口腔颌面组织工程血管的初步构建

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.04.009

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (4): 545-550.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.04.009

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口腔颌面组织工程血管的初步构建

杨兴华1，2，彭琳1，韩晓燕2，陈岱韵2

1烟台业达医院口腔科，山东省烟台市 264006；2泰山医学院口腔医学院口腔颌面外科，山东省泰安市 271000

收稿日期:2016-12-07 出版日期:2017-02-08 发布日期:2017-03-13
作者简介:杨兴华，男，1972年生，山东省泰安市人，汉族，2006年山东大学毕业，硕士，副主任医师，副教授，主要从事口腔牙槽外科疾病及牙髓病的临床诊治与基础研究。2015年8月由泰山医学院口腔医学院调入烟台业达医院工作。
基金资助:
山东省教育厅立项项目(J13LL01)；山东省卫生厅立项项目(2009HW094)

Preliminary construction of the tissue-engineered oral and maxillofacial vessel

Yang Xing-hua1, 2, Peng Lin1, Han Xiao-yan2, Chen Dai-yun2

1Department of Stomatology, Yeda Hospital of Yantai, Yantai 264006, Shandong Province, China; 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, School of Stomatology, Taishan Medical University, Taian 271000, Shandong Province, China

Received:2016-12-07 Online:2017-02-08 Published:2017-03-13
About author:Yang Xing-hua, Master, Associate chief physician, Associate professor, Department of Stomatology, Yeda Hospital of Yantai, Yantai 264006, Shandong Province, China
Supported by:
the Project of the Education Department of Shandong Province, No. J13LL01; the Project of the Health Department of Shandong Province, No. 2009HW094

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人工血管：是许多严重狭窄或闭塞性血管的替代品，多是以尼龙、涤纶、聚四氟乙稀等合成材料人工制造的，适用于全身各处的血管转流术，大、中口径人工血管应用于临床已取得满意的效果。
血管组织工程：是指利用血管壁的正常细胞和生物可降解材料来制备、重建和再生血管替代材料的科学。国内外已经进行了较多的研究以期研制出无免疫原性，抗血栓形成、组织和细胞相容性高，具有一定强度和生长性并能广泛应用于临床的血管替代物，以期解决临床上治疗血管狭窄或闭塞导致的缺血性疾病自体血管移植及血管来源有限的问题。

摘要
背景：大型骨缺损因缺乏有效血供，当骨的厚度过大时，骨细胞就会因缺乏营养而坏死，限制了工程骨在大型骨缺损中的应用。
目的：分析兔骨髓基质干细胞和脐静脉血管内皮细胞体外培养后与自制兔主动脉脱细胞血管基质构建人工血管的可能性。
方法：全血贴壁法培养兔骨髓基质干细胞，体外分离培养人脐静脉内皮细胞，制备兔主动脉脱细胞血管支架。把培养后的干细胞、内皮细胞与脱细胞血管支架复合，观察与载体材料的生物相容性并进行电镜扫描观察。血管支架-细胞复合物分为3组：空白组(空白组支架)、对照组(由骨髓基质干细胞复合血管支架构成)、实验组(由骨髓基质干细胞与内皮细胞复合血管支架)，每组各10条。以上3组分别植入兔皮下小血管旁。术后3个月取血管标本，进行大体观察及苏木精-伊红染色组织切片检测。
结果与结论：①全血贴壁可形成成纤维样细胞克隆，细胞爬片后CD44+、STRO-1+免疫荧光测定显示阳性；钙化结节茜素红染色阳性。内皮细胞经流式细胞仪测CD34+占43.83%，Ⅷ因子免疫荧光检测阳性；②血管支架-细胞复合物经电镜扫描观察内细胞在支架表面形成单细胞层。3个月后皮下人工血管生长较好，均形成管状结构；空白组薄层膜样血管形成，对照组仅有内皮样组织形成血管，实验组有8条血液流通样血管形成；③结果说明，血管支架-细胞(内皮、干细胞)复合物兔皮下血管旁植入后，可形成血管样结构，细胞间未见免疫反应产生，但人工血管未见肌层形成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-7256-5383(杨兴华)

关键词: 组织构建, 组织工程, 间质干细胞, 内皮细胞, 人工血管工程

Abstract:

