人胎盘羊膜上皮细胞的分离鉴定及多向诱导分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.020

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
人羊膜来源干细胞：包括人羊膜上皮细胞、人羊膜间充质干细胞，表达多种干细胞标记物，具有较全面的多分化潜能，并且因具有“无致瘤性、免疫原性低、安全性高”等诸多胚胎干细胞和成体干细胞所不具备的优势和特点。
人羊膜上皮细胞：具有表达多种胚胎干细胞标记物的特点和较全面的多向分化潜能，随后Miki等研究证实了其向3胚层分化的潜能，除表达胚胎干细胞表面抗原SSSEA-3和SSSEA-4，肿瘤抗性基因TRA 1-60和TRA 1-81之外，近来发现人羊膜上皮细胞还表达多潜能干细胞的转录因子，例如Oct-4、Sox-2、Nanog和REX-1等及其他抗原，不表达CD34、SSSEA-1、CD133，弱表达c-kit(CD117)和CC趋化因子受体(CRR4)。

摘要
背景：人羊膜上皮细胞来源稳定，正逐渐成为广受关注的再生医学种子细胞来源。
目的：建立人羊膜上皮细胞体外分离培养、成脂、成软骨、成骨诱导分化的方法。
方法：通过胰蛋白酶消化法从人胎盘羊膜中分离羊膜上皮细胞，进行体外培养与鉴定，观察培养12 d内的细胞生长曲线。取P1代羊膜上皮细胞，分别进行成脂、成软骨、成骨诱导，以常规培养细胞为对照，诱导16 d后，分别进行油红O染色、Masson染色及碱性磷酸酶染色，同时采用荧光定量PCR检测诱导过程中成脂转录因子、Ⅱ型胶原蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA表达变化。
结果与结论：①从人羊膜中分离出的羊膜上皮细胞，免疫荧光检测表达上皮细胞标记物CK19；②P1代细胞具有较强的分裂增殖能力，P2细胞与P1相比增殖能力略有下降，P3细胞增殖能力最差；③羊膜上皮细胞经成脂、成软骨、成骨诱导后，油红O染色有红色脂滴，Masson染色有亮蓝色软骨基质，碱性磷酸酶染色有红褐色钙结节；随着诱导时间的延长，成脂转录因子、Ⅱ型胶原蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶表达量升高；④结果表明，采用酶消化法可从人羊膜中分离得到羊膜上皮细胞，羊膜上皮细胞可向脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0001-9713-3915(李萍)

关键词: 干细胞, 分化, 羊膜上皮细胞, 诱导分化, 成脂细胞, 成骨细胞, 成软骨细胞

Abstract:

BACKGROUND: Human placenta is a stable source for human amniotic epithelial cells, which is becoming a cell source in the regenerative medicine that attracts widespread attentions.
OBJECTIVE: To establish the method of isolation, culture, and adipogenic, chondric and osteogenic differentiation of human amniotic epithelial cells.
METHODS: Trypsin-EDTA digestion was used to isolate human amniotic epithelial cells from human amnion tissue, which were then cultured and identified in vitro. The growth curve of the cells was observed in 12 days. Passage 1 human amniotic epithelial cells were induced to differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteoblasts, and conventional cultured cells were used as controls. After 16 days induction, oil red O, Masson and alkaline phosphates staining methods were carried out, and adipogenic transcription factor, type II collagen, osteopontin, alkaline phosphatase mRNA expressions were detected using real-time fluorescene quantitative PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Human amniotic epithelial cells were successfully obtained from human amnion tissue. Immunofluorescence data showed the expression of epithelial cell surface marker CK19. Passage 1 cells had a strong ability to divide and proliferate. Compared with passage 1 ones, passage 2 cells showed a slight decrease in proliferation ability, and the proliferation ability of passage 3 cells was the worst. Red lipid droplets, brilliant blue cartilage matrix and reddish brown calcium nodes were detected by oil red O, Masson and alkaline phosphates staining after adipogenic, chondrogenic and osteogenic differentiation, respectively. With the time prolonged, the expressions of adipogenic transcription factor, type II collagen, osteopontin and alkaline phosphatase mRNA were increased. These results demonstrated that human amniotic epithelial cells could be isolated from human amniotic membrane by enzyme digestion method, and these amniotic epithelial cells could be induced to differentiate into differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteoblasts.

