人脐带间充质干细胞移植治疗急性肺损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.013

摘要/Abstract

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文题释义：
人脐带间充质干细胞：具有易分离培养、易传代、细胞数目多等优点，来源广泛，是干细胞家族成员之一，具有干细胞的多向分化特征。人脐带间充质干细胞可从多种组织中分离提取，如人的胎盘或脐带，分离较简便。人脐带间充质干细胞能够归巢至损伤组织并在受损组织中发挥抗炎功能，还具有分化潜能，在创伤修复、免疫治疗等研究领域应用前景广泛，可用于同种个体之间的细胞移植。
急性肺损伤：是由多种炎性因子参与的全身炎性反应。大量研究表明，急性肺损伤可损伤毛细血管内皮，肺泡毛细血破坏管屏障，使中性粒细胞产生白细胞介素1、白细胞介素8等促炎因子，这些炎症递质对于维持炎症反应起着重要作用，促炎因子和抗炎因子失衡是急性肺损伤发病的重要原因。

摘要
背景：研究发现，人脐带间充质干细胞可通过减轻炎症损害改善肺通气功能。
目的：观察人脐带间充质干细胞移植治疗急性肺损伤的效果。
方法：将30只SD大鼠随机分为3组，正常组不做任何处理；模型组、实验组通过向气管内滴注脂多糖建立急性肺损伤模型，成功造模1 h 后，实验组于气管内滴注第4代人脐带间充质干细胞悬液0.1 mL(含细胞1×10⁶)，正常组及模型组气管内滴注等量生理盐水。细胞移植后24 h，检测血清中白细胞介素1、白细胞介素8水平，苏木精-伊红染色观察大鼠肺组织病理改变，检测大鼠肺组织干湿质量比。
结果与结论：①与正常组比较，模型组白细胞介素1、白细胞介素8水平及肺组织干湿质量比显著升高(P < 0.05)；与模型组比较，实验组白细胞介素1、白细胞介素8水平及肺组织干湿质量比显著降低(P < 0.05)；②正常组肺泡腔结构清晰，肺泡间隔完整；模型组肺泡间隔明显增厚，肺毛细血管出现充血、水肿，肺毛细血管及肺泡腔可见大量炎性细胞浸润，部分肺泡内可见有富含蛋白质的水肿液，肺泡腔内广泛透明膜形成；实验组肺泡结构基本清晰，肺泡间隔较厚，肺间质内有红细胞及少量炎性细胞浸润漏出；③结果表明，人脐带间充质干细胞移植治疗急性肺损伤，可降低炎症因子水平、减轻肺损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6717-7092(陈进玲)

关键词: 干细胞, 移植, 人脐带间充质干细胞, 急性肺损伤, 治疗作用, 白细胞介素1, 白细胞介素8

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that human umbilical cord mesenchymal stem cells can improve pulmonary ventilation function by reducing inflammations.
OBJECTIVE: To observe the therapeutic effect of human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation on acute lung injury.
METHODS: Thirty Sprague-Dawley rats were randomized into normal group, model group and experimental group. Rats in the latter two groups were used to establish animal models of acute lung injury by intratracheal instillation of lipopolysaccharide. One hour after modeling, rats in the experimental group were intratracheally administered human umbilical cord mesenchymal stem cell suspension (0.1 mL, 1×10⁶ cells), and those in the other two groups were given normal saline in the same dose intratracheally. Twenty-four hours after treatment, the pathological changes of lung tissue were observed using hematoxylin-eosin staining; the wet and dry weight ratio of the lung tissue and the levels of serum interleukin-1 and interleukin-8 were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal group, the wet and dry weight ratio of the lung tissue and the levels of serum interleukin-1 and interleukin-8 were significantly increased in the model group (P < 0.05), while compared with the model group, these levels were significantly decreased in the experimental group (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining results showed clear alveolar space structure with complete alveolar septum in the normal group. In the model group, the alveolar septum was markedly thickened, and there was visible pulmonary capillary hyperemia, edema, as well as a large amount of inflammatory cell infiltrations in the pulmonary capillaries and alveolar space. Edema fluid rich in proteins was observed in a part of the pulmonary alveoli, and an extensive transparent membrane formed in the alveolar space. In the experimental group, the alveolar structure was clear, but the alveolar septum became thickened, and red blood cells and a small amount of infiltrated inflammatory cells were leaked from the pulmonary interstitial tissue. In conclusion, human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation for treatment of acute lung injury can reduce inflammatory factor levels and alleviate lung injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Acute Lung Injury, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈进玲，陈艳霞，张志勇. 人脐带间充质干细胞移植治疗急性肺损伤[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(50): 7536-7542.

