2.1  细胞增殖活性  在正常情况下，髓核间充质干细胞和椎间盘源性干细胞的增殖整体呈上升趋势，细胞活性增大，见图1A，B；在最初3 d处于慢速增殖期，逐渐转化为对数生长期(第4-6天)；但髓核间充质干细胞增殖速率要高于椎间盘源性干细胞。在椎间盘微环境条件下，髓核间充质干细胞和椎间盘源性干细胞的增殖整体呈下降趋势，细胞活性减弱；髓核间充质干细胞的活性较椎间盘源性干细胞下降明显，见图1C，D。

2.2  细胞表面抗原CD29阳性表达  流式细胞术分析椎间盘微环境条件下培养第1，3，6天时两种细胞中CD29的阳性表达，见表1，图2；第3天和第6天，椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞之间差异有显著性意义(P < 0.05)。

椎间盘退变性疾病是指因椎间盘组织在年龄、遗传或外界刺激等因素影响下，使椎间盘在组成、功能和结构上发生退变而引起的相关疾病，其发病率较高^[1]。以颈肩腰腿痛为主要表现的临床症候群，包括临床上常见的颈椎病、腰椎间盘突出症和椎间盘源性腰痛。在生理结构方面，椎间盘组织处于高机械强度、高渗透压、低营养、低氧的椎间盘微环境条件中，随着年龄的增加极易发生退变^[2-3]。椎间盘退变性疾病是25-55岁产生后背疼痛的主要原因之一，超过80%的人群有不同程度的下腰疼痛^[4]，其中40%的疼痛症状是由椎间盘退化导致^[5-8]。在退变的过程中，椎间盘细胞凋亡速率加快，椎间盘组织基质数量变少，纤维环结构改变，特别是胶原蛋白和蛋白多糖逐渐丢失，造成椎间盘微环境的破坏，又反过来加速了细胞的凋亡；随着椎间盘的退变，脊柱功能开始出现障碍，例如脊柱活动度的降低、稳定性的下降，从而产生一系列的椎间盘退化疾病，一旦发生退变，自然状态下往往是不可逆的。严重的椎间盘退化疾病患者不仅丧失劳动力，影响生活质量，同时也造成了巨大的社会负担^[9-10]。

经过多年研究，干细胞已在退变椎间盘的修复与再生功能方面显示出巨大潜能，并在大量体外实验、动物模型及临床试验中取得良好效果，但仍存在一些问题，主要是移植细胞在移植靶点的回漏以及较低的存活率，从而无法很好地发挥其作用，也对干细胞疗法的运用产生极大限制。

目前，临床上针对椎间盘退变性疾病的治疗方法主要是以缓解疼痛为主的保守治疗以及手术治疗，尚不能从根源上修复退变的椎间盘组织；细胞生物学治疗仍然主要处于基础研究阶段，其中干细胞移植治疗椎间盘退变性疾病的相关研究取得了重大进展，能够在一定程度上对退变椎间盘组织进行修复^[11-15]。如何保证椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞在椎间盘微环境条件下持续作用仍是目前亟待解决的问题。因此，该课题通过建立椎间盘微环境，观察椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞的增殖曲线和存活率，为组织工程寻找新的靶点提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  细胞学体外实验。

1.2  时间及地点  实验于2019年5至7月在新疆医科大学实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  SPF级雄性SD大鼠10只，6周龄，体质量(200±20) g，由新疆医科大学动物中心提供，许可证号：XYDZ-201903。

1.3.2  实验试剂和仪器  CD29-FITC、CD105-PE、CD73-FITC、CD90-APC(美国eBioscience公司)；培养基(DMEM/F12，1∶1，美国Gibco公司)；流式细胞仪(德国BD公司)，MTT试剂盒(中国Solarbio公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  SD大鼠椎间盘髓核间充质干细胞获取  无菌条件下用PBS清洗大鼠髓核组织2遍，齿镊及眼科剪仔细分离髓核组织，剪碎至0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小，置于0.02%的Ⅱ型胶原酶溶液中，体积分数为5%CO₂、37 ℃培养箱下消化4 h，无菌钢丝网(70 μm)过滤组织碎片；1 500 r/min离心5 min，弃上清液，收集细胞，加入含体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM完全培养基，置于体积分数为5%CO₂、37 ℃培养箱培养；静置培养2周待细胞贴壁后每3 d换液1次，待细胞融合达到80%-90%时通过高速流式细胞仪进行CD105、CD90等分选获取，然后进行传代培养，0.25%胰酶、0.02%EDTA消化3 min，按照5×10³/cm²重新接种于培养瓶进行换液、传代、铺板，取第4代细胞备用。