Key words: Amnion, Epithelial Cells, Adipogenesis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李萍，王久存，陆瑶，许惠利. 人胎盘羊膜上皮细胞的分离鉴定及多向诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(9): 1420-1425.

Li Ping, Wang Jiu-cun, Lu Yao, Xu Hui-li . Human amniotic epithelial cells: isolation, identification and multi-directional differentiation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(9): 1420-1425.

图/表（结果） 1

2.1 人羊膜上皮细胞免疫荧光鉴定 在荧光显微镜 633 nm激发光条件下，人羊膜上皮细胞经CK19染色后呈阳性，结果显示细胞具有上皮细胞特性(图1)。

2.2 人羊膜上皮细胞的细胞周期及生长曲线 流式细胞仪对细胞周期分析结果，见表1，使用R语言进行单因素方差统计，差异有显著性意义(Pr < 0.05)。从中可以看出，随着传代次数的增加，细胞处于静止期(G₀/G₁期)的比例有所下降，细胞处于增殖期(G₂/M+S期)的比例有所上升，提示随着细胞传代次数的增加，羊膜上皮细胞的分化潜能将下降。

生长曲线显示，P1代细胞具有较强的分裂增殖能力，约在第2天进入明显的对数生长期，在第6天进入平台期；P2代细胞与P1代相比增殖能力略有下降；P3代细胞增殖能力最差，且细胞无明显的对数生长期，见图2。

2.3 人羊膜上皮细胞向成脂、成骨、成软骨细胞诱导分化鉴定 人羊膜上皮细胞能成功诱导成为成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞(图3)。成脂诱导油红O染色后，实验组胞浆中大量的圆形光亮红色脂滴被洗脱出，阴性对照组胞浆中有少量红色脂滴形成；成骨诱导碱性磷酸酶染色后，实验组胞浆中大量红棕色沉淀被洗脱出，阴性对照组胞浆中无红棕色颗沉淀物；成软骨诱导Masson染色后，实验组胞浆中有亮蓝色圆形物被洗脱出，阴性对照组胞浆中无亮蓝色圆形物质；以上结果证明人羊膜上皮细胞具有向成脂、成骨、成软骨细胞诱导分化潜能。

2.4 人羊膜上皮细胞向成脂、成骨、成软骨细胞诱导过程中目的基因的表达 人羊膜上皮细胞成脂、成软骨、成骨诱导8，12 d后，荧光定量PCR检测发现成脂转录因子、Ⅱ型胶原蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶的mRNA表达均显著上升，见图4。

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引言

人羊膜来源干细胞表达多种干细胞标记物^[1-5]，具有较全面的多分化潜能，并且因具有“无致瘤性、免疫原性低、安全性高”等诸多胚胎干细胞和成体干细胞所不具备的优势和特点^[6-9]，能向3个胚层来源的不同组织细胞分化，如神经细胞^[1,10-12]、心肌细胞^[10]、肝细胞^[13-14]、胰岛细胞^[13-15]、皮肤和毛囊细胞等^[16]。在眼科领域，He等^[17]将人角膜缘上皮干细胞和人羊膜上皮细胞共培养后，成功移植到新西兰白兔角膜缘碱烧伤模型的角膜表面。Wei等^[18]研究证实，人羊膜上皮细胞移植入糖尿病小鼠脾脏内，使其血糖水平在数月内恢复了正常。因此，人羊膜上皮细胞作为组织工程的种子细胞，在细胞治疗及干细胞增殖分化研究模式等有着广阔的应用前景。