Chen Jin-ling, Chen Yan-xia, Zhang Zhi-yong. Human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of acute lung injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(50): 7536-7542.

图/表（结果） 2

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引言

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)由感染、外伤或是物理伤害为主的原因引起，主要临床表现为呼吸困难的危重症^[1-6]。目前认为急性肺损伤是由多种炎性因子参与的全身炎性反应。大量研究表明，急性肺损伤可损伤毛细血管内皮，破坏肺泡毛细血管屏障，使中性粒细胞产生白细胞介素1、白细胞介素8等促炎因子，这些炎症递质对于维持炎症反应起着重要作用，促炎因子和抗炎因子失衡是急性肺损伤发病的重要原因^[7]。引起急性肺损伤的病因很多，包括氧中毒、感染中毒症、放射性损伤及重症肺炎等^[8]。文献表明，有关急性肺损伤的研究主要集中在相关炎症细胞、黏附因子的相互作用等方面^[9-10]。目前，急性肺损伤的治疗主要是氧疗、改善低氧血症、增强通气等，但这些也只是改善基本症状，还未从根本上解决问题，所以需要探索新的科学方法，从根本上解决这些难题^[11-12]。

人脐带间充质干细胞具有易分离培养、易传代、细胞数目多等优点，来源广泛，是干细胞家族成员之一，具有干细胞的多向分化特征^[13]。人脐带间充质干细胞可从多种组织中分离提取，如人的胎盘中或脐带，分离较简便^[14-16]。人脐带间充质干细胞来源广泛，能够归巢至损伤组织并在受损组织中发挥抗炎功能，还具有分化潜能，在创伤修复、免疫治疗等研究领域应用前景广泛，可用于同种个体之间的细胞移植^[17]。

近年来，实验研究结果发现，人脐带间充质干细胞可通过减轻炎症损害改善肺通气功能，为急性肺损伤治疗提供了新的思路^[18-20]。但有关人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠急性肺损伤的研究较少^[21]。因此，实验通过气管内滴注脂多糖制备大鼠急性肺损伤模型，进行人类脐带间充质干细胞滴注治疗，通过苏木精-伊红染色、湿/干质量比值及血清上清中炎症因子的表达水平，探讨人脐带间充质干细胞治疗大鼠急性肺损伤的机制。

材料方法

1.1 设计 随机分组对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年6至12月在河北医科大学附属唐山工人医院完成。

1.3 材料

脐带：由河北医科大学附属唐山工人医院的妇产科提供，产妇已签署知情同意书。

实验动物：清洁级3月龄雄性SD大鼠 30 只，体质量250-400 g，由河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003。实验动物饲养环境为SPF级环境。将30只大鼠随机分为正常组、模型组及实验组，每组10只。

主要试剂：FBS、胰酶、脂多糖(GIBCO公司)；胶原酶Ⅱ、DMEM 培养基(Hyclone公司)；鼠抗人CD44-APC 、鼠抗人 CD29-PE(BD公司)；多聚甲醛(上海化学试剂)；无水乙醇(南京化工厂)；青-链霉素混合液(广州生物科技有限公司)；谷氨酰胺(上海生物科技有限公司)；水合氯醛(南京化学试剂有限公司)；ELISA 试剂盒(白细胞介素1、白细胞介素8)、苏木精-伊红染色液(南京生物科技有限公司)；中性树胶 (上海生物工程有限公司)。

主要仪器：CO₂培养箱、高压灭菌锅(南京仪器厂)；倒置显微镜(日本NIKON公司)；超净工作台(上海有限公司)；流式细胞仪、离心机、纯水机(BD公司)；漩涡混匀振荡器(杭州仪器有限公司)；电热恒温水浴箱(苏州有限公司)；干燥箱 (南京有限公司)；低温冰箱(海尔公司)；电子天平(上海仪器公司)；组织切片机 (南京仪器有限公司)；超净工作台(上海空气技术有限公司)。

