种。化合物受光照射后发生光解作用，或者化学键的一部分开键时，生成的游离基等活化分子互相键合而导致高分子链形成网状结构的反应。实验水凝胶原材料首先合成胶原蛋白肽-甲基丙烯酸和透明质酸-甲基丙烯酸，继而在光引发剂I2959作用下紫外光照射成胶。

背景：课题组前期实验成功制备了一种新型光交联鱼胶原蛋白肽-透明质酸水凝胶。

目的：分析光交联鱼胶原蛋白肽-透明质酸水凝胶的形态与体外溶胀性能，以及植入体内的组织相容性与降解性。

方法：利用光交联制备光交联鱼胶原蛋白肽-透明质酸水凝胶，并根据其所含的鱼胶原蛋白肽质量浓度分为A组(30 g/L)、B组(50 g/L)、C组(100 g/L)，凝胶中透明质酸质量浓度均为2.5 g/L，通过扫描电镜观察其微观结构，过体外溶胀实验研究水凝胶的溶胀性能。取15只雄性SD大鼠(由青岛琴大养殖有限公司提供)，在每只大鼠的3处背部皮下植入3种光交联鱼胶原蛋白肽-透明质酸水凝胶，术后1，2，4，6，8周各取3只大鼠，分析水凝胶的组织相容性与降解性。实验获得青岛大学基础医学院伦理委员会批准。

结果与结论：①随着鱼胶原蛋白肽质量浓度的升高，水凝胶的透明度逐渐降低、孔径逐渐缩小；②3种水凝胶在去离子水中浸泡100 min内均达到溶胀平衡，水凝胶的溶胀速率及平衡溶胀率与凝胶中的鱼胶原蛋白肽质量浓度呈反比，A组平衡溶胀率最高，为1 582%；③水凝胶植入后，大鼠皮肤光滑，无溃烂与增生，未发生感染与血肿等并发症；④植入皮下1周时，3组水凝胶周围均可见炎性细胞浸润，至2周时达高峰，随后逐渐减少，术后各时间点的炎性细胞计数为：A组>B组>C组，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤植入大鼠皮下后，3种水凝胶逐渐降解，至8周时均有水凝胶残留，术后各时间点降解率为：A组>B组>C组，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；⑥结果表明，光交联鱼胶原蛋白肽-透明质酸水凝胶具有良好的组织相容性与体内降解性，并且通过调节其中鱼胶原蛋白肽的含量可改善其相关性能。

ORCID: 0000-0002-3785-3547(郭恩慧)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 水凝胶, 鱼胶原蛋白肽, 透明质酸, 光交联, 溶胀率, 组织相容性, 降解性, 组织工程, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: A novel photocrosslinked fish collagen peptide-hyaluronic acid hydrogel has been successfully prepared by the research group.

OBJECTIVE: To investigate the microstructure and the swelling properties in vitro of the photocrosslinked fish collagen peptide-hyaluronic acid hydrogel, and its histocompatibility and degradability in vivo.