在临床移植上，常使用自体成骨或同种异体骨进行移植，但骨移植有来源有限、免疫排斥反应等诸多缺陷。成骨中有骨桥蛋白，软骨中有Ⅱ型胶原蛋白。骨桥蛋白在多种组织均可表达，如骨、肾、肺、肝、膀胱等。大量研究表明，骨桥蛋白能增强巨噬细胞和T细胞向炎症部位趋化、黏附及移行，参与组织修复及炎症过程^[19-20]。Ⅱ型胶原蛋白能使机体产生免疫耐受，对类风湿关节炎有较好的防治效果，可有效抑制T细胞因子引起的关节组织内部对特异性隐蔽抗原的自身免疫反应^[21-22]。从脂肪组织中分离高纯度且处于同一时期的脂肪细胞也有一定难度^[23]。成脂转录因子处于脂肪细胞分化转录调控网络的中心位置^[24]，在脂肪细胞分化早期起到不可或缺的作用，活化的成脂转录因子不仅能够促进脂肪细胞分化，增加脂肪细胞的数量，也可使参与脂肪生成、转运、储存、氧化等过程的基因表达量升高^[25]。若能从人羊膜中获得羊膜上皮细胞，通过体外诱导，检测人羊膜上皮细胞在诱导过程中目的基因的表达变化及趋势，探讨不同诱导时期人羊膜上皮细胞在成脂、成骨、成软骨细胞和类胚胎干细胞性质方面所体现出来的异质性，可为骨细胞移植及研究脂肪代谢疾病的细胞治疗提供新手段。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年5月至2016年2月在上海市干细胞技术限公司实验室完成。

1.3 材料 人足月胎盘羊膜由上海市新华医院提供，供者对实验知情同意情况，符合伦理要求。产妇产前检查排除感染梅毒、艾滋病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒，标本采集后保存于4 ℃冰箱内并在24 h内完成实验。

主要试剂及仪器：成骨诱导试剂盒、成软骨诱导试剂盒、成脂诱导试剂盒、低糖DMEM培养基、胰蛋白酶(含EDTA)、胎牛血清、PBS(Gibco)；Masson染液试剂盒、碱性磷酸酶染液试剂盒、油红O染液试剂盒(南京建成科技有限公司)；抗生素(青链霉素)(PAN Biotech)；TaqMan^® Gene Expression Cells-to-CT^TM Kit、TaqMan^® Gene Expression assays(Ambion)；100 mm培养皿、6孔板、8连管(Corning公司)；倒置显微镜(Nikon，日本)；荧光倒置相差显微镜(Olympus，日本)；二氧化碳培养箱、台式离心机(Thermo，美国)；生物安全柜(苏州净化)；移液器(Gilson)；Roche Light Cycler^® 96(罗氏公司)；流式细胞仪(BD公司)；PI试剂、RNA酶(Sigma公司)。

1.4 实验方法

羊膜上皮细胞的分离：紫外消毒生物安全柜，准备无菌手术镊、手术剪，取出无菌磁盘，置于生物安全柜的台面上；使用无菌手术镊、手术剪剥取胎盘表面的羊膜。从羊膜中分离羊膜上皮细胞的方法和步骤：①将羊膜置于直径100 mm培养皿，培养皿中装有1/2体积的含有抗生素的(1%青链霉素)PBS；②用手术镊夹持羊膜进行漂洗，重复漂洗二三遍，去除血细胞；③转移羊膜至50 mL离心管中；④向离心管中加入0.1%胰蛋白酶(组织体积：胰蛋白酶体积=1∶2)，置于摇床内37 ℃、250 r/min振荡，10 min后加入低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)终止消化；⑤用手术镊取出羊膜，转移至50 mL离心管中，向离心管中加入0.1%胰蛋白酶(组织体积：胰蛋白酶体积=1∶2)，置于摇床内37 ℃、250 r/min振荡，15 min后加入低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)终止消化；⑥弃组织，收集消化液，加PBS至50 mL，2 500 r/min离心5 min；⑦弃上清，加入2 mL完全培养基，取10 μL细胞悬液用于细胞计数；⑧按照4×10⁶/皿接种若干个Φ100 mm培养皿，37 ℃体积分数5%CO₂培养；⑨48 h换液，以后每2 d换液1次，直至细胞可以进行传代。

羊膜上皮细胞的传代培养：当细胞生长至90%时，每个Φ100 mm培养皿加入2 mL 0.25%胰蛋白酶进行消化传代。消化2 min，加低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)终止消化，将细胞悬液转移至50 mL离心管中，2 000 r/min离心5 min，弃上清，计数，按照4×10⁶/皿接种(Φ100 mm培养皿)，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养。