1.4.2  SD大鼠椎间盘源性干细胞获取  无菌环境下解剖分离大鼠L₃-L₆脊柱功能单位，解剖显微镜下利用眼科手术器械仔细去除附着于脊柱功能单位上的肌肉、韧带等组织，去除髓核、纤维环、软骨终板等结构，暴露软骨终板下椎体骨组织，PBS反复冲洗，利用手术刀片分离椎体骨组织，加入0.15%的Ⅱ型胶原酶溶液在37 ℃下消化6 h，经孔径70 μm滤网过滤，过滤液离心(1 500 r/min，5 min)；细胞重悬于含体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养液后接种于25 cm²培养瓶，置于细胞培养箱中培养；每3 d更换1次培养液，倒置显微镜下观察细胞生长情况；通过高速流式细胞仪进行CD73、CD90、CD105等分选获取，细胞达90%融合后，采用0.25%胰酶、0.02% EDTA进行消化，并按1∶3的比例进行传代，取第4代椎间盘源性干细胞备用。

1.4.3  椎间盘微环境建立  为建立椎间盘微环境特有的低糖、低pH值、低氧条件，对相应的细胞环境进行改建，具体方案为培养箱内氧体积分数为1%，pH值为6.5，低糖DMEM完全培养基。

1.4.4  MTT法检测细胞增殖情况  收集处于对数增长期的髓核间充质干细胞和椎间盘源性干细胞，以4×10³/孔接种于96孔板，每组3个复孔，分别培养于常规环境(37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱)和椎间盘微环境，在第1，2，3，4，5，6天检测细胞增殖活性。按照MTT试剂盒说明书操作步骤，每孔中加入20 μL MTT(5 g/L)，37 ℃孵育4 h，吸除培养孔内溶液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，37 ℃孵育30 min，充分摇匀后，采用酶标仪测量各时间点各孔在492 nm波长的吸光度值。

1.4.5  流式细胞检测细胞表面抗原表达  流式细胞术鉴定大鼠髓核间充质干细胞和椎间盘源性干细胞的表面标记物。第4代细胞用0.25%胰酶(不含EDTA)消化脱壁，PBS清洗2次，细胞计数，分装入流式上机管，1×10⁵/管，重悬于20 μL PBS，加入FITC标记抗大鼠抗体CD29-FITC，4 ℃孵育30 min，2 mL PBS清洗，上流式细胞仪检测，根据同型对照的荧光强度设定阴性细胞群，观察CD29阳性细胞表达率。

1.5  主要观察指标  ①髓核间充质干细胞和椎间盘源性干细胞的增殖情况；②髓核间充质干细胞和椎间盘源性干细胞的CD29表达率。

1.6  统计学分析  所有数据采用x(_)±s表示，利用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，采用LDS法进行两两比较，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

椎间盘退化严重影响了人们的日常生活，目前临床治疗的主要手段为保守治疗和手术治疗，前者无法达到根治的目标，后者同样存在无法完好保留椎间盘组织结构或出现手术相关并发症等不良结果的可能。椎间盘内细胞数量减少、生物学活性下降、细胞外基质含量和成分发生变化，是诱发椎间盘退变、导致椎间盘生物力学功能紊乱和丧失的主要原因之一。因此，增加椎间盘内细胞数量及提高其生物学活性将是治疗椎间盘退变的有效途径。目前，随着干细胞技术的不断深入研究，在椎间盘退化性疾病中应用越来越受到追捧^[16-18]。

椎间盘是人体最大的无脉管组织，椎间盘细胞主要通过扩散作用汲取邻近椎体血管内的氧气及营养物质^[19]。椎间盘内微环境与其他组织大为不同，主要体现在细胞量少、葡萄糖含量低、低氧、低pH值、缺乏营养物质等^[20-24]。当可供利用的营养物质不能满足椎间盘细胞的需求时，椎间盘细胞的活性及功能将会受到影响，从而导致椎间盘退化的发生。

