鹿茸多肽对心肌干细胞凋亡和线粒体膜稳定性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.021

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (9): 1426-1431.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.021

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

鹿茸多肽对心肌干细胞凋亡和线粒体膜稳定性的影响

黄晓巍，徐岩，刘玥欣，李智萌，曲晓波

长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心，吉林省长春市 130117

出版日期:2017-03-28 发布日期:2017-03-31
通讯作者: 曲晓波，教授，长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心，吉林省长春市 130117
作者简介:黄晓巍，女，1972年生，吉林省长春市人，汉族，2004年长春中医学院毕业，硕士，主任药师，主要从事中药药理方面的研究。
基金资助:
吉林省卫生计生科研计划项目(2015Z062)

Effect of pilose antler polypeptides on apoptosis and membrane stability of mitochondria in cardiac stem cells

Huang Xiao-wei, Xu Yan, Liu Yue-xin, Li Zhi-meng, Qu Xiao-bo

Center for the Study of Chinese Medicine and Bio-engineering, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, Jilin Province, China

Online:2017-03-28 Published:2017-03-31
Contact: Qu Xiao-bo, Professor, Center for the Study of Chinese Medicine and Bio-engineering, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, Jilin Province, China
About author:Huang Xiao-wei, Master, Chief pharmacist, Center for the Study of Chinese Medicine and Bio-engineering, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, Jilin Province, China
Supported by:
the Scientific Research Plan for the Health and Family Plan of Jilin Province, No. 2015Z062

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
5-氮胞苷：是一种胞嘧啶核苷类似物，同时也是一种经典的干细胞诱导剂，多见于骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞等向心肌细胞分化实验。但5-氮胞苷作为一种化学诱导剂，具有一定的毒性，长期使用可能诱导细胞变异或死亡。
鹿茸多肽：是从新鲜鹿茸中提取的一类多肽类物质，主要含有缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸和甘氨酸等，对多种组织损伤修复有明显的促进作用。研究表明，鹿茸多肽可以诱导心肌干细胞分化为心肌细胞，且未见毒性报道。

摘要

背景：心肌干细胞在体外经鹿茸多肽诱导后可以分化为心肌细胞这一研究成果为其治疗心肌损伤提供了新思路。

目的：观察鹿茸多肽对心肌干细胞凋亡和线粒体膜稳定性的影响，探讨其作用机制。

方法：选取出生2 d的雄性Wistar大鼠，提取心肌干细胞，以培养皿作为实验单位，共计分为以下4组(n=12)：鹿茸多肽组：使用鹿茸多肽(质量浓度为800 mg/L)进行诱导；联合组：使用5-氮胞苷(浓度为3 μmol/L)和鹿茸多肽(质量浓度为800 mg/L)联合诱导；5-氮胞苷组：使用5-氮胞苷(浓度为3 μmol/L)进行诱导；空白对照组：加入等量缓冲液进行诱导。诱导48 h后流式细胞仪检测心肌干细胞的凋亡率，免疫荧光检测心肌干细胞的线粒体膜电位，Western blotting方法检测心肌干细胞Nkx 2.5、GATA4、ATF-2、MEF-2C的表达水平。

结果与结论：①细胞培养2周后，出现大量的小、圆、亮细胞，心肌干细胞集落形成；②与空白对照组比较，5-氮胞苷组心肌干细胞凋亡率明显升高(P < 0.05)，线粒体膜电位明显降低(P < 0.05)；与5-氮胞苷组比较，鹿茸多肽组、联合组心肌干细胞凋亡率明显降低(P < 0.05，P < 0.01)，线粒体膜电位明显升高(P < 0.05，P < 0.01)；③与5-氮胞苷组比较，鹿茸多肽组及联合组Nkx2.5的表达水平明显升高(P < 0.05)，各组GATA4、ATF-2表达水平不高，且差异无显著性意义(P > 0.05)，MEF-2C表达在中等水平，各组间差异无显著性意义(P > 0.05)；④结果表明，鹿茸多肽可降低心肌干细胞凋亡率，提高线粒体膜稳定性，其作用机制在一定程度上与提高Nkx 2.5表达有关，是否与GATA4、ATF-2、MEF-2C有关尚待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-9678-0704(黄晓巍)

关键词: 干细胞, 分化, 鹿茸多肽, 心肌干细胞, 线粒体, 凋亡率, 膜稳定性

Abstract:

BACKGROUND: Cardiac stem cells can differentiate into cardiomyocytes in vitro under induction of pilose antler polypeptides, which provides a new therapeutic idea for myocardial injury.