免疫荧光鉴定羊膜上皮细胞：①取出6孔板，将涂有多聚赖氨酸的载玻片置于孔内；②将P1代人羊膜上皮细胞以5×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于6孔板内；③细胞爬片后按以下步骤进行染色：PBS漂洗3次，细胞经40 g/L多聚甲醛溶液室温固定15 min；PBS 漂洗3次，正常体积分数10%羊血清封闭1 h；加入CK19(1∶100)，4 ℃孵育48 h；PBS漂洗3次，加入羊抗人IgG-FITC (1∶100)，室温孵育2 h；漂洗、晾干、封固后荧光显微镜下观察。

细胞周期及生长曲线的测定：取P1代细胞，经含0.25%胰蛋白酶消化，以1×10⁵的密度接种于6孔板，每板接种4孔，每孔1 mL，共计6板，每2 d取1板计数，连续培养12 d，每3 d换一次低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)；以培养时间为横坐标，细胞总数为纵坐标绘制细胞生长曲线。将1 mL体积分数为75%的冰冻乙醇分别加入离心好的P0、P1、P2、P3代细胞内重悬均匀，放置于4 ℃过夜，次日加入RNase，在37 ℃下孵育30 min，再加入3 mg/L PI，在4 ℃下放置30 min，送流式细胞仪测定细胞周期。

体外向脂肪细胞诱导分化：取P1代羊膜上皮细胞，按照6×10⁴/孔接种于6孔板，设1个阴性对照孔、2个实验孔。阴性对照组用低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)培养，每4 d换液一次；实验用低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)培养，24 h后换成成脂诱导试剂；每4 d换一次成脂诱导试剂，成脂诱导16 d进行油红O染色。

成脂诱导荧光定量PCR检测：取成脂诱导0，4，8，12，16 d的细胞，使用TaqMan^® Gene Expression Cells-to-CT^TMKit反转录cDNA链。根据实验要求，使用TaqMan^® Gene Expression assays中的成脂转录因子为引物，荧光定量PCR检测成脂转录因子mRNA表达量。并以β-actin为内参，实验重复3次。PCR结束后收集Ct值，实验使用2^-^??Ct法对数据进行分析。

体外向成骨细胞诱导分化：取P1代羊膜上皮细胞，按照6×10⁴/孔接种6孔板，1个阴性对照孔，2个实验孔。阴性对照组用低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)培养，每4 d换液一次；实验组用低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)培养，24 h后换成成脂诱导试剂，每4 d换一次成骨诱导试剂。诱导16 d进行碱性磷酸酶染色。

成骨诱导荧光定量PCR检测：取成骨诱导0，4，8，12，16 d的细胞，使用TaqMan^® Gene Expression Cells-to- CT^TM Kit反转录cDNA链。根据实验要求，使用TaqMan® Gene Expression assays中的骨桥蛋白、碱性磷酸酶为引物，荧光定量PCR检测骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA表达量。并以β-actin为内参，实验重复3次。PCR结束后收集Ct值，实验使用2^-^??Ct法对数据进行分析。

体外向成软骨细胞诱导分化：取P1代羊膜上皮细胞，按照6×10⁴/孔接种6孔板，1个阴性对照孔，2个实验孔。阴性对照组用低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)培养，每4 d换液一次；实验组用低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)培养，24 h后换成成脂诱导试剂，每4 d换一次成软骨诱导试剂。诱导16 d进行Masson染色。

软骨诱导荧光定量PCR检测：取成软骨诱导0，4，8，12，16 d的细胞，使用TaqMan^® Gene Expression Cells-to-CT^TM Kit反转录cDNA链。根据实验要求，使用TaqMan^® Gene Expression assays中的Ⅱ型胶原蛋白为引物，荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原mRNA表达量。并以β-actin为内参，实验重复3次。PCR结束后收集Ct值，实验使用2^-^??Ct法对数据进行分析。