METHODS: A new photocrosslinked fish collagen peptide-hyaluronic acid hydrogel was prepared by photocrosslinking, and then divided into groups A (30 g/L), B (50 g/L) and C (100 g/L) according to the content of fish collagen peptide. The microstructure of the hydrogel was observed by scanning electron microscope and the swelling properties of hydrogels were studied by swelling test in vitro. Fifteen male Sprague-Dawley rats (provided by Qingdao Qinda Breeding Co., Ltd.) were selected, and three kinds of photocrosslinked fish collagen peptide-hyaluronic acid hydrogels were implanted into the back of rats. At 1, 2, 4, 6 and 8 weeks after surgery, three rats were selected for detecting the histocompatibility and biodegradability of hydrogels. The study was approved by the Ethics Committee of School of Basic Medicine, Qingdao University.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) With the increase of fish collagen peptide content, the transparency of hydrogel decreased and the pore size of hydrogel decreased. (2) Swelling equilibrium was achieved within 100 minutes in each group, and the swelling velocity and equilibrium swelling rate were inversely proportional to the content of collagen peptide. The equilibrium swelling rate was highest in the group A, which was 1 582%. (3) The hydrogel had good histocompatibility, mild inflammatory reaction, no infection, hematoma or other complications in vivo. (4) At 1 week after implantation, inflammatory cell infiltration was observed surrounding the hydrogels. The level of inflammatory cells peaked at 2 weeks, and then decreased gradually. The count of inflammatory cells was highest in the group A, followed by group B, and lowest in the group C (P < 0.05). (5) After implanted into the back of rats, three kinds of hydrogels began to degrade, and residue still existed up to 8 weeks. The order of degradation rate at each time point was as follows: group A > group B > group C (P < 0.05). (6) These results indicate that photocrosslinked fish collagen peptide-hyaluronic acid hydrogel has good histocompatibility and biodegradability in vivo, which can be adjusted by the content of fish collagen peptides.

Key words: hydrogel, fish collagen peptide, hyaluronic acid, photo-crosslinking, histocompatibility, degradability, tissue engineering, biomaterials

中图分类号:

郭恩慧, 许子桐, 梁贻泽, 周亮, 鲁召翔, 尤梁, 夏玉军. 一种新型光交联鱼胶原蛋白肽-透明质酸水凝胶的性能表征[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(28): 4518-4525.

Guo Enhui, Xu Zitong, Liang Yize, Zhou Liang, Lu Zhaoxiang, You Liang, Xia Yujun. Properties of a novel photocrosslinked fish collagen peptide-hyaluronic acid hydrogel[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(28): 4518-4525.

图/表（结果） 8

2.1 水凝胶的大体观及电镜观水凝胶外观为直径6 mm、高1.25 mm的圆柱体，随鱼胶原蛋白肽浓度的升高，水凝胶的透明度降低，见图1。将各组水凝胶真空冻干后进行扫描电镜观察，发现3组水凝胶均为疏松多孔结构，孔径随鱼胶原蛋白肽含量的升高而减小，见图2。

2.2 水凝胶的溶胀性图3中显示了不同组分水凝胶材料在37 ℃去离子水中的溶胀曲线。

由图可见，在溶胀初期水凝胶的吸水溶胀速度较快，后期逐渐变缓至溶胀平衡，不同配比的水凝胶都可在100 min内达到溶胀平衡。对比各组，当鱼胶原蛋白肽质量浓度为 30 g/L时，水凝胶达溶胀平衡时的溶胀率为1 582%；当鱼胶原蛋白肽质量浓度为50 g/L时，水凝胶达溶胀平衡时的溶胀率为610%；当鱼胶原蛋白肽质量浓度为100 g/L时，水凝胶达溶胀平衡时的溶胀率仅为225%，可看出随着水凝胶中鱼胶原蛋白肽含量的增高，达溶胀平衡时的最大溶胀率迅速缩小，各组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。尽管各组均具有较快的溶胀速率，但因配比不同，溶胀速率大小也呈A组>B组>C组的趋势，各组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 水凝胶动物体内实验结果

2.3.1 动物一般情况术后所有实验大鼠一般情况良好，进食佳，活动正常，体质量均增长稳定，无意外死亡。术后二三天手术区有轻微红肿，四五天红肿逐渐消退，术后 7 d达一期愈合。

2.3.2 水凝胶的体内组织相容性大体观察手术切口愈合良好，各实验组与假手术组愈合情况无明显差异，见图4。

水凝胶植入处皮肤平滑，无溃烂、增生；各个时间点翻开大鼠背部皮肤观察，未发生感染、血肿等并发症，可见水凝胶周围包裹了一层纤维薄膜，与周围组织无明显炎性粘连；随时间延长，水凝胶的体积逐渐缩小，缩小程度A组>B组>C组；至观察终点，水凝胶体积有所缩小，但仍保持原形态，未发生崩解，见图5。