Abstract
BACKGROUND: Insufficient blood supply after major bone defects leads to osteocyte necrosis; therefore, the tissue-engineered bone cannot meet the clinical requirements.
OBJECTIVE: To construct an artificial vessel using in vitro cultured rabbit bone marrow stromal stem cells and human umbilical vein endothelial cells combined with the rabbit aortic decellularized vascular matrix.
METHODS: Rabbit bone marrow stromal stem cells were cultured by adherent method, human umbilical vein endothelial cells were cultured in vitro and isolated, and rabbit aortic decellularized vascular stent was prepared. The stent-cell composite was constructed, and its biocompatibility was observed under scanning electron microscope. There were three groups: blank control, control (bone marrow stromal stem cell-stent) and experimental (stent-cell composites) groups (n=10 per group), followed by implantation around the small vessels. Three months later, the vascular samples were collected for gross observation and hematoxylin-eosin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Fibroblast-like cell clones were formed by adherent method, and were positive for CD44+ and STRO-1+ after climbing; calcified nodule formed in the ossification. Flow cytometry showed CD34+ accounting for 43.83%, and visible VIII factor in the endothelial cells. In the experimental group, endothelial cells formed a single cell layer onto the scaffold under scanning electron microscope; the artificial vessel grew well and tubular structure presented and eight angiod structures were found. Thin film-like vessels formed in the blank control group and there were only endothelial-like tissues in the control group. These results suggest that angiod structures can form after the stent-cell composite implantation, causing no immune reaction, but the artificial vessel is visible in absence of muscular layer.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Stem cells, Endothelial Cells, Blood Vessel Prosthesis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

杨兴华，彭琳，韩晓燕，陈岱韵. 口腔颌面组织工程血管的初步构建[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(4): 545-550.

Yang Xing-hua1, 2, Peng Lin1, Han Xiao-yan2, Chen Dai-yun2. Preliminary construction of the tissue-engineered oral and maxillofacial vessel[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(4): 545-550.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓基质干细胞形态学观察结果在头2 d内培养皿内漂浮大量的血细胞，2 d后首次半换液，可见培养瓶壁上有成纤维样细胞散在分布，7-14 d可见少量的集落形成 (colony forming unit fibroblastic，CFU-F)，细胞集落的中央部位细胞分布较密，外周细胞密度降低。高倍镜下观察贴壁细胞，呈短棒状、短梭形，胞核浆分界清晰，折光性强。15 d时观察见细胞基本铺满瓶底(图1A)。用0.25%胰蛋白酶消化后进行传代培养，骨髓基质干细胞传代后生长更加迅速，一般四五天可传代1次。传代细胞形态仍呈多角形、短梭形；传至38代后，生长速度没见明显减慢，细胞轮廓尚好。低密度培养的细胞在开始时生长缓慢，随着时间的延长有大部分的细胞出现空泡性变性，细胞轮廓消失，逐渐凋亡，不同种植密度的细胞均在两三周开始出现细胞集落，在75 cm²的培养皿中可出现一两个集落，以中、小细胞为主(图1D)。

2.2 MTT法测生长率非低密度培养细胞为对照组，低密度培养细胞为试验组通过MTT法测其细胞增殖率，其数值见表1。

以上两组均数进行单因素计量资料分析，α=0.050 0 (双侧)，t=0.165 5，P=0.871 3按α=0.050 0水准低密度培养前后细胞生长速度无差异。

细胞表面标志的检测stro-1⁺、CD44⁺(见图1B)免疫荧光结果可见细胞在绿色荧光显微镜下细胞核呈现绿色，非阳性细胞不显色。细胞钙化结节及碱性磷酸酶的定量测定茜素红染色结果显示矿化液诱导后细胞间出现致密的、圆形不透光团块(图1C)。培养细胞呈现出基质干细胞特性。

2.3 脐静脉内皮细胞的培养结果原代培养脐静脉内皮细胞贴壁后逐渐由圆缩状态伸展，起初细胞散在分布，体积较小，呈梅花样形态。细胞舒展后形态大多呈多角形和短梭形(图2A)。随着培养时间延长，脐静脉内皮细胞体积略微增大，细胞间开始彼此连接，但细胞形态改变不明显。大约在48 h后，原代内皮细胞开始快速生长，原来散在的

细胞间隙缩小，逐渐融合成片，至接种六七天后，部分区域细胞彼此间镶嵌排列，呈现出鹅卵石样外观。传代的脐静脉内皮细胞生长活跃，形态稳定，多呈多角形，一般可传至三四代以上。脐静脉内皮细胞易于老化，一般传4代以后，细胞体积明显增大，胞浆内出现颗粒，增殖能力明显减弱。Ⅷ鉴定荧光显微镜下见两种细胞胞浆中均呈现均匀的淡黄绿色荧光染色，胞核清晰不着色(图2B)。流式细胞

