1.1 设计 分组对照细胞学实验。
1.2 时间及地点 实验于2015年10月至2016年10月在青岛大学医学院实验室完成。
1.3 材料 标本来源为青岛市市立医院口腔科,经患儿和家长同意签署知情同意书,取12岁正畸女性患者所需拔除的健康减数前磨牙。
主要试剂及仪器:胎牛血清购自美国Gibco公司;α- MEM培养基、DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国Hyclone公司;Ⅰ型胶原酶购自美国Sigma公司;ABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;cck-8检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒购自上海七海复泰生物科技有限公司;细胞凋亡Hoechst染色试剂盒购自杭州碧云天生物技术研究所;Trizol提取试剂盒、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒、FastStart Essential DNA Green Master试剂盒、LightCycler96实时荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司;3111型孵箱、高速台式离心机购自美国ThermoForma公司;DMIL倒置相差显微镜购自德国Leica公司;FV500激光共聚焦显微镜购自日本Olympus公司;ELX800多功能酶标仪购自美国BioTek公司;Accuri C6 流式细胞分析仪购自美国BD Biosciences公司;紫外分光光度计购自德国IMPLEN公司。
1.4 方法
1.4.1 人牙周膜成纤维细胞原代培养及鉴定 使用酶消化加组织块法培养人牙周膜成纤维细胞[14]。取前磨牙,拔出后立刻置入预冷的无菌α-MEM培养液中,在超净台内进行后继操作。含有1×106 U/L青霉素和1×106 U/L链霉素的0.01 mol/L的PBS冲洗,无菌手术刀片轻轻刮取牙根中部1/3处的牙周膜组织,置于含有1×106 U/L青霉素和1×106 U/L链霉素的0.01 mol/L的PBS中,1 000 r/min离心5 min。弃上清液,底部沉淀用含有0.2 g/LⅠ型胶原酶的PBS重悬, 37 ℃水浴振荡消化0.5 h,加入α-MEM培养基定容到5 mL,轻轻吹打混匀,再次1 000 r/min离心5 min。弃上清液,加少量含体积分数20%胎牛血清的α-MEM培养基,轻轻吹打,吸取悬液(内含有单细胞及未消化的组织块)接种于培养瓶中,各组织块间隔约5 mm。反转培养瓶,加入含体积分数20%胎牛血清,1×105 U/L青霉素和1×105 U/L链霉素的α-MEM培养基约3 mL,置于CO2恒温孵箱(体积分数5%CO2,100%湿度,37 ℃恒温)中静置培养。4 h后小心将培养瓶反转使其瓶底向下。4 d换液一次,倒置显微镜观察细胞游出和生长情况。待组织块旁边已长满细胞,培养瓶内细胞量约80%时0.25%胰酶消化,按1∶1传代,标记为第1代。取第5-8代细胞用于实验。以5×104/孔的细胞密度接种于24孔培养板中,加入含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基培养,显微镜下观察;待细胞密度达到80%时,弃去培养液,40 g/L多聚甲醛固定10 min后,用免疫组化染色做角蛋白、波形丝蛋白染色,鉴定细胞来源。
1.4.2 细胞分组 按照析因设计,2个处理因素为葡萄糖和脂多糖,根据以往参考文献[7,15-18]、以及预实验结果,选择葡萄糖浓度为5.5,25 mmol/L,脂多糖浓度为0,1, 10 mg/L,将生长状态良好的人牙周膜成纤维细胞总共分为6组。
对照组:5.5 mmol/L葡萄糖和0 mg/L脂多糖培养;A组:5.5 mmol/L葡萄糖和1 mg/L脂多糖培养;B组:5.5 mmol/L葡萄糖和10 mg/L脂多糖培养;C组:25 mmol/L葡萄糖和 0 mg/L脂多糖培养;D组:25 mmol/L葡萄糖和1 mg/L脂多糖培养;E组:25 mmol/L葡萄糖和10 mg/L脂多糖培养。
1.4.3 cck-8检测 各组细胞培养于96孔板中(5×103/孔)24和48 h后,去培养液,加入cck-8与α-MEM培养基按照1∶10的比例混合液,孵育2 h时后,酶标仪测量450 nm处的吸光度值。
1.4.4 Hoechst33258荧光染色 各组细胞培养于24孔板中(1×105/孔)24和48 h后,吸出干扰试剂,每孔加0.5 mL 40 g/L多聚甲醛固定液固定10 min,去除固定液,PBS洗2次,每次3 min,再加入0.5 mL Hoechst33258染液,染色5 min,吸出染液,PBS洗2次,荧光显微镜观察(激发波长350 nm,发射波长460 nm)。
1.4.5 流式细胞仪检测 各组细胞培养于6孔板中(5×105/孔)24和48 h后,500 r/min离心5 min,收集细胞。弃上清液,1 mL 4 ℃预冷的PBS重悬,再次500 r/min离心5 min。弃上清液,加入400 μL 1×Binding Buffer轻轻重悬细胞,加入5 μL Annexin V-FITC染色液,轻轻混匀,室温避光孵育15 min。加入10 μL PI染色液,轻轻混匀,冰浴避光孵育5 min。30 min内流式细胞仪检测。