组织学观察显示，各组切片周围细胞排列规则，炎症均未波及皮肤及肌肉组织，未见组织变形坏死或异常增生；术后1周时，各组水凝胶周围均有少量炎性细胞及成纤维细胞浸润，炎性细胞以淋巴细胞为主，可见少量巨噬细胞，极少见中性粒细胞；术后2周时，周边炎性细胞浸润较第1周增多，可见淋巴细胞、成纤维细胞、新生血管长入凝胶；术后4周时，水凝胶周边炎性细胞浸润开始减少，纤维母细胞增生并分泌胶原纤维，水凝胶周围可见明显包裹的纤维薄膜，与周围组织界限清楚；术后6周时，周边炎性细胞浸润减少，组织细胞进一步长入凝胶；术后8周时，周边炎性浸润尚未完全消失，但已较少，凝胶内部大部分长入组织，见图6。各组炎性细胞计数见图7所示，术后1周各组水凝胶周围均有少量炎性细胞浸润，至术后2周时周边炎性细胞浸润明显增多，随后各个时间点炎性细胞浸润逐渐减少，各个时间点炎性细胞浸润程度均为A组>B组>C组，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3.3 水凝胶的体内降解性大体观察可见随时间延长水凝胶的体积不断缩小，降解程度A组>B组>C组，但至术后8周时都有凝胶残留，水凝胶仍保持原形态，未发生崩解，见图5。

组织学观察显示，术后1周时，各组仅在凝胶周边有少许组织细胞长入凝胶，凝胶内部完整，无组织细胞生长现象，A组组织细胞生长数目较B组多，C组仅少量细胞长入凝胶边缘。术后2周切时，组织细胞呈条索状长入各组凝胶，A组已有较多组织细胞长入凝胶内部，主要为成纤维细胞，淋巴细胞，极少见中性粒细胞，可见新生血管；B组也有组织细胞长入凝胶的情况，较A组为少；C组仅有少量组织细胞长入水凝胶。术后4周时，A组有更多组织细胞长入，成纤维细胞分泌胶原，新生血管进一步增多；B组亦有更多组织细胞长入，较A组为少；C组增多，但明显少于A、B两组。术后6周时，各组组织细胞进一步增多，凝胶逐渐吸收。术后8周时，凝胶内部大部分长入组织，A组凝胶残留已较少，凝胶降解吸收处组织形态已类似周围真皮组织；B组有较多凝胶残留；C组有大量水凝胶残留，水凝胶仍基本保持原来形态，尚未崩解，见图6。

各组水凝胶不同时间点的降解情况见图8，可见第2周降解速率较第1周明显加快，随后降解速率开始逐渐减慢，至第8周观察结束时，A组降解率达54%，B组降解率达45%，C组降解率达36%。各个时间点降解率相比均为A组>B组>C组，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

近代学者提出了生物材料及组织工程的概念。生物材料又称生物医用材料，是一类天然或人工合成的特殊功能材料，其通过与生命系统接触和发生相互作用，对细胞、组织和器官进行诊断治疗、替换修复或诱导再生。组织工程学是将分离提取的细胞进行体外培养扩增，然后将其复合于组织相容性良好、可降解吸收的三维支架材料上，从而形成具有生物活性的复合物，植入体内达到修复病损的目的^[1]。因此寻找合适的三维支架生物材料成为了关注热点^[1-5]。

近年来水凝胶研究引起人们的关注，水凝胶保水能力好、柔软、生物相容性良好，内部的多孔结构可以承载高负荷化合物(如活性蛋白质、多肽)，同时可保证营养物质顺利进入和代谢^[6-10]，已被广泛应用于伤口敷料、药物缓释载体、组织工程等生物医学领域^[11-14]。水凝胶常以胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖等天然分子作为其原材料，逐步取代了传统的生物相容性低、可降解性差的生物医用支架材料(不锈钢、铝合金、生物陶瓷、聚乳酸等)^[15-19]。