仪显示，CD34⁺细胞为40%左右。

2.4 脱细胞血管支架大体观察结果血管支架制备期间处理液呈浑浊状态，随着不同处理液的更换，液体颜色逐渐变清，脱细胞处理后，经干燥后的血管呈乳白色，管壁无破损，管壁无塌陷(图3A)，滴加的细胞可以紧密的附着在支架材料上(图3B)。组织学观察脱细胞血管基质中胶原纤维呈网状排列，未见细胞残余，支架壁胶原纤维成分连续性保存良好。扫描电镜观察脱细胞血管基质血管内皮细胞被完全去除，血管表面无内皮细胞覆盖，血管壁的胶原纤维束结构保存完好，胶原之间呈致密网状结构(图3C)。脱细胞血管基质的细胞毒性分析接触细胞毒性实验内皮细胞接种于脱细胞血管基质表面3 d后，倒置显微镜观察细胞紧密的复合到管壁，生长良好(图3D)。

2.5 人工血管的构建结果复合细胞的支架在皮下埋植后(图4A)，3个月时可形成管状结构(图4B)，大体标本可见血管表面的外膜和光滑的血管内壁，与周围血管联系紧密，部分管腔内有血液成分(图4C，D)。从分组来看，3组均可形成样血管样管状物，其中试验组有8条形成血液样组织。苏木精-伊红染色示：3个月后皮下人工血管均形成管状结构，空白组薄层膜样血管形成；对照组仅有内皮样组织形成血管；试验组有血液流通样血管形成，内皮细胞在人工血管内壁表面黏附，血管壁有大量的纤维胶原，外面有细胞层形成，类似正常血管。

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引言

由外伤、先天畸形、恶性肿瘤等原因造成的颌面骨大面积缺损是口腔颌面外科医师临床上经常面对的问题，也是长久以来临床治疗的难点和热点。经过几代医师和研究者的摸索和借鉴了大量颌骨缺损的修复方法，先后经历了自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨移植、人工组织代用品和组织化人工骨等几个阶段，但都存在不同程度的缺陷。

随着组织工程骨研究的发展，为广大患者治疗带来新的修复方法。组织工程骨在基础研究方面取得了成功，但难以广泛在临床应用，其主要原因为：植入体内的种子细胞只有在血管周围150-200 μm 的范围内才能通过营养的弥散得以存活，超出范围的种子细胞由于无法得到充足营养难以成活。因此，对于组织工程骨修复大范围的颌骨缺损必须采取有效的方法解决成骨区血供。

血管化组织工程骨的研究在基础研究方面有不少进展，主要集中在种子细胞的选择、共养和增殖研究；血管化的支架材料研究；组织工程骨血管化的调控机制研究等方面。目前种子细胞研究较多、材料次之，且体外研究多于体内研究。在不同种子细胞的提取、增殖、混养、调控因子及与不同材料的黏附研究等都取得了不少进展，例如成骨细胞、骨髓基质干细胞等细胞可以与脐血管内皮细胞共养，不同细胞供养具有相互促进增殖的作用且在体外无排斥反应；生长因子如骨形态发生蛋白2在成骨方面的作用、血管内皮生长因子尤其是血管内皮生长因子165促进血管生成和形成的功能作用、富血小板血浆等；在血管化骨体内的血管生成形成机制：受床血管舒张，基膜分解，该处血管内皮细胞分裂增生形成突起的幼芽，随细胞的增生而形成一条细胞索，随后出现管腔，形成新生的毛细血管，进而彼此吻合构成毛细血管网；血管支架材料的选择如聚乳酸材料、脱细胞猪主动脉支架、多孔羟基磷灰石、壳聚糖等。

