去细胞化全肝生物支架修复肝损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.52.008

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
去细胞化支架：是一类特殊的支架，它保留了组织中的管道结构，解决了细胞生长营养输送问题，并且能为细胞提供近似体内的生长环境，具有其他修复材料难以比拟的优势，能巧妙地解决传统支架低免疫性、仿生性差及机械强度弱等缺点。目前，去细胞化技术在心血管、食管、膀胱等组织器官中广为应用。
去细胞化全肝生物支架：灌洗后获得的支架外观透明，包膜完整，基本能保留肝脏的形态，且经过肉眼观察包膜内Glisson系统保存；该支架石蜡切片经过苏木精-伊红染色后可见细胞外基质样结构存在；电镜下显示肝脏内细胞成分被完全去除，支架胶原纤维排列整齐，未出现溶解现象。

背景：去细胞化支架是一类特殊的支架，它保留了组织中的管道结构，解决了细胞生长营养输送问题，并且能为细胞提供近似体内的生长环境，具有其他修复材料无法比拟的优势。
目的：研究去细胞化全肝生物支架的制备方法，探讨去细胞化全肝生物支架修复肝损伤的效果。
方法：取SD大鼠12只，采用化学去垢剂-酶联合去细胞化技术制备去细胞化全肝生物支架。另取SD大鼠24只，建立肝损伤模型，随机分为2组，实验组肝损伤部位置入去细胞化全肝生物支架，对照组于肝损伤部位注射生理盐水。术后30 d，检测血清丙氨酸转氨酶及谷草转氨酶水平，取肝脏组织进行苏木精-伊红染色观察。
结果与结论：①去细胞化全肝生物支架的结构：苏木精-伊红染色可见细胞外基质样结构存在；电镜下可见肝脏内细胞成分被完全去除，支架胶原纤维排列整齐，未出现溶解现象；②血清丙氨酸转氨酶及谷草转氨酶水平：实验组丙氨酸转氨酶及谷草转氨酶水平显著低于对照组(P < 0.05)；③肝脏组织苏木精-伊红染色：对照组可见大量蓝染并密集分布的细胞核及粉红色分布结构，纤维胶原之间并未出现明显断裂；实验组可见粉红色且分布密集结构；④结果表明：采用化学去垢剂-酶联合去细胞化技术制备去细胞化全肝生物支架方法相对简单，去细胞化全肝生物支架可促进肝损伤的修复。

ORCID: 0000-0002-1049-7618orcid.org/0000-0002-1049-7618(张庆峰)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 去细胞化全肝生物支架, 制备方法, 肝损伤, 修复效果, 化学去垢剂, 修复效果, 转氨酶

Abstract:

BACKGROUND: Decellularized scaffolds are special for retaining the tubular structure used for nutrition transport, and providing a similar inner environment for cell growth.
OBJECTIVE: To study the preparation of the decellularized whole liver bioscaffold and to explore its repair outcomes for liver injury.
METHODS: Livers from 12 Sprague-Dawley rats were used for preparing the decellularized whole liver bioscaffold by chemical detergent-enzymes decellularized technology. Models of liver injury were established in another 24 Sprague-Dawley rats and randomized into two groups: the decellularized whole liver bioscaffold was implanted into the rat liver lesions in experimental group, and controls were given the injection of normal saline. Thirty days later, the serum levels of alanine aminotransferase and glutamic-oxaloacetic transaminase were detected, and liver tissues were removed for hematoxylin-eosin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining showed that extracellular matrix-like structures existed in the decellularized bioscaffold; cell components were completely removed from the liver, the collagen fibers in the scaffold arranged regularly and were not dissolved under electron microscope. The serum levels of alanine aminotransferase and glutamic-oxaloacetic transaminase in the experimental group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining showed a large number of blue-stained and dense distributed nuclei, and pink distribution of collagen fibers that had no overt breakages in the control group, while pink and dense structures in the experimental group. These results suggest that the decellularized whole liver bioscaffold is easy to obtain, and can promote the injured liver repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Liver, Artificial, Transaminases, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张庆峰，李自荣. 去细胞化全肝生物支架修复肝损伤[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(52): 7809-7814.

Zhang Qing-feng, Li Zi-rong.

Decellularized whole liver bioscaffold repairs liver injury

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(52): 7809-7814.