成体干细胞在机体组织内以沉默状态和激活状态2种方式存在，且2种状态同时并存，在机体组织受到外源性损伤或内源性生理状态细胞发生更替时，对自身特异性组织中已经分化的终末细胞具有维持、再生和替代的能力^[25-26]。髓核间充质干细胞和椎间盘干细胞都属于成体干细胞，在椎间盘退行性疾病中发挥了维持、再生和替代作用。OROZCO等^[27]在一项针对10例伴有慢性腰痛的椎间盘退变的病例临床试验中，通过移植自体骨髓间充质干细胞来治疗椎间盘退行性疾病，12个月后全部患者背痛均得到有效缓解，脊柱功能得到明显改善，与其他手术方式如脊柱融合术或椎体成形术相比具有明显优势，MRI中T2加权显示移植区椎间盘组织含水量升高，但是椎间隙高度并未恢复。WATANABE等^[28]在人髓核细胞与间充质干细胞共培养研究中发现髓核细胞增殖及DNA复制合成能力明显增强，证实间充质干细胞能够提高髓核细胞生存能力。MIYAMOTO等^[29]发现将兔髓核细胞与人间充质干细胞共培养能改变髓核细胞基因表型，抑制降解酶及炎症因子的表达，从而减少细胞外基质降解，增加细胞外基质合成，维持椎间盘的微环境。虽然各项研究都已证实间充质干细胞对椎间盘退行性疾病有显著的治疗效果，但直接将间充质干细胞移植进入靶向椎间盘组织仍缺乏可靠、有效、安全的方法，主要问题是移植细胞在移植靶点的回漏以及移植后的较低存活率，从而无法很好地发挥其作用，也对干细胞疗法的运用产生极大限制^[30-33]。

NIKITINA等^[34]将兔骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增，3周后按1×10⁵将骨髓间充质干细胞注入退变椎间盘，并与未移植组进行对比，3，9周后MRI观察并未发现退变椎间盘修复表现，反而在注射节段椎间盘前外侧发现大量骨赘形成，周围包绕含标记干细胞的软骨，提示移植的间充质干细胞可能从纤维环渗漏并造成令人意想不到的麻烦。对于移植后间充质干细胞的状态进行进一步研究，发现大部分间充质干细胞滞留在移植区域，仅有少部分发生迁移，而且耗时很长，很难达到有效修复椎间盘退变的目的^[35]。另外，由于干细胞移植都必须经过实验室分离、培养、定向诱导分化甚至基因操作，存在来自干细胞内源性和操作过程中外源性的生物危害风险^[35-36]。

该实验通过体外建立椎间盘内特殊的椎间盘微环境，观察髓核间充质干细胞和椎间盘干细胞在椎间盘微环境条件下的增殖情况，结果发现髓核间充质干细胞增殖速率要高于椎间盘源性干细胞。在椎间盘微环境条件下，髓核间充质干细胞和椎间盘源性干细胞的增殖整体呈下降趋势，细胞活性减弱；髓核间充质干细胞活性较椎间盘源性干细胞下降明显。通过流式细胞仪检测发现，椎间盘源性干细胞在椎间盘微环境条件下培养第3，6天的CD29阳性表达量远远高于髓核间充质干细胞(P < 0.05)，说明椎间盘源性干细胞在椎间盘特殊微环境下具有比髓核间充质干细胞更好的生物活性。此次研究说明了椎间盘源性干细胞在椎间盘退行性疾病中的可行性，也可作为后期研究的方向。

结论：通过在椎间盘微环境条件下检测椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞的增殖情况，探索激活椎间盘微环境内椎间盘源性干细胞的方法，为组织工程寻找新的靶点提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

椎间盘微环境：在正常情况下，髓核组织缺乏血液供应，其营养代谢主要依赖渗透。由于代谢产物等影响，椎间盘组织内部的pH值为6.9-7.2，被认为是人体内最恶劣的环境之一，在这种条件下细胞正常代谢能力受到很大抑制，即使是特化的髓核细胞其代谢率也仅为正常的32%。当椎间盘退变后，葡萄糖及氧浓度进一步下降，乳酸堆积，pH值降低和代谢产物进行性增加。

髓核间充质干细胞：经过前期实验发现髓核间充质干细胞经自体移植于椎间盘局部，可以分化为纤维环细胞和髓核细胞，或者通过旁分泌细胞因子来促进组织细胞的再生，但髓核间充质干细胞在椎间盘微环境中存活量级并不清楚。椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞在椎间盘微环境下的生存变化差异性也还是未知。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

以往研究方向重点是间充质干细胞的治疗方法、治疗效果、细胞增殖和分化等方面；该研究重点关注在椎间盘微环境下椎间盘源性干细胞和髓核间充质干细胞的生存差异性，寻求针对椎间盘微环境下唤醒静态干细胞的方法，诱导其增殖分化，从而获得不需要种子细胞的椎间盘组织修复及其稳态维持。生物工程与再生疗法可以通过唤醒患者的椎间盘源性干细胞来治疗椎间盘退变疾病，从而使得椎间盘退变疾病获得自体修复再生能力，为椎间盘退变的低风险、高效率的治疗方式提供重要研究方向。对于椎间盘源性下腰痛的患者以及行椎间盘手术的患者，同样可使用生物治疗策略促进椎间盘组织修复再生，并防止相邻节段的椎间盘组织发生退变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程