在借鉴以上经验的基础上，研究尝试体外构建中小口径人工血管，然后移植于动物皮下不同部位，观察不同部位对血管形成情况影响，为人工骨组织的血管化提供实验支持。

材料方法

1.1 设计分组对照观察。

1.2 时间及地点实验于2013年8月至2015年8月在泰山医学院动脉粥样硬化研究所完成。

1.3 材料

实验动物：一两周龄健康雄性新西兰大白兔2只，购自山东省农科院兔场。

主要实验用品：0.25%胰酶(Sigma，美国)、新生牛血清(杭州四季清)、免疫组织化学SABC试剂盒(武汉博士德)、CD34⁺抗体(abcam)、八因子抗体(北京)、STRO-1⁺抗体(santa cruz)、新西兰大白兔(山东省农科院兔场提供)、茜素红(Sigma)；细胞孵育箱(Forma公司，美国)、倒置相差荧光显微镜(Olympus ，日本)、酶联免疫检测仪(Thermo，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓基质干细胞的分离与培养^[1] 雄性新西兰大白兔脱颈处死，消毒后在后肢膝关节处切开表皮，剖开关节，显露关节面，截取兔的股骨及胫骨，PBS(含1×10⁵ U/L青霉素、0.1 g/L链霉素)冲洗2遍后，去除垢端显露髓腔，冲洗骨髓腔以获取骨髓细胞。冲洗液以200目的铁网过滤杂质，以1 200 r/min离心10 min，管内沉淀用PBS冲洗1遍后，以含有体积分数20%胎牛血清的DMEM重新悬浮细胞，接种至25 cm²底面积玻璃培养瓶，置体积分数5%CO₂培养箱中37 ℃培养，2 d后首次换液去除悬浮的血细胞，四五天后半量换液。待原代培养的细胞增殖至铺满瓶底时，0.25%胰蛋白酶消化1 min，吹打为单细胞悬液后，以1×10⁴/cm²密度接种于75 cm²培养瓶。取第4代细胞以3×10⁸ L^-1爬片，待细胞基本接触后，对细胞进行stro-1⁺、CD44⁺免疫荧光组化及成骨钙化结节的诱导等干细胞特性鉴定。

对获取的第2代干细胞以1×10³L^-1细胞浓度接种于底面积为75 cm²的培养瓶中，进行低密度培养进一步纯化^[2]。纯化后的第4代干细胞为实验组，取非低密度培养的同代细胞作为对照组，以每孔100 μL滴加在96空板中，在酶联免疫检测仪上选择490 nm波长，测各孔的吸光光度值(A)，每天测12孔，取其均值。

1.4.2 血管内皮细胞的分离与培养^[3] 无菌剪取人的脐静脉10 cm(供者对此知情同意，伦理问题已经泰山医学院医学伦理委员会审查并批准)，置入盛有无菌PBS的容器中待用(不超过2 h)。在超净工作台内，取出用止血钳夹住血管两端，体积分数75%乙醇消毒60 s。然后将两端剪掉约1 cm。用5 mL注射器(针头需磨钝、抛光)吸取PBS反复冲洗血管，直至无明显血细胞为止。以血管钳结扎血管一端，另一端血管腔内注射1 g/L Ⅱ型胶原酶(Sigma)至血管腔充盈后，小心结扎血管，检查无消化液漏出后，将脐带放入无菌培养皿中，置37 ℃培养箱内恒温消化15 min左右。取出血管，消毒血管表面及两端，收细胞悬液，用培养液冲洗静脉几遍，同收集的细胞液一并1 000 r/min离心10 min。吸弃上清液，收集细胞沉淀。在细胞沉淀中加适量M199培养液(内含体积分数20%胎牛血清)，用吸管吹打细胞成悬液，种到25 cm²培养瓶中，置37 ℃，体积分数5% CO₂培养箱中，至24 h时换液，以后每隔两三天换液1次。5 d左右内皮细胞可基本铺满单层。内皮细胞的传代培养：待细胞铺满80%时，吸弃培养液，加入胰蛋白酶(0.05 g/L)和EDTA(0.01 g/L) (按1∶1体积比混合)1 mL。在显微镜下观察，当细胞缩变时，立即加入传代用培养液终止消化，用管轻轻吹打成细胞悬液，按1∶2传代。取第1代细胞进行爬片，待细胞基本接触后进行免疫荧光的八因子鉴定及流式细胞仪的CD34⁺检测。

1.4.3 脱细胞血管支架制备^[4] 兔的腹主动脉充分显露后，结扎主要动脉分支，仔细剥离，于髂动脉分支处结扎切断，以乙醇消毒，剖开动脉壁，PBS清洗3遍，小心剥去血管内、外膜。将其浸入1%新洁尔灭溶液中浸泡30 min消毒，用加双抗的PBS冲洗若干遍，以去除血管表面的新洁尔灭。取新鲜的血管在37 ℃、体积分数5%CO₂的环境中，分别用0.25%胰蛋酶+0.02% EDTA+双抗的溶液振荡处理24 h，在0.02% EDTA+4% NaCI+双抗+50 mmol Tris HCI溶液和0.02% EDTA+双抗+10 mmol Tris HCl溶液各处理24 h，2% Triton X-100 +双抗+5 mmol Tris HCl溶液中处理168 h，最后在DNAase和RNAase混合溶液中消化12 h，用加双抗的PBS冲洗3 d。37 ℃干燥后，等离子消毒包装备用。