1.5 统计学分析 使用Rstudio统计软件进行单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

羊膜上皮细胞已在基础研究领域受到很大关注，虽然大部分研究成果还未应用到临床领域，但已在某些疾病模型中获得初步成效，如眼表疾病、神经系统疾病^[26]、肝脏疾病等，用于细胞疗法或组织再生治疗。Enosawa等^[27]报道了人羊膜上皮细胞具有肝细胞表面标志并表达白蛋白和甲胎蛋白，可用于组织再生医学和基因载体治疗肝脏疾病；Kakishita等^[28]报道了人羊膜上皮细胞移植物有能力来对抗帕金森病损失的神经元；印度及日本学者先后报道了移植羊膜上皮细胞可以治疗神经退行性病变^[29-30]。人羊膜上皮细胞还表达间充质干细胞的数种表面标志和基因产物，如CD44、CD49e、CD73、CD90(Thyl)、CDl05、CDl66、STRO-1^[31-32]，提示人羊膜上皮细胞分化为多种组织细胞类型的可能性。

现阶段，细胞治疗愈发受到关注，羊膜上皮细胞在神经系统疾病、肝脏疾病、心血管疾病等临床治疗上取得了一定的疗效，但其作用机制并不清楚。此次实验通过羊膜上皮细胞体外成脂、成骨、成软骨诱导，从而测定其诱导过程中成脂转录因子、Ⅱ型胶原蛋白、碱性磷酸酶和骨桥蛋白的表达量，为后续从分子水平为临床治疗提供基础。

实验中采用胰蛋白酶消化的方法从从胎盘的羊膜中分离出羊膜上皮细胞，经过免疫荧光CK19鉴定，所分离出的细胞表达上皮细胞标志物，证实其为羊膜上皮细胞。所获得的细胞通过细胞周期和生长曲线分析，第1代细胞生长良好，增殖旺盛，但是随着传代次数增加，细胞增殖能力和G₀/G₁期细胞比例显著下降。羊膜上皮细胞不表达干细胞端粒酶基因，因此羊膜上皮细胞不能无限生长。同时实验还证实，羊膜上皮细胞具有一定的体外成脂、成软骨、成骨的分化能力。利用成脂、成软骨、成骨诱导剂盒诱导羊膜上皮细胞，16 d后油红O染色镜下均见大量红色脂滴，Masson染色镜下见亮蓝色圆形物，碱性磷酸酶染色镜下见大量红棕色沉淀。非诱导细胞成脂诱导出现弱阳性染色，成软骨和成骨诱导不出现阳性染色，证实羊膜上皮细胞可在体外成脂、成软骨、成骨分化。实验通过RT-PCR和荧光定量PCR检测成脂、成软骨、成骨诱导后羊膜上皮细胞的成脂转录因子、Ⅱ型胶原蛋白、碱性磷酸酶和骨桥蛋白的活性，发现随着诱导天数增加，人羊膜上皮细胞成脂转录因子、Ⅱ型胶原蛋白、碱性磷酸酶和骨桥蛋白的mRNA表达量越高，充分证实了羊膜上皮细胞是一种多分化潜能的细胞。

成脂转录因子是一个核激素受体，胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类是其激活剂。成脂转录因子激活可促进白色脂肪细胞分化，增加小脂肪细胞的数量而减少大脂肪细胞的数量，有利于促进葡萄糖摄取，改善胰岛素抵抗。实验结果显示，随着成脂诱导天数增加，羊膜上皮细胞成脂转录因子的表达量也增加，这将意味羊膜上皮细胞将为脂类代谢疾病的治疗提供重要手段。

Ⅱ型胶原蛋白广泛存在于软骨组织中。天然软骨中的Ⅱ型胶原蛋白不可溶，在去除其端肽的过程中，Ⅱ型胶原的天然3股螺旋可能被破坏^[22]。Ⅱ型胶原蛋白能使机体产生免疫耐受，对类风湿关节炎有较好的防治效果。骨桥蛋白不仅参与骨代谢，随着近年的研究发现，骨桥蛋白作为一种重要的多功能糖蛋白，存在于细胞外基质中。Giachelli等^[33]的早期实验发现，骨桥蛋白能促进血管平滑肌、外膜细胞的迁移，认为骨桥蛋白可以修复血管损伤。实验结果显示，羊膜上皮细胞随着成脂诱导天数增加，其Ⅱ型胶原蛋白和骨桥蛋白的表达量也随之增加，这将意味羊膜上皮细胞将为骨科疾病和心血管疾病的治疗提供新思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程