图/表（结果） 4

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引言

中国是世界上病毒性肝炎及肝癌发病人数最多的国家之一^[1]。相关数据显示，每年由于肝病死亡的人数超过50万，且每年用于治疗肝炎、肝病的医疗、保健费用超过1 000多亿元^[2-3]。急性肝功能衰竭病情比较严重，治疗预后较差，死亡率高达70.0%-80.0%。目前临床上对于急性、慢性肝衰竭，肝移植是其主要治疗方法，但该方法受到的影响因素较多。因此，临床上寻找新的治疗方法或肝脏功能替代品成为医学界研究的焦点^[4-5]。随着医疗技术的飞速发展，干细胞移植技术对于肝病治疗提供了新的思路，但细胞活性难以长期维持及氧气、营养物质的供给受限等均限制了其临床应用。生物人工肝研究的开展为肝脏功能暂时性替代提出了新的选择，但它不是肝脏移植的一个永久性替代方案，而是急需肝移植的危重症患者找到合适肝源之前的一个过渡性选择。

由于肝脏组织结构及生理功能复杂，组织工程化肝脏对于种子细胞和支架材料有了更加苛刻的要求，良好的支架材料应该具备足够的表面用于细胞黏附，也应该具备爱足够的空间使得细胞集落扩展、增殖，并且具备足够的空隙，更加有利于细胞的黏附。近年来，组织工程学、材料学及生命科学不断发展，其原则是利用到开发生物代替物的前沿交叉学科领域，其核心内容是建立三维复合体^[6-7]。相关研究显示，体外再造肝脏在肝衰竭、肝缺损等疾病中发挥了重要作用，能改善肝功能，促进机体早期恢复^[8-9]。但是，由于肝脏结构、功能相对较特殊及复杂，人工肝脏器官面临巨大的调整，如支架的相容性差、制备方法复杂等，难以为肝脏细胞提供所需要的内环境^[10]。去细胞化支架是一类特殊的支架，它保留了组织中的管道结构，解决了细胞生长营养输送问题，并且能为细胞提供近似体内的生长环境，具有其他修复材料难以比拟的优势，能巧妙地解决传统支架低免疫性、仿生性差及机械强度弱等缺点^[11-12]。目前，去细胞化技术在心血管、食管、膀胱等组织器官中广为应用。但临床上制备去细胞化全肝生物支架及其在肝缺损中的修复效果尚缺乏报道^[13-14]。

实验研究去细胞化全肝生物支架的制备方法，探讨去细胞化全肝生物支架在肝缺损中的修复效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2014年12月至2016年1月在山东医学高等专科学校动物实验中心完成。

1.3 材料

实验动物：6-10周龄SPF级成年SD大鼠36只，体质量105-460 g，平均(205±25) g，雌雄随机，由山东医学高等专科学校动物实验中心提供，饲养严格遵守相关标准进行饲养，合格证号为许可证号：SYXK(鲁) 2011-0039。

对大鼠进行等条件喂养，且对其处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则^[15-16]。将其中24只SD大鼠随机分为对照组和实验组，每组12只。

主要仪器和试剂：胰酶-乙二胺四乙酸(美国sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青生物试剂公司)；DMEM低糖培养基(美国GIBCO公司)；表皮生长因子及肝细胞生长因子(美国Peprotech公司)；丙氨酸氨基转移酶试剂盒、天冬氨酸氨基转移酶试剂盒(上海吉尔生化有限公司)；扫描电子显微镜(日立，S-3400N，日本)。

1.4 实验方法

去细胞化全肝生物支架制备：①肝脏的获取：取SD大鼠12只，称质量，按照4 mL/kg腹腔注射3.6%水合氯醛进行麻醉，仰卧固定。对大鼠腹部皮肤采用碘酊消毒2次，采用体积分数75%乙醇脱碘，在其腹部横切开腹腔，剪开镰状韧带、肝脏与膈肌的韧带，结扎膈下动脉，切断机体内肝脏与胃、食管的韧带，将结肠向左侧外翻，充分暴露门静脉与胆管及下腔静脉，并对游离右肾上腺动脉进行结扎。将门静脉剪破后，插入取出针头后的头皮针软管进行双重固定。剪断肝下下腔与肝上下腔静脉，完整取下大鼠肝脏，根据肝脏的分叶、走形等放置在密闭平皿中，整个操作必须保持动作轻柔，保证获得完整肝脏。②肝脏的灌注：首先以1%TritonX-100灌注，速度100 mL/min，流出的灌洗液呈土黄色，肝脏逐渐从土黄色转变为乳白色(用时约3 h)。利用500 mL浓度0.01%的PBS对肝脏进行冲洗，洗脱残留的TritonX-100，利用500 mL 1%SDS灌洗肝脏，速度 10 mL/min，0.01%PBS充分灌洗肝脏，用时120 h，流速5 mL/min，稀释残余SDS，使得浓度降低为0.01%，见图1^[17-18]。