鱼胶原蛋白肽提取自深海狭鳕鱼鱼皮，其吸收率远高于大分子蛋白质，富含人体需要的氨基酸，在安全性方面没有动物疫病和人工养殖药物残留等风险，且具有多种生物学功能。研究发现，鱼胶原蛋白肽具有调节人体免疫力、止血、缓解关节疼痛、防止贫血等功能，其生物相容性好、免疫原性低、生物可降解性适宜，在组织工程支架中有望替代哺乳动物胶原^[20-23]。透明质酸是细胞外基质的组成成分之一，是目前发现的保水性最好的物质，可提高水凝胶的溶胀性能，促进细胞的增殖分化，同时其具有的生物活性位点也可促进组织再生^[24-25]。透明质酸无免疫原性，在血管再生、伤口愈合、抗炎方面显示出了独特优势^[26-28]。光交联作为一种构建水凝胶的常见方式，具有低成本、快速等优点，其反应条件温和，不影响细胞的存活^[29-31]。

未来组织工程相关生物材料的发展方向是如何仿生化^[32-35]，而胶原蛋白与透明质酸是细胞外基质的重要组成成分。为改善鱼胶原蛋白肽单独成胶的不足，课题组前期研究将其与透明质酸通过紫外线辐射交联成功制备了一种新型鱼胶原蛋白肽-透明质酸水凝胶^[37]，研究设计将其应用于伤口敷料、药物缓释载体、组织工程等生物医学领域。此次实验是该课题研究中的重要组成部分，从水凝胶材料的微观结构、体外溶胀性、体内组织相容性、体内降解性等方面进行综合分析，评估其用于生物医学领域的可行性，为后期进一步研究及临床应用提供依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察性实验，动物对比实验。

1.2 时间及地点实验于2017年10月至2018年10月在青岛大学医学部博雅楼解剖实验室完成。

1.3 材料

实验动物：45 d龄雄性SD大鼠15只，体质量200-230 g，由青岛琴大养殖有限公司提供。实验获得青岛大学基础医学院伦理委员会批准。

实验用主要试剂：狭鳕鱼皮胶原蛋白肽粉末由青岛福生食品公司和青岛大学医学部馈赠；透明质酸钠购自美国abcam公司；甲基丙烯酸酐、三乙胺、N-二甲基甲酰胺及光引发剂I2959均购自美国Sigma-Aldrich公司；透析袋购自北京索莱宝科技有限公司；硫化钠购自天津市广成化学试剂有限公司；氨基甲酸乙酯、水合氯醛购自源叶生物。

实验用主要仪器：冷冻干燥机(FD-1A-50，上海比朗仪器制造有限公司)；电热恒温水箱(HH.W21.420，北京科伟永兴仪器有限公司)；电热恒温培养箱(DNP-9162，上海三发科学仪器有限公司)；电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；扫描电子显微镜(日本JEOL)；紫外光灯(ZF-7，上海宝山顾村电光仪器厂)；切片机(上海徕卡仪器有限公司)；显微镜(BX51TRF，美国奥林巴斯公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 水凝胶的制备通过加成反应在鱼胶原蛋白肽及透明质酸中引入丙烯酸酯官能团，合成前提材料，然后采用光活化化学交联反应形成凝胶。①首先合成胶原蛋白肽-甲基丙烯酸：将肽粉加入蒸馏水中充分溶解，加入N-二甲基甲酰胺、三乙胺、甲基丙烯酸酐，在反应过程中每隔12 h加入一定量的碳酸氢钠调节pH值。反应结束后的溶液用截留相对分子质量为1 kD的透析袋透析3 d，然后冻干备用。②透明质酸-甲基丙烯酸合成操作同胶原蛋白肽-甲基丙烯酸的合成。③将一定量引入官能团后的胶原蛋白肽与透明质酸溶于蒸馏水，加入1 g/L的光交联剂I2959，紫外光灯照射15 min成胶，成胶后放入PBS中冲洗浸泡备用。各种成分详细配比见参考文献[37]。根据加入的鱼胶原蛋白肽含量分为A组、B组、C组，凝胶中的鱼胶原蛋白肽浓度分别为30，50，100 g/L，透明质酸浓度均为2.5 g/L。将各组水凝胶制成直径为6 mm、高为1.25 mm的圆柱体及直径为12 mm、高为2.2 mm的圆柱体2种规格。