OBJECTIVE: To explore the effect of pilose antler polypeptides on the apoptosis rate and membrane stability of mitochondria in cardiac stem cells.

METHODS: We chose healthy male Wistar rats born 2 days to extract cardiac stem cells. The culture dish was used as the experimental unit, and extracted cells were divided into the following four groups (n=12). Blank control group: The same amount of buffer was added for induction; 5-azacytidine group: induced with 5-azacytidine (3 μmol/L); pilose antler polypeptides group: induced with pilose antler polypeptides (800 mg/L); combined group: induced with pilose antler polypeptides (800 mg/L) and 5-azacytidine (3 μmol/L). After 48 hours induction, apoptosis rate of cardiac stem cells in each group was detected with flow cytometry. The membrane potential of mitochondria in cardiac stem cells was detected with immunofluorescence. The expression level of Nkx 2.5, GATA4, ATF-2, and MEF-2C in cardiac stem cells was detected using western blot assay.

RESULTS AND CONCLUSION: There were small, round and bright cells after 2 weeks culture, and cell colonies of cardiac stem cells formed. The apoptosis rate of cardiac stem cells in the 5-azacytidine group increased significantly (P < 0.05) and its membrane potential decreased significantly compared with the blank control group (P < 0.05). The apoptosis rate of cardiac stem cells in the pilose antler polypeptides group and combined group decreased significantly compared with the 5-azacytidine group (P < 0.05, P < 0.01), and their membrane potential increased significantly (P < 0.05, P < 0.01). The results of western blot showed that the expression level of Nkx2.5 increased significantly in the pilose antler polypeptides group and combined group compared with the 5-azacytidine group (P < 0.05), while the expression levels of GATA4 and ATF-2 in each group were low and there were no significant differences among groups (P > 0.05). The expression level of MEF-2C in each group was at a middle level, and there were no significant differences among groups (P > 0.05). To conclude, our experimental findings indicate that pilose antler polypeptides could decrease the apoptosis rate and improve membrane stability of mitochondria in cardiac stem cells. The mechanism may be related to the increased expression of Nkx 2.5, but whether the mechanism is related to GATA4, ATF-2 and MEF-2C needs to be further studied.

Key words: Deer, Antlers, Myocytes, Cardiac, Mitochondria, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

黄晓巍，徐岩，刘玥欣，李智萌，曲晓波. 鹿茸多肽对心肌干细胞凋亡和线粒体膜稳定性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(9): 1426-1431.

Huang Xiao-wei, Xu Yan, Liu Yue-xin, Li Zhi-meng, Qu Xiao-bo. Effect of pilose antler polypeptides on apoptosis and membrane stability of mitochondria in cardiac stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(9): 1426-1431.

图/表（结果） 7

2.1 心肌干细胞的形态 首先将大鼠的心肌组织块接种到细胞培养瓶中进行原位培养。培养3 d，相差显微镜下可见有纤维状的细胞从组织块周围爬出，数量逐渐增多(图1)；培养7-9 d，可见成纤维细胞增多形成了成纤维细胞滋养层，并能看到形状小，大约圆形，明亮的细胞附着在滋养层上(图2)；培养2周以后，会有大量的小、圆、亮细胞出现，表现出干细胞集落的形态(图3)。

2.2 心肌干细胞纯度 原代细胞sca-1阳性细胞较少、CD34阳性细胞相对较多，随着细胞传代次数增加，sca-1阳性细胞比例明显增高；到第3代时，大多数细胞均为sca-1阳性，而CD34阳性细胞和杂细胞比例约3.9%，说明细胞经过4次传代后得到纯化的心肌干细胞，见表1。

2.3 心肌干细胞凋亡率 与5-氮胞苷组比较，空白对照组、鹿茸多肽组、联合组心肌干细胞凋亡率明显降低(P < 0.05，P < 0.01)，见表2，图4。

2.4 心肌干细胞线粒体膜电位 与5-氮胞苷组比较，空白对照组、鹿茸多肽组、联合组心肌干细胞线粒体膜电位明显升高(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，见表3。

2.5 免疫印迹测定结果 空白对照组、5-氮胞苷组、鹿茸多肽组以及联合组的β-actin表达水平均保持在较高水平；与5-氮胞苷组对比，鹿茸多肽组及联合组Nkx2.5的表达水平明显升高(P < 0.05)；各组GATA4、ATF-2表达水平不高，且差异无显著性意义(P > 0.05)；MEF-2C表达在中等水平，但各组间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5，表4。