去细胞化肝脏支架生物学特征的鉴定：将获得的支架进行固定、脱水、石蜡包埋后固定、脱水、石蜡包埋后进行切片，切片厚度4 μm，脱蜡后进行苏木精-伊红染色，观察是否存在有细胞核残存及胶原纤维的完整性。取支架标本1.0 cm×0.8 cm，给予2.5%戊二醛固定，采用扫描电镜进行观察^[19-20]。

肝缺损动物模型建立及处理：取SD大鼠24只，均禁食12 h，术前肌肉注射0.5 g阿托品，采用3.6%水合氯醛进行全身麻醉，待麻醉生效后进行消毒、铺巾，腹腔注射四氯化碳油溶液10 mL/kg建立肝损伤动物模型，大鼠经超声检查及血液检查肝功能异常表示大鼠模型建立成功。对照组肝损伤部位注入生理盐水，实验组采用去细胞化全肝生物支架进行修复。30 d后处死大鼠，采血，3 000 r/min离心10 min，采用赖氏法检测机体血清中的丙氨酸转氨酶及谷草转氨酶水平^[21-24]；取出肝脏，大体观察肝脏颜色、大小、光滑度；取肝脏缺损部位组织，固定、脱水、石蜡包埋后固定、脱水、石蜡包埋后进行切片，切片厚度4 μm，脱蜡后进行苏木精-伊红染色^[22]。

1.5 主要观察指标去细胞化全肝生物支架的大体及组织学观察结果；两组大鼠治疗后的苏木精-伊红染色结果与肝功转氨酶水平。

1.6 统计学分析采集数据采用SPSS 18.0处理，计量资料采用均数±标准差表示，行t 检验，P < 0.05提示差异有显著性意义。

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讨论

一直以来，肝脏移植被视为肝缺损治疗的最佳方法，但由于种种限制，其应用十分有限。肝脏组织工程的发展为肝缺损的治疗提供了新的方法^[25]。目前，在肝脏组织工程中的重点是，如何采取积极有效的措施解决肝细胞组织化培养所需要的氧气及营养供应问题。传统的合成材料制备方法相对比较简单，这种方法虽然能获得良好的支架材料，但是无法满足肝脏生长所需要的条件^[26]。在肝脏组织工程研究过程中，天然细胞外基质成分相对比较复杂，并且这些成分在细胞的发育、分化及增殖过程中均发挥了重要作用，从而更加有利于细胞的增殖和分化。

去细胞化支架材料是一种新型的材料，该材料和内生长环境十分类似，材料更加有利于肝细胞的生长^[27]。研究中采用化学法去垢剂-酶联合去细胞计数制备全肝脏生物支架，该方法相对比较简单，支架上并不会有细胞成分残留，但能完整保留血管、胆管等结构，并且利用这些管道能够为细胞提供所需要的营养成分。实验中采用12只SD大鼠制备去细胞化全肝生物支架，12只大鼠全部成功，成功率为100%，由此说明化学去垢剂和酶联合去细胞化的方法是有效的、可行的。相关研究显示，去细胞化生物支架材料能能促进细胞生长^[28]。研究显示，灌洗后获得的支架外观透明，包膜完整，基本能保留肝脏形态，且经过肉眼观察包膜内Glisson系统保存；该支架石蜡切片经过苏木精-伊红染色后可见细胞外基质样结构存；电镜下显示，肝脏内细胞成分被完全去除，支架胶原纤维排列整齐，未出现溶解现象。由此看出，制备的去细胞化支架材料具备良好的生物相容性，能保留完整的支架，能够为肝细胞的黏附与生长提供良好的微坏境。实验组治疗后肝功能谷草转氨酶及丙氨酸转氨酶水平显著低于对照组，由此看出去细胞化全肝生物支架能促进肝功能恢复。而在细胞毒性实验中可以发现，去细胞化全肝生物支架中存在某些活性成分，能够促进肝细胞的生长和增殖，使得干细胞的体外培养成为可能^[29-38]。同时，去细胞化全肝生物支架植入后周围炎症反应相对较轻。但是，研究中尚存在许多不足之处，一方面去细胞化过程中存在肝及灌注过程中的失误；另一方面，实验中并未对细胞支架的保留以及丢失成分进行定量研究均需要进一步分析和探讨^[39]。

综上所述，采用化学去垢剂-酶联合去细胞化技术制备去细胞化全肝生物支架方法相对简单，将其运用于肝损伤中效果理想，能改善机体肝功能，促进肝脏功能恢复，具有较高的临床应用价值。

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