溶液配制：①PBS：将PBS粉末溶于2 000 mL超纯水中，用 HCl调节溶液的pH值为7.2，120 ℃高压灭菌50 min，4 ℃冰箱备用；②Ⅱ型胶原酶溶液：称取Ⅱ型胶原酶0.025 g，溶于2 mL PBS中，分装于5 mL离心管中，过滤后除菌，-20 ℃加锡箔纸避光保存；③0.25%胰蛋白酶：称胰蛋白酶粉 0.025 g，放入10 mL PBS中搅拌溶解，0.22 μm滤膜过滤，分装入50 mL EP中，置于-20 ℃保存备用；④DMEM培养基：倒入一袋 DMEM培养基粉末，搅拌溶解，加去离子水定容至1 000 mL，用0.22 μm滤膜过滤，分装至1个1 000 mL蓝盖瓶内，4 ℃冰箱保存；⑤脂多糖：将称量的0.1 g 脂多糖中加入到10 mL生理盐水中，搅拌混匀，分装至15 mL EP管中，0.22 μm滤膜过滤除菌，放于棕色瓶-20 ℃避光保存；⑥10%水合氯醛：称取1 g水合氯醛，加入10 mL ddH₂O，4 ℃避光保存。

1.4 实验方法

1.4.1 人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定

脐带标本的采集及处理：将胎儿段脐带放入广口瓶中，经PBS充分洗涤，剪碎，装入10 mL离心管中，加入Ⅱ型胶原酶2 mL，在恒温摇床上震动 50 min，再加入0.25%胰酶孵育50 min。加入培养基2 mL，80目细胞筛过滤到新的离心管中，去除未完全消化的团块。将过滤后的细胞悬液过滤到2个10 mL离心管中，3 000 r/min离心10 min，收集细胞，吸除上清。将细胞沉淀加入D-HANKS，3 000 r/min离心10 min，收集细胞，吸除上清。将细胞沉淀重悬于含有体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的 DMEM 培养基，移入到25 cm²细胞培养瓶内，放置于37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中过夜孵育，以后每隔几天换一次培养液。待细胞长至约70%密度时，加入2 mL的D-HANKS缓冲液清洗2次，用移液枪加入2 mL的胰酶消化，在倒置显微镜下观察贴壁细胞变圆时，加入3 mL完全培养基吹打贴壁细胞。将细胞混悬液移入到5 mL离心管中，1 500 r/min离心6 min，倒弃上清，加入2 mL培养液吹打细胞，按 1∶4比例传代到新的培养瓶中，选择第4代细胞用于后续实验。

人脐带间充质干细胞表面标志物测定：取第4代细胞，加入1 mL的0.25%胰蛋白酶消化2 min，1 500 r/min离心6 min，倒弃上清，加入3 mL PBS清洗2次，制成浓度为6.0×10⁸ L^-¹的细胞悬液；加入流式抗体(小鼠抗人PE 标记抗体CD73、CD90)，4 ℃避光孵育30 min。加入2 mL PBS清洗细胞；将细胞悬于600 μL PBS中，用于流式检测。

1.4.2 建立急性肺损伤模型及分组干预 高压灭菌实验器械，配置好0.5%戊巴比妥钠300 μL麻醉模型组、实验组大鼠，将大鼠仰卧固定在实验台上，剪去颈部皮毛，用乙醇消毒，纵向切开颈部皮肤，充分暴露气管，用注射器向心刺入气管内，将0.1 mL脂多糖(5 mg/kg)滴注于气管内，迅速使小鼠立位旋转，使药液在两肺中均匀分布，缝合切口，消毒。待小鼠清醒后，在SPF动物实验室喂养^[21]。造模后1 h，实验组经气管内滴注人脐带间充质干细胞混悬液0.1 mL(含细胞1×10⁶)，模型组滴注等量生理盐水，术后于SPF级实验室条件下饲养。