1.4.6 实时荧光定量PCR检测 各组细胞培养于6孔板中(5×105/孔)24和48 h后,去培养基,0.25%胰酶消化, 1 000 r/min离心5 min。弃上清液,加Trizol 1 mL重悬,15-30 ℃室温静置30min,使核蛋白充分解离。加入0.2 mL氯仿,充分剧烈振荡15 s,15-30 ℃室温静置2.0-3.0 min。4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。离心后样品分层,上层水相中含RNA,取上清转入新管,加入等体积的约0.5 mL异丙醇,颠倒混匀,15-30 ℃室温静置10 min。4 ℃ 12 000 r/min离心10 min后,在管底会出现胶状沉淀,即为RNA。弃去上清液,向沉淀中加入1 mL含0.1%DEPC的体积分数75%乙醇,轻轻混匀。4 ℃ 12 000 r/min离心5 min。弃上清液,将RNA样品在室温下自然晾干10 min,加入30 μL DEPC水溶解沉淀,可55-60 ℃水浴促溶10 min。待RNA沉淀完全溶解后,紫外分光光度计分别测定细胞总RNA在260 nm和280 nm处的吸光度值,计算mRNA的纯度和浓度。Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行RNA的逆转录,合成cDNA。引物根据编码区设计(表1)。Real-time PCR参考罗氏FastStart Essential DNA Green Master试剂盒说明书。反应体系为20 μL,温度程序:95 ℃ 10 min激活FastStart Taq DNA聚合酶并使DNA变性。扩增程序:95 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,循环数为45。Bax,Bcl-2,GADPH同时扩增,检测。2-??Ct法计算目的基因的表达情况。
表1 Bax、Bcl-2、GADPH mRNA的引物序列
Table 1 The primer sequences of Bax, Bcl-2 and GADPH mRNA
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引物
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序列(5’-3’)
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大小(bp)
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Bax
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Forward: AGT GGC AGC TGA CAT GTT TT
Reverse: GGA GGA AGT CCA ATG TCC AG
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152
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Bcl-2
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Forward: ATG TGT GTG GAG AGC GTC AAC C
Reverse: TGA GCA GAG TCT TCA GAG ACA GCC
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196
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GADPH
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Forward: TCA TGG GTG TGA ACC ATG AGA A
Reverse: GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG
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146
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1.5 主要观察指标 人牙周膜成纤维细胞的形态、增殖、凋亡及凋亡相关基因Bax,Bcl-2 mRNA的表达水平。
1.6 统计学分析 以上每个实验重复3次,应用SPSS 19.0统计软件,计量资料两组数据之间的比较采用独立样本t检验,多个不同处理组之间的比较采用方差分析,P ≤ 0.05为差异有显著性意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点:组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程