1.4.2 大体及扫描电镜观察水凝胶形态首先大体观察3组水凝胶的透明度。然后取出各组水凝胶样本，切取2 mm× 2 mm×4 mm小块后冲洗固定，二氧化碳临界干燥，然后进行喷金处理以增加样品的导电性，采用扫描电子显微镜观察水凝胶内部的微观三维网络结构，观察各组凝胶的孔径。

1.4.3 水凝胶的溶胀性将直径为12 mm、高为2.2 mm的圆柱体水凝胶置于电热恒温培养箱60 ℃烘干，称质量后置于去离子水中，放于37 ℃恒温水浴锅中。在不同时间点将水凝胶取出，用滤纸轻轻擦拭凝胶表面以除去凝胶表面上多余的水分，然后用电子天平称量溶胀后的水凝胶，记录质量，直至达到溶胀平衡。同一水凝胶样品随机选取3组进行平行测试，取溶胀比的平均值。用以下公式来计算溶胀率(%)：溶胀率(%)=(m_s-m_d)/m_d×100%，m_d为凝胶初始时的干质量，m_s为不同时间点凝胶吸水后的湿质量，绘制溶胀率对时间的溶胀曲线。

1.4.4 水凝胶的动物体内实验

动物模型的构建：将直径为6 mm、高为1.25 mm的圆柱体水凝胶放入体积分数75%乙醇中浸泡1 h，然后PBS冲洗浸泡备用。选择清洁级雄性SD大鼠15只，术前硫化钠脱毛备皮，水合氯醛及氨基甲酸乙酯复合麻醉后，于大鼠背部脊柱两侧做4个切口，长约1 cm，切开皮肤全层后分离皮下组织，制备4个皮下囊袋。4个囊袋分别为假手术组及A、B、C组，后3组植入对应的水凝胶，将水凝胶包埋于大鼠皮下后缝合。术后每天观察实验大鼠，记录一般情况。在第1，2，4，6，8周分别随机处死3只大鼠，剪开其背部皮肤，翻开观察。然后切取植入水凝胶部位的全层皮肤至筋膜，常规固定，脱水，石蜡包埋，切片(0.5 μm)，苏木精-伊红染色后行光镜下组织学观察。

水凝胶的体内组织相容性：水凝胶植入后每天观察实验大鼠，记录全身情况、体质量变化、手术区变化、切口愈合情况。在处死大鼠时翻开其背部皮肤，观察水凝胶的组织相容性。然后各标本切片行苏木精-伊红染色，光镜下观察组织相容性。每张切片在100倍镜下先观察材料周围炎症反应，确定植入材料与周围组织包括被覆纤维膜的界面；然后在400倍镜下随机选取5个视野，通过OLYMPUS CX31生物显微镜、图像采集卡、数码相机采集数字图像，应用Image-Pro Plus 6.0分析软件进行炎性细胞计数。每一标本观察3张切片，取平均值。

水凝胶的体内降解性能：各个时间点处死大鼠时翻开其背部皮肤，观察水凝胶的降解情况。然后行切片苏木精-伊红染色，光镜下观察水凝胶的体内降解情况并统计水凝胶降解率。数字图像采集同炎性细胞计数，应用Image-Pro Plus 6.0分析软件计算视野中水凝胶降解面积占比。每一标本观察3张切片，取平均值。