1.5 主要观察指标

血清上清中细胞因子测定：细胞移植后24 h，每组选5只大鼠，将大鼠放于操作台上，仰面固定好，乙醇消毒，沿大鼠腹部中线注射配制好的10%水合氯醛(280 mg/kg)将大鼠麻醉，操作台上放置好固定的大鼠，使其仰面向上，用剪刀剪开腹部皮肤，用纱布擦拭血液，用带采血管的针管抽取血液 5 mL，3 500 r/min离心15 min，离心后收集上清于放于5 mL EP管中，将样品保存于-80 ℃保存，用于后期检测大鼠血清上清中主要炎症因子水平，具体操作按照ELISA说明书进行：①标本采集：配制试剂，用PBS将抗体稀释至蛋白质的质量浓度为1-20 mg/L，在96孔的反应孔中加100 μL，4 ℃过夜。第2天，倒弃孔内的溶液，将5 mL浓缩液加入90 mL去离子水，定容至100 mL配制洗涤液。向粉末中加入1 mL的标准品稀释液，稀释成6个浓度配制标准品，用洗涤缓冲液洗3次/3 min；②加样：加经过PBS稀释过的待检样品100 µL于上述已包被的96孔板中，每孔加入100 µL。放于37 ℃孵育箱孵育90 min，洗涤6次，同时设置空白孔及PBS阴性对照孔；③加抗体：于96孔板中，加入用PBS稀释的酶标抗体100 µL，37 ℃孵育2 h，洗板6次。96孔板中每孔加入配好的生物素结合液100 µL，37 ℃反应 60 min，洗板6次。96孔板中每孔加入配制好的酶结合物工作液100 µL，37 ℃反应40 min；④显色：洗板6次，于96孔板中每孔加入配制好的的TMB底物溶液100 µL，避光显色，37 ℃孵育箱中孵育40 min；⑤加终止液：大体观察，当第一个标准品孔出现蓝色，于各反应孔中加入配好的终止液50 µL；⑥结果判读：结果显示：96孔内颜色越深，表示阳性程度越强，颜色浅或无色即为阴性。酶标仪检测各组450 nm处的A值；⑦计算：依据样品测出的A值算出相应的血清中炎性因子水平。

肺组织病理切片的制备：移植后24 h，血清取材后取右肺下叶，以100 g/L多聚甲醛固定，切片制作过程：①固定组织：取动物新鲜组织块，放入配好的体积分数10%甲醛固定液中；②浸蜡包埋：将已透明的组织块放于软蜡中，待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：倒入已溶化的石蜡，将组织浸入包埋盒中，冷却凝固；③切片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成4 μm厚的薄片，放到热水中展平，再黏到载玻片上，放65 ℃烘干箱中烘干；④脱蜡：从65 ℃烤箱中取出烤干的切片，放入二甲苯Ⅰ中脱蜡20 min，放入二甲苯Ⅱ中脱蜡20 min(夏季可以缩短时间，冬季可延长时间)。放入无水乙醇100%Ⅰ中，约3 min，放入无水乙醇100%Ⅱ，约3 min，放入体积分数90%乙醇中Ⅰ中约3 min，放入体积分数90%乙醇中Ⅱ中约3 min，放入体积分数80%乙醇Ⅰ中约3 min，放入体积分数80%乙醇Ⅱ中约3 min。放入体积分数70%乙醇中约3 min。放入水中，用流水冲洗约4 min，洗去乙醇。放入蒸馏水中清洗约3 min；⑤染色：放入苏木精染色液中，浸染细胞核1 s，在显微镜下观察细胞核蓝染。用流水冲洗2 min。放入1%盐酸乙醇中分化10 s，分化可使细胞核更加清晰(分化不足时，细胞核会染得过深；分化过度时，细胞核会染的太淡)。放入水中洗涤10 min。移入伊红染色液中染色2 min，如果染色慢，可在伊红液中加入冰醋酸。放入流水中冲洗伊红染液，用纱滤纸擦掉玻片上的染液；⑥脱水：将玻片放入体积分数80%乙醇Ⅰ中脱水约2 min，体积分数80%乙醇Ⅱ中脱水约2 min。放入体积分数90%乙醇中Ⅰ中脱水约3 min，放入体积分数90%乙醇Ⅱ中脱水约3 min。放入体积分数100%乙醇Ⅰ中3 min，放入体积分数100%乙醇Ⅱ中3 min。放入二甲苯Ⅰ中透明4 min，放入二甲苯Ⅱ中透明4 min；⑦封固：滴一滴中性树胶于组织片上，将盖玻片慢慢向下压在片上，慢慢压平，使盖玻片位于正中，放于玻片盒中。