1.4.4 人工血管的构建复合细胞前12-24 h把备用的脱细胞血管胶原支架在培养皿内以0.9%的盐水浸泡，使用前PBS冲洗3遍剪成2 cm长平铺在培养皿内，并保持湿润状态。把消化好的1×10⁶的血管内皮细胞滴加到支架上至充盈状态，静置4 h；翻转支架，把消化好的1×10¹⁰L^-1骨髓基质干细胞滴加在支架上，再静置4 h，滴入0.5 mL培养基过夜，然后滴加培养基至2 mL。复合好细胞的人工血管支架培养2 d，进行电镜扫描。同期把血管支架复合物植入新西兰大白兔的背部皮下。血管支架-细胞复合物分为3组：空白组支架、对照组(由骨髓基质干细胞复合血管支架构成)、实验组为实验组(由骨髓基质干细胞与内皮细胞复合血管支架)，每组各10条。以上3组分别植入兔皮下小血管旁。术后3个月从兔体内取出血管标本，进行大体观察及苏木精-伊红染色组织切片检测，观察血管形成情况和细胞的分化情况。

1.5 主要观察指标 ①骨髓基质干细胞形态学观察结果；②细胞生长率；③脐静脉内皮细胞的培养结果；④脱细胞血管支架大体观察结果；⑤人工血管的构建结果。

1.6 统计学分析两组均数进行单因素计量资料分析；组间比较采用统计学软件CS 10.34进行两样本均数的t 检验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

采用组织工程骨修复下颌骨大型骨缺损给患者带来新的希望，但其无血管输送营养，当骨的厚度较大时，骨细胞就因缺乏营养而坏死，限制了组织工程骨骼形成的厚度，从而不能在大型骨缺损中的进行应用^[5]。组织工程骨的血管化成为组织骨研究者的必须面对的问题。目前骨组织血管化研究中体外构建组织工程血管是重要研究课题之一，它主要包括种子细胞培养、血管支架制备和体外构建3个部分。骨髓基质干细胞具有多向分化潜能，是组织工程中较理想的种子细胞之一^[6]。但骨髓基质干细胞在骨髓中含量较少，因此必须需要体外分离纯化及扩增骨髓基质干细胞才能达到需要的数量级。细胞培养中常采用的是Percoll密度梯度离心法、免疫磁珠法或全血贴壁法培养来分离纯化骨髓基质干细胞；也可采用低密度培养利用干细胞的增殖特性，去除增殖能力差的非干细胞。本课题根据骨髓基质干细胞与血系细胞贴壁性能差异，经体外贴壁培养，随换液去除悬浮生长的血细胞。

实验采用全血贴壁法培养骨髓基质干细胞，经低密度培养后，流式细胞仪检测细胞膜表面分子大多数CD34⁺表达阴性，CD44⁺-FITC表达阳性，检测结果与文献报道一致，经体外诱导可形成骨的钙化结节，符合干细胞的基本特征标志。扫描电镜见兔骨髓基质干细胞在血管支架表面表面呈短而粗的微绒毛突起，细胞间形成紧密的连接，说明体外培养的兔骨髓基质干细胞功能活跃。有的文献报道，骨髓基质干细胞可以向平滑肌细胞转化，实验在没有诱导的情况下进行血管构建，经动物实验和组织切片发现，非诱导的干细胞在一定的微环境下没有观察到向平滑肌细胞分化的趋势。