1.5 主要观察指标 ①水凝胶的大体观及电镜观；②水凝胶的溶胀性能；③水凝胶的体内组织相容性与降解性。

1.6 统计学分析利用SPSS 24.0统计软件进行统计学分析，组间两两比较采用独立样本t 检验，多组比较采用单因素方差分析，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

近年来水凝胶的研究较多，在生物医学领域应用日益广泛^[7]，胶原和透明质酸等天然高分子常作为其原材料^[38-39]。课题组前期研究中采用光交联成功制备了一种新型鱼胶原蛋白肽-透明质酸复合水凝胶，并通过制备不同浓度的水凝胶发现，随着鱼胶原蛋白肽浓度的升高，水凝胶的孔径减小，这主要是因为随着浓度升高交联度增加。

溶胀通常包括3个连续的过程：首先，水分子扩散进入到凝胶内部，随后凝胶中高分子链发生松弛，最后整个高分子链在水中伸展，凝胶网络达到溶胀平衡^[40]。通常水凝胶中的水的质量分数远高于处于膨胀状态聚合物的质量分数^[7]。李静静等^[15]报道了一种吸水膨胀率适宜的水凝胶，其平衡溶胀率范围为623%-957%。周慧通等^[41]报道了一种吸水性好、适宜作为药物递送载体的光交联多孔水凝胶，其溶胀率为746%-1 490%。实验中3组水凝胶的平衡溶胀率范围为225%-1 582%，吸水性好。水含量的变化不仅会影响水凝胶的结构，还会影响其溶蚀、降解和药物释放行为^[42-45]。随着水凝胶溶胀率的增加，水凝胶的孔隙增加，有利于组织细胞的生长及降解因子的进入，有利于水凝胶的降解；同时孔隙的增加及三维网络的舒展，有利于水凝胶更好的承载药物及促进药物释放^[46-48]。后期可以考虑继续深入研究，挖掘其应用于药物递送载体的潜力，从而为后期研究及临床应用提供依据。

水凝胶的溶胀取决于2方面：一方面，水分子渗透到水凝胶网络内部使其体积膨胀，导致聚合物三维网络的舒展；另一方面，三维网络受到弹性收缩力的作用使网络有收缩的趋势。当此两种作用相互抵消时，水凝胶达到溶胀平衡^[49]。随着水凝胶浓度的增加，体系的聚合程度更高，分子间的作用力增强，网络结构致密结构，这使得凝胶的溶胀束缚力增大，水分子不易进入，导致其平衡溶胀率大幅降低，这与在水凝胶外观观察中得出的变化规律是一致的。水凝胶的含水量高，保湿性好，并且可以根据鱼胶原蛋白肽的含量调节性能，这都有利于其在临床组织工程及再生医学领域的应用。

高分子聚合物经辐射合成的水凝胶，作为现代敷料必须具有良好的生物相容性，表现为对机体和组织细胞无任何毒性和刺激作用^[14]。前期实验以凝胶包埋人脐带间充质干细胞，实验结果显示凝胶中的人脐带间充质干细胞存活、生长良好，凝胶中三维培养的细胞形态呈现球形，具有平稳的生长速度和持久的增殖能力^[37]。此次实验通过动物实验证明了水凝胶的体内组织相容性良好，大体观察未见明显炎症反应及感染中毒现象，组织学观察亦无严重炎性反应。周围纤维薄膜的包裹常被认为是植入材料与机体组织间的理想反应，是提示材料生物相容性良好的一个重要指标；纤维组织进入凝胶网孔中，同时新生血管形成，凝胶材料能与组织有机结合也表明了生物相容性良好^[42，50]。