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引言

近年来，受环境变化、人口老龄化、生活习惯改变等因素的影响，心血管疾病的发病率始终高居第一并仍有不断攀升的趋势^[1-4]。干细胞是存在于体内的一类具有增殖和分化潜能的细胞，通过自我更新复制能够产生高度分化的功能细胞。心肌组织中存在成体心肌干细胞，是目前最有希望修复缺血性心肌损伤的干细胞类型，可以向心肌细胞、内皮细胞及平滑肌细胞分化^[5]，在心肌损伤时，心肌干细胞的再生潜能可被激活和启动，并迅速向损伤处迁移，继而分化为成熟的心肌细胞，通过靶向修复增加心肌细胞的数量，完成心肌组织重构，对于心功能恢复有积极的意义，许多药物对这一过程有促进作用。鹿茸是传统的名贵中药，性甘、咸、温，归肝、肾经，禀纯阳之质，含生发之气，具有壮元阳，益精血，温通心阳，滋补肾精之功效。研究表明，鹿茸温阳益气的作用是其消除心肌疲劳和强心作用的药理学基础^[6-7]，也是临床上治疗冠心病标本兼治，祛寒、豁痰、活血等治法的基础^[8]。鹿茸多肽是鹿茸主要药效学物质，由缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸和甘氨酸等大量氨基酸组成。研究表明，鹿茸多肽具有促进骨髓间质细胞分化及软骨细胞、表皮细胞、成纤维细胞增殖等作用，可明显加速骨组织、周围神经组织再生及创面愈合。鹿茸多肽是从鹿茸中分离纯化出的多肽生长因子，由68个氨基酸组成，相对分子质量为7 200，外观呈黄白色粉末，溶于水。既往研究表明，鹿茸多肽主要作用有：①促进DNA合成和细胞分化，其细胞增殖作用与鹿茸多肽浓度之间有明显的量效关系；②抑制各种急、慢性炎症过程；③兴奋肾上腺皮质；④抑制细胞凋亡。鹿茸多肽具有比较强的生物活性，能明显促进神经纤维、骨组织、心肌修复。鹿茸多肽可能是通过诱导心肌干细胞定向分化成心肌细胞进而修复受损的心肌^[9-11]。线粒体是人体重要的生产能量的细胞器，是人体细胞的主要能量来源。心肌损伤或衰老常常伴随着线粒体功能异常。近年来，线粒体膜电位作为衡量线粒体功能的一个重要指标已被广泛应用于该领域的研究^[12-15]。为此，实验观察鹿茸多肽对心肌干细胞凋亡和线粒体膜稳定性的影响，并探讨其作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 对比观察实验。

1.2 时间及地点 于2016年3至10月在长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心中药药理实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 动物 清洁级新生2 d Wistar大鼠10只，雄性，体质量6-8 g，由吉林大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(吉)2013-0001。

1.3.2 药品及试剂 鹿茸多肽(长春中医药大学药学院自制，批号：20150417，纯度：>97%)；5-氮胞苷(中国上海阿拉丁试剂有限公司，批号：B1412007，纯度：>98%)；胰蛋白酶(美国Sigma公司，批号：T0303)；胶原酶(索莱宝，批号：C8140)；V-FITC(碧云天，批号：C1063)；PI(优宁维，批号：BMS500)；RIPA裂解液(碧云天，批号：P0013B)；PMSF(碧云天，批号：ST506)；SDS-PAGE上样缓冲液(碧云天，批号：P0015L)；脱脂奶粉(BD，货号：232100)；羊抗鼠IgG抗体(碧云天，批号：A0208)；抗大鼠CD34抗体、sca-1抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号：bsm-10820M、bs-3752R)；Nkx 2.5、GATA4、ATF-2、MEF-2C抗体(Biolegend公司，批号：bs-2054R，bs-1778R，bs-0518r，bs-0672r)；增强化学发光(ECL)试剂(美国Biosharp公司，批号：BL520A)；JC-1(碧云天，批号：C2005)；DMEM(GIBCO，批号：12491-015)；胎牛血清(GIBCO，1009-141)；L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇(北京化工厂)；CEM培养基(自制，DMEM 180 mL、胎牛血清20 mL、L-谷氨酰胺2.58 mg、β-巯基乙醇1.4 µL)。