血管内皮细胞最早是从人脐静脉中分离出来的，后来的研究者也多以脐静脉内皮细胞为研究对象。到目前为止，虽然各研究者所采用的分离内皮细胞的方法在操作上有差异，但基本上用的都是酶消化法。培养基以M199和RPMI-1640用的最多，而且以M199的营养价值高。由于进口RPMI-1640价格较贵，在培养中采用M199和RPMI-1640(体积比1∶1)混合培养基未见细胞生长受到影响。血管内皮细胞对血清质量和浓度要求均较高。第Ⅷ因子相关抗原(F-ⅧRAg)是血管内皮细胞一个可靠的标记物。培养的内皮细胞可用荧光标记的抗F-ⅧRAg抗体进行免疫荧光检测或免疫组织化学染色，研究中证明了原代培养细胞F-ⅧRAg的存在，并表达强阳性，可以基本确定为内皮细胞。在体外培养中未见内皮细胞与干细胞之间出现免疫反应，细胞之间生长良好。研究表明在组织支架中同时进行内皮细胞与软骨细胞混养可以促进软骨内成骨现象，说明内皮细胞对成骨细胞有促进成骨作用^[7-8]。内皮细胞生长相对较慢，细胞贴壁能力较差，细胞在3代以后就出现大量的“漂浮”，丧失贴壁能力，为了增加细胞黏附能力在传代前需在培养瓶底铺一层明胶。在内皮细胞在保持高纯度的前提下提高内皮细胞的增殖速率，如何大量的在体外使内皮细胞增殖是一个难题，虽然使用生长因子可以使内皮的增殖和传代次数增加，但价格昂贵；虽然基因转染是一个途径，但其安全性与长效性仍需得到检验。由于干细胞的增殖能力和多向分化潜能为种子细胞提供了一个选项^[9]；目前研究较多的是如何把干细胞更合理的向内皮细胞进行合理诱导分化。实验也是观察研究内皮细胞对干细胞分化的影响，在实验中未能观察到平滑肌细胞样的生成。在动物体内采用的人脐静脉内皮细胞未见与兔骨髓基质干细胞起免疫反应^[10-11]。但在临床应用阶段是否产生不同种属间的细胞免疫反应尚未可知。

支架材料生的物相容性良好对于构建组织工程血管十分重要^[12]。因抗原性存在于组织的细胞内，学者们提出脱除细胞保留细胞外基质的血管、蛛丝、胶原蛋白等，可作为人工血管支架材料的替代物^[13-14]。脱细胞血管基质采用动物主动脉经过一系列的化学处理后去掉细胞，而获得的一种生物相容性良好的生物材料，猪的脱细胞研究中可对种子细胞的分化与增殖产生一定的生理作用^[15]。

实验采用兔主动脉脱细胞制取的脱细胞血管基质，经扫描电镜观察显示，支架基质纤维的排列规整，有理想的孔径结构，可以为种子细胞的植入生长提供理想的微环境。构建正常形态和生理功能完整的内皮细胞层，是解决组织工程化血管体内植入后血栓形成的重要手段。脱除细胞后的血管基质基本可以保持原有的三维结构和理化特性，可以为细胞生长及植入体内修复缺损提供物质基础。在种植内皮细胞之前，用PBS浸泡经干燥消毒的基质材料24 h，使用前再用生理盐水冲洗支架3遍，一方面可提供血管内皮

细胞在脱细胞基质表面黏附和铺展的生长湿度，利于内皮细胞的生长；另一方面可去除去残余的化学试剂等成分，以防止对种子细胞产生毒性。由苏木精-伊红染色及扫描电镜结果可见，内皮细胞种植24 h已贴附基质材料生长，3 d即形成典型的血管内皮样结构，与正常血管内皮结构相似，表明内皮细胞与脱细胞血管基质具有良好的相容性。在种子细胞共培养的过程中，血管内皮细胞与骨髓基质干细胞在体外血管支架上，兔骨髓基质干细胞具有较强的铺展和生长能力，与血管内皮细胞无明显的排斥反应。在实验中，人工血管移植与皮下后两三个月，经苏木精-伊红染色及初期扫描电镜结果显示移植3个月后，组织工程血管组形成清晰的内、外膜两层结构，形态接近正常动脉，内皮细胞覆盖完整，基层不明显，管腔内有一定血液，但人工血管内无血流产生。周围组织物无明显的炎性细胞浸润。实验中发现脱细胞基质支架相对于移植细胞的增殖而言吸收较慢，支架的柔韧性欠佳，支架性能仍需进一步提高。最近的研究认为，支架材料的孔径在300-400 μm的范围内时更有利于血管的形成，这为支架材料的进一步研究改性提供了新的方向^[16]。

总之，骨髓基质干细胞是较易培养和快速增殖的有分化潜能的干细胞、内皮细胞是血管形成的功能细胞，动物主动脉脱细胞基质支架具有血管的基本结构和多孔性能且易于大量获取，通过功能细胞复合脱细胞支架制备的组织工程血管，经加入诱导剂，调控细胞的分化，进一步改性可望成为一种新型的功能血管代用品。但内皮细胞的大量增殖和支架吸收与细胞增殖速度的同步性仍需进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

口腔颌面组织工程血管的初步构建

Preliminary construction of the tissue-engineered oral and maxillofacial vessel

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