如炎性细胞计数所示，在植入早期由于手术器械损伤及吞噬细胞识别材料，周围有少量炎症细胞浸润。第2周时炎性细胞的增长主要是部分水凝胶降解所引起的炎性细胞聚集。随时间延长，水凝胶周围逐渐被一层纤维薄膜包裹，周围的炎性细胞开始减少，炎性反应逐渐减轻。各组炎性反应存在差别：A组>B组>C组，这可能是因为水凝胶降解速率的差异^[51]，炎性反应程度受降解产物的影响，降解越快，降解产物即产生的中小分子物质越多，吸引的炎性细胞便越多^[52]。这种炎性反应经时间的延长及水凝胶周围的纤维薄膜包裹而逐渐趋于平静。良好的生物相容性为水凝胶的临床应用提供了基础。

植入体内的生物支架依次经历宿主细胞向内生长、多因素介导降解和新生组织形成等过程。有实验证明，新生组织细胞包括新生血管可以分泌多种生长因子如成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子，进一步促进组织生长进入材料，加速降解^[53]。对比炎性细胞计数及水凝胶的降解率可以看出，水凝胶的降解速率与炎性细胞的浸润程度也有密切关系，水凝胶的降解速率与炎性细胞浸润程度的变化趋势一致。研究表明，炎性细胞可以发挥吞噬作用及分泌酶类促进材料降解^[54-55]。第1周时炎性细胞浸润水凝胶周围，促进水凝胶的周边降解；第2周降解速率明显加快，主要是因为凝胶周边及内部炎性细胞浸润程度的增加，以及组织细胞生长进入水凝胶内部孔隙，引起了降解加速；第4周时水凝胶仍在不断降解，说明细胞仍在不断进入凝胶取代凝胶组织，水凝胶可被机体降解，但降解的速率减慢，主要因为水凝胶周围炎性细胞的减少及水凝胶周围纤维薄膜的包裹，在一定程度上减少了细胞的长入，降低了水凝胶的降解速率。

支架的降解特性还与孔隙率、孔径和交联度等生物材料的性质相关^[20，56]。实验显示总体降解速率A组>B组>C组，各组降解速率的差异可能是由于鱼胶原蛋白肽浓度的提高使凝胶体系交联程度增高、网孔变小、溶胀比降低，从而使凝胶的孔隙小，不利于细胞进入，降低了水凝胶的降解性能。其次，降解也与炎性反应的差异有关^[51-52]。A组降解速率快产生的中小分子物质多，引起的炎性细胞浸润较其他两组多，因此有利于其进一步降解。至观察终点各组水凝胶均未完全降解，说明水凝胶降解较慢，具有早期稳定性，这可能是由于化学交联降低了分子的可降解性^[57-58]，以及透明质酸的高分子质量使降解减慢。因此，后期应用中如果想提高水凝胶的降解性，可以考虑降低透明质酸的分子质量。同时植入大鼠体内的水凝胶仍保持原来的形态，说明水凝胶具有相对较强的抗变形能力，这可能是与透明质酸的复合交联在一定程度上增强了水凝胶的机械强度。正如研究表明化学交联可显著提高材料的韧性、机械强度^[59-61]。吴炜等^[61]报道交联对于胶原基材料是必要的，其能改善支架材料机械性能。陈琳等^[62]报道胶原交联后其拉伸强度由210 N提高到了3 400 N。国外研究显示以紫外线辐照交联的胶原纤维综合性能良好，可提高产品的力学性能^[63]。透明质酸是构成细胞外基质的数种葡糖胺聚糖中的一种，其黏弹性明显，可以增强产品的弹性^[64-65]。

目前关于鱼胶原蛋白肽应用于水凝胶的研究较少，此次实验初步研究了鱼胶原蛋白肽-透明质酸复合水凝胶的部分性能，后期可以考虑继续深入研究，挖掘其应用于伤口敷料、组织工程等生物医学领域的潜力，从而为后期研究及临床应用提供依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

一种新型光交联鱼胶原蛋白肽-透明质酸水凝胶的性能表征

Properties of a novel photocrosslinked fish collagen peptide-hyaluronic acid hydrogel

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