1.3.3 仪器 MCO-17型CO₂孵箱(日本三洋公司)；倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；Biofuge primp R低温离心机(德国Heraeus公司)；VDS凝胶成像系统(瑞典Pharmacia公司)；DT5-3型低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)；SYNGENE BIO IMAGING SYSTEM、BD FACSCanto II流式细胞仪(美国BD Biosciences)。

1.4 方法

1.4.1 心肌干细胞的分离提取 ①取Wistar大鼠心脏，用PBS冲洗干净，去除血细胞。将心脏组织剪切为约1 mm³的块状物，转移到培养瓶中反复吹打。去除上清液，继续用PBS清洗吹打2次；②去除PBS，加入胰蛋白酶(含0.20% EDTA)消化5 min。吸弃上清液，加入1 mL 0.1%胶原酶消化5 min。重复上述步骤进行3次；③800 r/min离心2 min，去除上清液，加入2 mL CEM培养基重悬，终止对心肌组织块的消化；④用CEM培养基清洗2次心肌组织块，重悬组织块，将组织块均匀铺入25 cm²细胞培养瓶；⑤加入CEM培养液1 mL，在37 ℃、体积分数为5% CO₂孵箱中孵育12 h，相差显微镜下观察细胞的生长和贴壁状态；⑥采用流式细胞术检测心肌干细胞特异性表面标志物sca-1和CD34的表达，鉴定心肌干细胞纯度。

1.4.2 心肌干细胞的传代培养 待细胞长满培养瓶底，弃培养液，加入0.05%胰酶消化细胞，加入CEM培养液终止消化，离心，用CEM培养液制成细胞悬液，接种到2个培养瓶内，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱中继续培养，每两三天换1次培养液，观察细胞的生长情况和形态变化。

1.4.3 诱导分化分组 将心肌干细胞分为以下4组诱导其分化。鹿茸多肽组：使用鹿茸多肽(质量浓度为800 mg/L)进行诱导；联合组：使用5-氮胞苷(浓度为3 μmol/L)和鹿茸多肽(质量浓度为800 mg/L)联合诱导；5-氮胞苷组：使用5-氮胞苷(浓度为3 μmol/L)进行诱导；空白对照组：加入等量缓冲液进行诱导。

1.4.4 心肌干细胞的药物诱导分化 ①将第3代心肌干细胞稀释成10瓶，形成单细胞，通过血球计数板对细胞计数，细胞浓度为1×10⁸ L^-¹；②鹿茸多肽组：待80%细胞贴壁后，向瓶中加入含800 mg/L鹿茸多肽的DMEM细胞培养液，37 ℃、体积分数为5% CO₂恒温箱中培养48 h；③联合组：待80%细胞贴壁后，向瓶中加入含800 mg/L鹿茸多肽和3 μmol/L 5-氮胞苷的DMEM细胞培养液，37 ℃、体积分数为5% CO₂恒温箱中培养48 h；④5-氮胞苷组：待80%细胞贴壁后，向瓶中加入含3 μmol/L 5-氮胞苷的DMEM细胞培养液，37 ℃、体积分数为5% CO₂恒温箱中培养48 h；⑤空白对照组：待80%细胞贴壁后，向瓶中加入DMEM细胞培养液，37 ℃、体积分数为5% CO₂恒温箱中培养48 h。

1.5 主要观察指标

1.5.1 通过流式细胞仪检测心肌干细胞凋亡率 将心肌干细胞用1.5 mL CaCl₂进行洗涤，稀释细胞浓度至1×10⁸ L^-¹，在细胞中加入5 µL V-FITC和10 µL PI，避光培养15 min，流式细胞仪检测。通过测定FITC和PI染色的细胞数量来确定心肌干细胞凋亡率。

1.5.2 通过免疫荧光检测心肌干细胞的线粒体膜电位 利用荧光探针经过JC-1荧光染色标记心肌干细胞内线粒体，流式细胞仪测定线粒体内JC-1荧光染色强度变化，JC-1在线粒体内形成的聚合物主要表现为红色荧光染色。当线粒体膜电位去极化发生异常改变时线粒体以绿色荧光染色为主。通过对比染色呈现红色荧光线粒体与绿色荧光线粒体的荧光强度来反映心肌干细胞中线粒体的膜电位，计算线粒体膜电位下降细胞的比例。