肺湿/干质量比测定：移植后24 h，每组选5只大鼠，取大鼠右肺上叶，加入PBS冲洗组织，把每个肺组织放到一张滤纸上，然后和滤纸一起称湿质量，用滤纸吸干肺组织表面残留的水分，称取肺组织的质量为肺湿的质量。做好标记后放到烘箱烘干，质量不变后一起称干质量。最后都减去锡纸的质量。计算前后两次称的肺组织干湿质量之比，得出肺湿/干质量比值的变化。

1.6 统计学分析 数据采用SPSS 20.0软件处理，数据以x(_)±s表示，采用t 检验分析结果，以P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

讨论

3.1 脂多糖诱导大鼠急性肺损伤模型的建立 当急性肺损伤处于疾病早期，病情相对较轻，但是随着病情的发展，晚期形成呼吸性衰竭^[23-24]。如果在急性肺损伤早期阶段能进行有效干预，可提高临床疗效。通过制备急性肺损伤大鼠模型，探索研究如何有效治疗人急性肺损伤成为研究的重点。目前常用的急性肺损伤动物模型包括盲肠结扎/脓毒症型急性肺损伤模型、内毒素型急性肺损伤模型及缺血再灌注型等急性肺损伤模型^[25-29]。

大量研究表明，急性肺损伤由肺的直接或间接损伤引起，表现为呼吸功能不全，严重阶段可引起呼吸窘迫综合征^[30-31]。内毒素的主要成分是脂多糖，可诱导急性肺损伤模型，其诱导机制是：脂多糖直接损伤肺泡上皮细胞，造成肺组织水肿，这种损伤作用表现在中性粒细胞在肺泡内活化，释放多种炎症因子白细胞介素1、白细胞介素8，促进中性粒细胞升高，促进炎症反应，最终引起呼吸衰竭^[32-33]。脂多糖诱导急性肺损伤动物模型的发病机制与人类急性肺损伤疾病的病理生理过程相符，常用的脂多糖给药途径包括气管内滴注、静脉注射及腹腔注射^[34-35]。实验证明在滴注脂多糖后，通过滴注人脐带间充质干细胞明显降低了白细胞介素1、白细胞介素8的表达，减轻了肺水肿程度，减少了肺组织湿/干质量比值，减轻了炎症反应程度。采用脂多糖诱导急性肺损伤动物模型的原因是其方法简单，造模时间短，造模成功率高。治疗急性肺损伤的关键是促进抗炎与抑炎反应平衡。

3.2 人脐带间充质干细胞移植在急性肺损伤治疗中的作用 研究发现，间充质干细胞可用于改善病变的多种组织器官，其中人脐带间充质干细胞在肺部疾病治疗中具有重要作用^[36-37]。因此近年来，人脐带间充质干细胞在呼吸衰竭等呼吸系统疾病中的应用也日益成为国内外的研究热点。

人脐带间充质干细胞具有合成细胞因子的生物学功能，以支持造血干细胞、星形胶质细胞和少突状细胞等通过这些因子使机体炎性反应向抗炎反应转化，减轻炎症反应带来的损害^[38-39]。对急性肺损伤小鼠模型给予人脐带间充质干细胞治疗后，发现人脐带间充质干细胞能够减轻肺损伤病理学改变，降低促炎因子表达水平，增加抗炎因子的表达^[40]。间充质干细胞具有调节免疫细胞的功能，可减少促炎因子产生，减轻器官的损害。

实验结果显示，人脐带间充质干细胞可贴壁生长，呈均匀一致的长条形，排列整齐；阳性表达基质细胞及干细胞标记 CD44、CD29；经诱导可分化形成脂肪细胞和成骨细胞。人脐带间充质干细胞移植治疗急性肺损伤仍处于动物实验阶段，未来还有许多未知的难题等待人们研究。