1.5.3 Western blotting 方法观察心肌干细胞Nkx 2.5、GATA4、ATF-2、MEF-2C的表达水平 各组细胞诱导后更换新鲜的完全培养基继续培养，每3 d换液1次，观察细胞形态变化，连续4周，收集细胞进行目的蛋白测定。取上述步骤中已纯化的大鼠心肌干细胞，加入PMSF和RIPA混合裂解液，待细胞进行充分裂解后进行12 000×g离心5 min，收集上清，BCA法测定蛋白浓度；提取50 μg总蛋白，加入2 μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水中煮8 min后进行凝胶电泳。电泳完毕后将蛋白从胶转移至PVDF膜上，加入5%脱脂奶粉室温封闭，加入相应一抗(稀释率为1︰500)，4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(稀释率为1︰1 000)，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次，每次10 min，ECL显色，胶片曝光检测蛋白表达。

1.6 统计学分析 数据均以x(_)±s表示，用统计软件包SPSS 20.0进行方差分析，P < 0.05或者P < 0.01为差异有显著性意义。

讨论

鹿茸多肽是从新鲜鹿茸中提取的一类多肽类物质，主要由缬氨酸、赖氨酸、丙氨酸和甘氨酸等68种氨基酸组成，具有促进创伤愈合以及修复神经损伤的作用。鹿茸多肽具有比较强的生物活性，能明显促进神经纤维、骨组织、心肌修复^[16-18]。鹿茸多肽可能是通过诱导心肌干细胞定向分化成心肌细胞进而修复受损的心肌^[19-20]。研究发现鹿茸提取物可使心肌线粒体中Bcl-2表达量增加，Bax表达量减少，Bcl-2/Bax比值升高，证实鹿茸提取物对心肌细胞凋亡蛋白表达有调节作用，并可通过抑制心肌细胞凋亡的途径减轻心肌损伤^[21-22]。

实验将体外分离培养、纯化的心肌干细胞分为以下4组诱导其分化。鹿茸多肽组：使用鹿茸多肽(质量浓度为800 mg/L)进行诱导；联合组：使用5-氮胞苷(浓度为 3 μmol/L)和鹿茸多肽(质量浓度为800 mg/L)联合诱导；5-氮胞苷组：使用5-氮胞苷(浓度为3 μmol/L)进行诱导；空白对照组：加入等量缓冲液进行诱导。结果显示与5-氮胞苷组比较，空白对照组、鹿茸多肽组、联合组心肌干细胞凋亡率明显降低(P < 0.05，P < 0.01)，心肌干细胞线粒体膜电位明显升高(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，这一实验结果说明鹿茸多肽可以显著降低心肌干细胞凋亡率，提升线粒体膜稳定性。线粒体是细胞“呼吸”和能量转换的工厂，细胞凋亡往往伴随着线粒体的损伤，线粒体损伤的主要表现包括外膜间隙蛋白释放、膜电位降低、内外膜成分改变等，细胞膜一旦破裂，便会导致细胞溶解^[23-26]。增强心肌细胞膜的稳定性有助于提高心肌功能，治疗各类心脏疾病。细胞内转录因子(Nkx2.5，GATA4，ATF2，MEF2)启动是心肌细胞分化机制中的最重要环节，心肌转录因子的表达是心肌干细胞分化发育为心肌细胞的先决条件^[27-34]。刘玲珑等^[31]研究表明骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的过程中，细胞形态变化呈现明显规律：由单个大核，胞浆饱满，折光性好的纺锤形，逐渐演变为短杆状，形成突起并连接成网状结构，细胞端相接呈“竹节样”改变，最后形成肌管样结构。诱导前细胞不表达Nkx2.5，诱导过程中随着细胞形态的不断变化Nkx2.5持续表达并逐渐增强。说明间充质干细胞分化为心肌细胞的过程中，Nkx2.5表达相对量的变化与细胞的形态变化可能有一定的相关。心肌特异性核心启动子活化，表现为MLC2v和ANP等终末心肌分化基因的表达，转录调节因子GATA4对Nkx2.5具有正性协同作用，参与调控α-MHC，ANP和MLC等多种终末心肌分化基因的表达。目前研究发现的心脏早期转录因子最关键的是Nkx2.5、GATA4、TBX5^[35]。

综上所述，鹿茸多肽可明显升高线粒体细胞膜电位，增强细胞膜稳定性，提高心肌干细胞存活率，其作用机制在一定程度上与提高转录因子Nkx 2.5表达有关，相关机制有待进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

鹿茸多肽对心肌干细胞凋亡和线粒体膜稳定性的影响

Effect of pilose antler polypeptides on apoptosis and membrane stability of mitochondria in cardiac stem cells

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